转柽柳晚期胚胎富集蛋白基因烟草T_1代的耐盐性评价

目的:验证转柽柳晚期胚胎富集(LEA)蛋白基因烟草T1代的耐盐性。方法:采用盐胁迫方式,对转柽柳LEA蛋白基因烟草T1代的6个株系及非转基因对照烟草T1代进行不同浓度NaCl胁迫处理,分析了NaCl胁迫下转基因烟草的生长量、根系的发育及盐害程度。结果:各转基因烟草T1代组培苗在150mmol/L的NaCl培养基上根系生长良好,平均增重(鲜重)是非转基因对照的7.72倍,平均高生长是非转基因对照的3.51倍,盐害指数低于或等于50%;而非转基因对照烟草T1代组培苗生长缓慢,根系几乎不能生长发育,盐害指数达65%。结论:柽柳LEA蛋白基因的导入提高了T1代烟草的耐盐性。

转晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)基因棉花及抗旱性分析

本研究将紫杆柽柳(Tamarix and rossowii Litv)晚期胚胎发生丰富蛋白(LEADQ663481)基因导入新疆早熟棉新陆早18号,通过冬季海南加代、夏季新疆继代的方法获得T3代转基因棉花株系。从40株大田卡那霉素检测阳性植株中,经过PCR筛选证明3株为阳性的转化株。在室内条件下,对转化株幼苗进行水培实验,并用12%(w/v)PEG-6000处理12h模拟干旱胁迫。结果显示,干旱胁迫之后,转LEA基因棉花基因表达量显著增加;丙二醛生成量显著降低;游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的生成量显著增加;棉花表型分析也证明了转LEA基因棉花抗旱性有提高。培养45d后,转LEA基因棉花的生物量高于非转基因棉花。本研究结果表明,在干旱胁迫条件下,转LEA基因棉花表现出了优良的生长和生理优势,显示出转LEA基因棉花能提高棉花的抗旱能力。

巴西橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因的克隆及序列分析

根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3'-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbLEA14基因的全长cDNA序列,其ORF长456 bp,编码151个氨基酸,预测HbLEA14蛋白分子量为16.58 ku,等电点为5.10。同源性比对显示,HbLEA14与蓖麻RcLEA14、乳浆大戟EeLEA14、陆地棉GhLEA14、大豆GmLEA14、拟南芥AtLEA14、番茄SlER5的同源性分别为88%、80%、75%、73%、65%和61%,属于非典型第2组LEA蛋白。RT-PCR结果显示,死皮植株胶乳中HbLEA14的表达量明显高于健康树。

丹参晚期胚胎蛋白基因SmLEA的克隆及表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,发现一条序列与晚期胚胎丰富蛋白(late embryogenesis abundant)基因有较高的相似性,在此基础上设计引物,分别从cDNA和gDNA水平克隆到该基因的全长(Genbank注册号:AY725206),命名为SmLEA。该序列全长739 bp,无内含子,包含1个长为495 bp的开放阅读框,编码164个氨基酸。序列比对结果显示,该序列与番茄的晚期胚胎丰富蛋白Lemmi9有较高的相似性(69%),推测该编码蛋白属于晚期胚胎蛋白LEA14家族成员。生物信息学显示,SmLEA所编码蛋白SmLEA的相对分子质量为17.34 kD,理论等电点为4.51,富含天冬氨酸及AS、IP、KV、VS、TIP肽段,定位于细胞质中,为稳定类蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达,为组成型表达基因。

海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因SpLea5的克隆与表达分析

根据筛选文库时获得的EST序列信息,利用RACE技术从海马齿根中分离获得了一个海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因的全长cDNA,命名为SpLea5。序列分析结果表明,SpLea5基因cDNA全长685 bp,含有一个294 bp的完整开放阅读框,编码97个氨基酸残基;推测编码的氨基酸序列与柽柳、杨木樨、烟草、甜橙、温州蜜柑、麻风树和陆地棉中相应基因的氨基酸序列一致性为54%、52%、48%、47%、47%、46%、44%、41%,在聚类分析时与高等植物聚为一类。SpLea5在海马齿植株中呈组成型表达,但根中表达最为丰富,茎和叶次之;海水、NaCl、PEG、ABA处理均能够诱导根部SpLea5基因的表达。这些结果表明,SpLea5基因可能参与了海马齿对盐和干旱胁迫的分子响应。

莲种胚发育过程中胚胎晚期丰度蛋白基因表达量与种子含水量相关性分析

通过莲胚形态观察、生理指标测定、蛋白质谱鉴定与基因表达量分析,筛选出莲胚脱水成熟过程中显著富集的LEA蛋白(late embriogenesis abundant protein),并分析其基因表达量与含水量的相关性。结果表明,莲胚发育成熟共需约30 d,形态发育15~18 d,随后进入脱水成熟阶段。在种胚脱水阶段种胚含水量由80%下降到6.7%,细胞内蛋白含量上升2.75倍。对不同脱水阶段莲胚进行蛋白单向电泳,筛选出7条显著富集的蛋白条带,其中包含7种LEA家族蛋白:EMB564-like、Dehydrin Rab18、Lea14-A与4种D-34类蛋白。Dehydrin Rab18、D-34、D-34-like-1表达量随莲胚脱水而递增,与种子含水量呈负相关;EMB564-like、Lea14-A、D-34-like-2、D-34-like-3基因表达水平呈单峰曲线,在莲胚发育20 d时达到峰值。其中Dehydrin Rab18、EMB564-like与D-34-like-2在莲胚脱水阶段上调表达幅度最大,表达量分别是莲胚脱水前的38.7、11.5、19.0倍,可能与莲胚的逆境保护与耐储存机制相关。

丹参晚期胚胎富集蛋白基因的克隆及表达模式分析

目的克隆丹参晚期胚胎富集蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法对丹参转录组数据库进行BLAST同源性比对,发现一条新的与LEA基因家族同源性较高的序列,命名为Sm LEA2,Gen Bank登录号为HQ676610。进一步利用PCR和RT-PCR技术从丹参g DNA以及c DNA水平克隆得到了Sm LEA2基因全长。采用软件分析蛋白质结构性质和系统进化关系。利用实时荧光定量PCR的方法对不同部位、不同发育时期以及不同处理丹参的Sm LEA2表达量进行检测。结果获得Sm LEA2 g DNA长1 961 bp,由1个外显子和1个内含子组成,并且内含子位于ATG的上游;开放阅读框长为960 bp,共编码319个氨基酸。生物信息学分析显示,Sm LEA2是存在于细胞质中的亲水蛋白,无跨膜结构域和信号肽,其相对分子质量为35 340,等电点为4.77。该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达,并且在茎中的表达量最高。随着花的成熟和种子的发育,该基因表达量逐渐升高,并且该基因的表达受茉莉酸甲酯(Me JA)以及脱落酸(ABA)的诱导作用影响。结论克隆得到的丹参Sm LEA2可能参与种子发育过程,并在丹参防御反应中发挥作用。

自然生境下芦苇细胞中的未折叠蛋白反应

晚期胚胎富集蛋白(LEA蛋白)在芦苇中广泛存在,是影响芦苇抗逆的一种重要的功能蛋白。文章分析了LEA基因在不同自然生境下芦苇中的表达差异,并利用RT-PCR方法探究了LEA基因对于芦苇品种化鉴定的适用性。

胚胎晚期富集蛋白与生物的干旱胁迫耐受性

胚胎晚期富集蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是参与生物体抵抗干旱胁迫的一类重要蛋白。LEA蛋白可分为7组。大多数LEA蛋白具有亲水性及热稳定性。LEA蛋白在水溶液中通常为无折叠状态,但脱水胁迫可诱导其转变为α-螺旋。近年来关于LEA蛋白的研究取得了较多进展。研究结果表明LEA蛋白可定位于细胞内的多种细胞器中,且LEA蛋白可能具有多重保护作用,如保护蛋白质及酶活性、或保护细胞的膜结构、或具有抗氧化作用、结合离子或保护DNA等。以下主要介绍了LEA蛋白的功能、二级结构及保护作用机制。

紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表达分析及遗传转化

胚胎晚期富集蛋白(LEA)广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。本研究利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆了一个LEA4类基因的开放阅读框(ORF),命名为Ms LEA4-4。该基因编码512个氨基酸,结构分析显示MsLEA4-4包含5个重复的由11个氨基酸TAQAAKEKTQQ组成的序列特征。利用实时荧光定量PCR检测了Ms LEA4-4在不同逆境下的表达量,结果显示,该基因受干旱、NaCl、Cu^(2+)、Zn^(2+)和外源ABA诱导表达上调,其中Na Cl胁迫2h、Cu2+和Zn2+胁迫8 h,Ms LEA4-4基因表达量最高;冷胁迫和干旱胁迫下,该基因的表达量随处理时间的延长呈逐渐上升趋势,表明该基因可能参与了紫花苜蓿的抗逆性调控。构建植物超表达载体p CAMBIA3301-Ms LEA4-4,采用农杆菌介导法侵染拟南芥花序,通过草铵膦(PPT)筛选和分子检测,7株抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入拟南芥基因组中。本研究为进一步探索Ms LEA4-4基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。

蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因CpLEA的克隆及表达分析

从蜡梅(Chimonanthus praecox)花cDNA文库中获得了1个胚胎晚期丰富蛋白(LEA)基因的cDNA全长序列,命名为CpLEA(GenBank登录号:JF412788),该基因cDNA含有一个273 bp编码91个氨基酸的开放阅读框,从蜡梅基因组DNA中扩增该基因发现,该基因含有两个大小分别为35 bp和707 bp的内含子。生物信息学分析显示,CpLEA的编码蛋白含有4个胚胎晚期丰富蛋白第3族LEA蛋白特有的11个氨基酸的基元重复序列,进化树分析表明该编码蛋白与榛子的LEA蛋白亲缘关系最近。通过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在蜡梅成熟种子中表达量最高,在根中几乎不表达;在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高;在花发育早期表达量较高,随后下降并保持相对稳定,在衰败期突增并达到最高;检测该基因在脱落酸(ABA 50μmol·L-1)、低温(4℃)、高温(42℃)、干旱(30%PEG6000)和高盐(NaCl 1 mol·L-1)5种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明,该基因能够被ABA、低温、高温、PEG和NaCl诱导表达,并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明CpLEA可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中发挥作用。

大豆Em(LEA1)蛋白保守结构域的结构和聚集特性

采用圆二色谱(CD)和核磁共振波谱(NMR)方法研究了大豆Em(LEA1)蛋白保守基序Em-C和Em-2M多肽在不同环境中的结构及聚集行为。研究表明,在水和DMPG溶液中,两种多肽主要以无规结构形式存在。在50%TFE溶液中,Em-C多肽折叠结构增加,含疏水残基的部分区域可能形成α-螺旋结构,且分子以二聚体形式存在;而Em-2M则以单体形式存在,且有序结构较少。以上结果表明,环境变化可能导致两种多肽的空间结构和聚集行为改变,这有助于理解Em蛋白在不同环境中的结构特点,及其重要区域在全长蛋白中所起的作用。

转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

该研究在实验室前期研究的基础上,将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥,并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系,比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率,以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现:(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下,转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型,随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加,各株系萌发率均降低,但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系,并且在200mmol/L NaCl和400mmol/L甘露醇处理下,过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下,CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明,柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。

植物低温诱导基因及其产物的生物学功能

植物在适应低温胁迫的过程中,体内将会发生一系列生理生化反应,多种基因得以诱导表达,这些基因的表达在时空上是有序发生的,并相互联系形成了低温应答的分子机制。为促进我国桑树抗寒分子育种的研究,结合植物的抗冻特性和桑树低温胁迫反应,对植物的3种主要低温诱导蛋白(抗冻蛋白、胚胎后期富集蛋白和转录因子)的研究进展进行了综述,并以此阐述了植物抗寒抗冻特性和植物低温应答的分子机制。

天麻晚期胚胎富集蛋白表达与抗寒性研究

目的研究天麻晚期胚胎富集蛋白(LEA2)与抗寒性的关系。方法根据天麻种子转录组测序结果,得到天麻晚期胚胎富集蛋白基因序列,获得重组质粒后导入大肠杆菌进行低温实验。结果获得两条天麻LEA2基因c DNA序列。GeLEA2-1和GeLEA2-2全长分别为477和942 bp,编码158和313个氨基酸,其编码蛋白理论相对分子质量为17.30×103和34.85×103。系统发育分析显示,天麻LEA2基因分别与拟南芥和水稻LEA2基因具有较高相似性。此外,天麻LEA2基因与已知的多种植物的LEA2蛋白具有相似的功能结构域。低温实验显示,与对照组相比,含有GeLEA2重组质粒的大肠杆菌的抗寒性较差。结论推测天麻LEA2为抗寒相关的负向调节基因。

水稻干尖线虫Ab-lea基因在高渗透压下的表达

【目的】水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)在侵染寄主以前,能够以变渗隐生状态在土壤和种子中的高渗透压环境下长期存活,使防治该线虫极为困难。通常,非生物胁迫下,胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)的基因表达量会显著上调。作为逆境表达蛋白,LEA能在逆境下保护生物。为探究水稻干尖线虫LEA编码基因(Ab-lea)在高渗透压胁迫下的表达模式及功能,【方法】根据转录组数据克隆到Ab-lea。以无机溶剂饱和Mg SO4·7H2O溶液为高渗透压胁迫剂,对水稻干尖线虫进行高渗透压胁迫,240 min后该线虫进入变渗隐生。通过RT-PCR验证Ab-lea在线虫进入变渗隐生及维持变渗隐生过程中的表达特性。使用RNAi技术,探究该线虫Ab-lea沉默后,高渗透压胁迫下存活率变化。【结果】RT-PCR结果表明,Ab-lea在进入变渗隐生前期及维持变渗隐生过程中表达量上调。Ab-lea沉默后,水稻干尖线虫在进入变渗隐生后存活率显著下降。【结论】表明该基因可能参与调控水稻干尖线虫变渗隐生。本研究为进一步探究该线虫抗高渗透压胁迫的生理机制奠定基础,为防治该线虫提供新思路。

应用荧光光谱法研究植物LEA3蛋白11-氨基酸基序的保护功能

胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant,LEA)是增强生物抵抗干旱、低温和盐渍等多种胁迫的重要功能蛋白,但其保护机理仍不清楚。本文利用紫外光谱法证实,含多拷贝11-氨基酸基序的多肽(如PM2D和PM2E)可较好的保护经冻融的乳酸脱氢酶(LDH)活性。进一步通过荧光光谱法证实,含多拷贝11-氨基酸基序的多肽可通过多位点协同结合模式,稳定LDH酶的结构。而含低拷贝11-氨基酸基序的多肽(如PM2F和PM2G)与LDH酶只有一种结合位点,二者的结合强度较弱,因而不能表现出对LDH酶活性的保护作用。此外,含多拷贝11-氨基酸的多肽与海藻糖在保护LDH酶活性上存在协同作用,且二者有着不同的保护机理。

转MsLEA4-4基因拟南芥株系的耐盐性分析

为了深入研究紫花苜蓿(Medicago sativa)MsLEA4-4基因的抗逆性,本试验对前期获得的转MsLEA4-4基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)株系进行不同浓度盐胁迫处理,以验证MsLEA4-4基因在拟南芥植株体内的耐盐性。试验结果表明:盐胁迫后转基因株系的发芽率达到55%,比对照植株(Control plant,CK)高81%;转基因株系的鲜重、叶绿素含量均高于CK(P<0.05);盐胁迫后转基因株系的存活率比CK提高75.0%~81.3%;盐胁迫明显抑制根系生长,但转基因植株的侧根数量比CK多4~5根(P<0.05);盐胁迫后转基因株系体内的可溶性糖含量(P<0.05)和超氧化物歧化酶(P<0.01),过氧化氢酶(P<0.01),过氧化物酶(P<0.05)活性均高于CK,脯氨酸(P<0.01)和丙二醛(P<0.05)含量均低于CK。综上可得,MsLEA4-4基因参与了拟南芥体内的耐盐性调控,提高了转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。本研究为进一步探索MsLEA4-4在转基因紫花苜蓿盐胁迫中的功能及培育耐盐性紫花苜蓿品种提供依据。

转紫花苜蓿MsLEA2基因提高拟南芥耐铝毒性研究

MsLEA2基因是从紫花苜蓿中克隆到的胚胎晚期富集蛋白基因,属于LEA_2家族。以转基因拟南芥T_3代植株的3个株系为材料,从表型、生理和分子生物学三个方面研究铝胁迫下转MsLEA2基因拟南芥的耐铝毒性能。结果表明:铝胁迫下转基因株系的脯氨酸含量高于对照(野生型),丙二醛含量和电导率则低于对照且差异显著(P<0.05),CAT、POD和SOD活性显著高于对照。初步证明转MsLEA2基因拟南芥的耐铝毒性能明显高于对照,紫花苜蓿的MsLEA2基因具有提高植物耐铝毒胁迫的能力。

大豆PM1蛋白对脂质体及兔红细胞的稳定作用

利用浊度法、粒径法和相差显微镜技术研究反复冻融条件下大豆PM1蛋白(属于第4组胚胎晚期富集蛋白)对1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,POPC)脂质体的保护作用.结果发现,与未经冻融处理的POPC样品相比,经冻融胁迫POPC脂质体浊度升高、粒径增大,在Gm PM1存在时,经冻融的POPC脂质体浊度和粒径增大程度明显降低,脂质体聚集物明显减少.在冻融条件下,Gm PM1蛋白对兔血红细胞有明显保护作用.在低温胁迫中,Gm PM1可能通过稳定细胞膜的磷脂起到保护细胞膜的作用.