可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接,插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒,构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg,另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体,用以转化农杆菌菌株,再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选,用特异PCR扩增和Southern杂交检测,从分化再生的T0代植株中,鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前,正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定,培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。

选择标记可去除的植物高效表达载体的构建

在常用的植物组成型表达载体pBI121的选择标记基因NPTII两侧插入同向的lox位点并用多克隆位点(MCS)取代了GUS基因序列,构建了NPTII基因可被去除的和可插入目的基因的通用植物表达载体pBI121-lox-MCS。替换pBI121-lox-MCS中驱动目的基因表达的35S启动子,可构建成一系列具有其他表达特性的植物表达载体,如本文描述的韧皮部特异表达载体pBdENP-lox-MCS。为方便地筛选去除选择标记基因的转基因植物,还构建了绿色荧光蛋白(GFP)表达框与NPTII表达框连锁的pBI121-gfp-lox-MCS载体。上述植物表达载体可广泛应用于培育选择标记可去除的转基因植物。

单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统的构建

来自于啤酒酵母2μm质粒的FLP/frt位点特异性重组系统可用于转基因植物(细胞)筛选完成后去除选择标记基因.水稻肌动蛋白actin基因启动子和玉米泛素ubiquitin基因启动子可有效驱动单子叶植物中外源基因的转录.为培育去除选择标记基因的抗盐耐旱单子叶转基因植物,构建了适合于单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统.该系统由含有FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-FLP-bar和含有frt位点的植物双抗(抗除草剂、抗盐耐旱)表达载体pCAMBIA1300-Ubi-TsPPasef-rt-alsf-rtm以及pCAMBIA1300-Actin1-AtNHX1f-rt-alsf-rtm组成.

猪β防御素-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建标记基因可去除的β防御素-1(pBD-1)基因乳腺特异性表达载体,利用RT-PCR方法从猪脾脏中克隆获得pBD-1基因,再插入乳腺特异性表达骨架载体pBC1-neo中;经PCR、酶切电泳以及测序鉴定,确认成功构建出乳腺特异性表达pBD-1的载体。进一步将上述功能片段亚克隆至能将标记基因全部去除的骨架载体MCS-3s-loxP-GFP中,成功构建了一种筛选标记可全部去除的乳腺特异性3s-loxP-GFP-pBC1-pBD1转基因载体。该载体为研究pBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机制,以及创制乳腺高效表达pBD-1的转基因猪育种新材料和通过哺乳以提高新生仔猪抗病力奠定了基础。

fat-1基因脂肪组织特异性表达载体的构建及其山羊转基因细胞系的建立

旨在构建一种筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的载体,将其转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定整合fat-1基因的转基因细胞系。首先将人工合成的fat-1基因连接至L28-Wnt10b载体(1种带有小鼠脂肪组织特异性启动子Fabp4的载体)上,构建成fat-1基因脂肪组织特异性表达载体L28-fat1;同时经多次克隆构建成1种筛选标记可全部去除的骨架载体MCS-3s-LoxP-RFP;然后,利用Hind III和Not I对上述2种载体进行双酶切,接着进行连接,构建出筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的表达载体。采用脂质体介导的方法转染山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选转基因细胞。酶切鉴定及PCR检测结果表明,成功构建了3s-LoxP-RFP-FABP4-fat1表达载体,并首次获得了脂肪组织特异性表达fat-1基因的山羊胎儿成纤维转基因细胞系,为将来通过体细胞核移植创制脂肪组织特异表达fat-1基因的优质肉用转基因山羊新材料奠定了基础。

植物营养成分对慢性疾病的影响评估——转基因技术面临的挑战

减少慢性疾病是二十一世纪社会面临的最紧迫的挑战。本文回顾了植物性营养成分可以防止或减少主要慢性疾病发生风险的一些证据和作用机制,尤其是在识别和理解食品对健康的促进成分,转基因技术是解决这一重大问题的重要植物育种工具。同时倡导科学地研究植物,确保膳食推荐的合理性和准确性,以减少慢性疾病所带来的经济负担。转基因技术应用于农业和食品工业,产生了转基因食品。为了更好地造福人类,我国制订的法规和条例为转基因生物提供了安全性和营养性的有力保障;相应的转基因食品检测方法是转基因的安全评价及监督监管的技术保障。近年来,出现了有关去除选择性标记基因的新策略,本文也介绍了去除选择性标记基因的未来研究方向和植物科学的未来需要,因此,对促进人们接受转基因农作物将起到积极因素。

抗水稻条纹病毒安全表达载体的构建及遗传转化

构建了水稻条纹病毒(RSV)外壳蛋白(CP)基因RNAi载体pCMBIA1301+/-R,该载体在理论上可以获得无标记基因的转基因后代植株。在双菌双质粒体系中,比较了不同品种、重组农杆菌浓度配比对遗传转化效率的影响。结果表明:改进的转化体系最适合品种‘爱知旭’的转化,共转化效率达9.07%;推广品种‘武育粳3号’上也转化成功获得了转基因阳性植株(6.59%)。以‘爱知旭’为受体转化时,重组农杆菌E13R和E1301浓度比为3∶1时,共转化率最高(16.33%),其次分别是2∶1(13.56%)、1∶1(9.09%),以1∶2时最低(5.97%)。通过T1代自交分离和抗病性筛选,成功获得了无选择标记基因的转基因抗病毒植株16株,为抗RSV转基因水稻的安全释放奠定了基础。

无选择标记技术与转基因植物食品安全性

转基因技术已被公认为提高农作物产量、改良农产品品质的革命性技术。转基因食品已越来越多地进入人们的日常生活。目前植物转基因操作中广泛使用选择标记基因,如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子。虽然尚无研究表明选择标记基因会影响人类健康,但近年来人们对转基因植物安全性问题的担心日益严重。为了消除公众对选择标记基因引起的转基因植物安全性的顾虑以及向已转化的植物中重复叠加外源基因等问题,无选择标记技术应运而生。这种全新的安全性转基因技术有巨大的应用潜力。本文对6种主要的无标记转基因技术及其在转基因植物食品安全性控制领域的应用做一综述。