应用划痕标记染料示踪技术检测草苁蓉甲醇提取物对大鼠肝癌细胞功能的影响

目的：通过划痕标记染料示踪实验,初步筛选出对大鼠肝癌细胞G JIC功能有较强恢复和促进作用的草苁蓉甲醇提取物药物终浓度。方法：大鼠肝癌细胞随机分为5个组：分别为1个对照组、4个实验组。4个实验组加入草苁蓉甲醇提取物药物终浓度分别达到0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L。结果：大鼠肝癌细胞经草苁蓉甲醇提取物（BR）0.75g/L、1.0g/L作用48h后的细胞中,荧光染料出现在划痕的附近细胞内至划痕以外的5~6列甚至7~8列细胞内,半定量为（）,形成连片状的荧光染色,荧光亮度明显增加,细胞间染料传输功能显著增强。结论：通过划痕标记染料示踪实验,初步筛选出草苁蓉甲醇提取物0.75、1.0g/L对细胞G JIC功能有较强恢复和促进作用。

荧光标记染料

荧光标记染料在生命科学领域具有极大的应用前景 ,基因芯片的研究开发使荧光染料应用于药理研究、药物毒性、药物靶标研究、医学诊断等领域。本文对荧光素、若丹明、菁染料等核酸及蛋白质分析检测用荧光标记染料的结构。

噻唑橙类菁染料与生物大分子结合的光谱特性的研究

研究了两个噻唑橙类菁染料TO 1和TO 2与核酸、蛋白质结合的光谱特性 .发现染料喹啉环中氮上取代基对染料标记生物大分子的荧光特性有着很大的影响 .羧基的引入 ,使染料TO 2与核酸结合后的荧光性能下降 ,但同时也提高了它与蛋白质结合的光物理性能 .研究表明 :在喹啉环氮上引入适当的亲水性取代基 ,可以使噻唑橙类菁染料的应用范围拓展到蛋白质标记领域 .并初步研究了蛋白质浓度的变化对染料TO 2的荧光光谱的影响以及TO

荧光标记技术在增殖放流中的应用现状

标志技术是用来区分不同个体或种群的常用方法。自Petersen等[1]利用标志方法估算封闭水体中鱼类的利用率及种群大小后,标志技术在渔业和水产养殖研究中得到广泛的发展和应用,标记技术也不断更新。荧光标记技术是渔业和水产养殖研究中常用标志技术手段之一,其通过特定技术方法在标志对象上形成荧光标记进而通过肉眼或借助仪器发现该标记，主要有将荧光物质注入水生生物皮下形成荧光标记和应用荧光染料在水生生物钙质和骨质结构上形成荧光标记两种技术方法。

线粒体荧光标记的单颗粒水平高通量评估方法

线粒体是真核细胞能量代谢和信号转导的调控中枢,虽然各种灵敏、特异的线粒体荧光标记技术已经被广泛应用于线粒体研究,但仍缺乏单线粒体水平的荧光染色性能评估方法。基于超高灵敏流式检测技术(High sensitivity flow cytometry,HSFCM)能对单个线粒体进行高灵敏、高通量、多参数定量分析的独特优势,本研究发展了一种单线粒体水平的荧光标记高通量评估方法。将携带靶向线粒体绿色荧光蛋白基因的p Ac GFP1-Mito质粒转染至人宫颈癌He La细胞中,用G418筛选出稳定转染细胞,分别从瞬时转染和稳定转染的细胞中提取线粒体。此外,从未转染质粒的正常He La细胞中提取线粒体,分别进行Mito Tracker Green标记以及SYTO 62线粒体DNA染色,应用实验室自行研制的超高灵敏流式检测装置在单线粒体水平对这4种线粒体标记方法的荧光亮度、标记效率和稳定性进行评估。实验结果表明,稳定转染细胞中单个线粒体的绿色荧光蛋白(GFP)荧光亮度为瞬时转染的17.7倍,比Mito Tracker Green标记的线粒体亮度高约两个数量级,且标记稳定性好。本研究为线粒体标记方法的选择提供了一种先进的分析方法。

微流控芯片-激光诱导荧光检测器的研制及核酸片段分离检测中应用

采用自行设计的共焦式激光诱导荧光检测器(激发波长635nm,发射波长670nm),以cy5染料对检测器的空间分辨能力和灵敏度进行了测试,检出限达到10-9mol/L。建立了一种微流控芯片快速分离检测DNA片段的方法。以0.8%羟丙基甲基纤维素(HPMC)为筛分介质,以(噻唑橙单体)To-pro-3为荧光标记染料,在玻璃微流控芯片中实现了dsDNA片段的无胶筛分和激光诱导荧光检测,12条DNA片段在75s内得到分离。

缺血再灌注后心肌细胞缝隙连接通讯改变与其凋亡及坏死的关系

目的:了解不同缺血再灌注时间心肌细胞缝隙连接通讯改变情况,分析心肌细胞缝隙连接通讯与心肌细胞坏死、凋亡的关系以及卡维地洛、庚醇的干预作用。方法:实验于2004-10/2005-03在中日友好医院临床研究所完成。取培育7d心肌细胞缺氧30min后换用正常含糖的DMEM培养基培养1,2,3,6h,造成再给氧损伤。给药方案:分为三组;未用药组,庚醇组,卡维地洛组。庚醇用DMEM(含5%的小牛血清)配成1,2mmol/L的浓度,卡维地洛配成0.001g/L的浓度,分别加入药物于受试细胞,培养细胞30min后再做相关实验。未用药组不加药。采用细胞划痕技术,在倒置荧光显微镜下直观地观察不同组别、缺氧再灌注不同时间罗氏黄经过缝隙连接流通情况。利用流式细胞仪观察缺氧再灌注不同时间细胞凋亡情况。结果:①在缺氧30min时心肌缝隙连接通讯明显下降,荧光仅传至划痕附近第二列细胞,正常细胞荧光则传至四列以外的细胞。再供氧1h时恢复到第三列,以后逐步恢复到正常。运用庚醇后传导明显减慢荧光仅传至第二列细胞,缺氧和再供氧时传导也无明显变化。运用卡维地洛后传导改变不明显。②正常和缺血30min时凋亡指数差异无显著性(P>0.05),再供氧1h凋亡指数为27.4%,与正常相比差异显著(P<0.01)。坏死的心肌细胞在再供氧2h后差异有显著性(P<0.01)。运用卡维地洛、庚醇后凋亡指数在再灌注1h时分别较未用药组减少了55.11%,21.53%。③培养7d的心肌细胞搏动频率为(120±18)次/min,缺氧30min时,搏动减弱,次数为(56±16)次/min,再供氧1h时,搏动次数为(118±22)次/min,两者差异显著(P<0.01)。加入浓度为2mmol/L的庚醇后,心肌细胞搏动明显减弱,约为(64±20)次/min,差异显著(P<0.001)。加入0.001g/L卡维地洛搏动次数也有不同程度的减低(P<0.05)。在缺氧再灌注过程中,两个干预组搏动次数变化不大。结论:心肌细胞在缺氧时缝隙连接通透性减低,庚醇、卡维地洛也有不同程度的降低缝隙连接通讯的作用。庚醇、卡维地洛通过改变缝隙连接通讯以及其他方面的作用来减少心肌细胞的死亡和凋亡。

缺氧再复氧对心肌细胞缝隙连接通信影响的研究

目的研究不同缺氧再复氧时间心肌细胞缝隙连接(Gap junction,GJ)通信改变情况,以及庚醇(Heptanol,HT)对GJ通信的影响。方法利用荧光染料Lucifer yellow CH(LY)不能透过细胞膜,但可以经过细胞GJ在细胞间进行传递的特点,采用细胞划痕技术,在倒置荧光显微镜下直观地观察不同组别、缺氧再灌注不同时间LY经过GJ流通情况,及HT干预后GJ通信改变情况。结果在缺氧30min时心肌GJ通信明显下降,荧光仅传至划痕附近第二列细胞,正常细胞荧光则传至四列以外的细胞。再供氧1h时恢复到第三列,以后逐步恢复到正常。运用HT后传导明显减慢荧光仅传至第二列细胞,缺氧和再供氧时传导也无明显变化。培养7d的心肌细胞搏动频率为(120±18)次/min,缺氧30min时,搏动减弱,次数为(56±16)次/min,再供氧1h时,搏动次数为(118±22)次/min,两者差异显著(P(0.01)。当运用HT后心肌细胞搏动明显减弱,约为(64±20)次/min,差异显著(P(0.001)。在缺氧再灌注过程中,HT搏动次数变化不大。结论心肌细胞在缺氧时GJ通透性减低,HT也有不同程度的降低GJ通信的作用。

人溶菌酶活性两种检测方法的比较研究

为了比较琼脂平板扩散法和RBB-R染料标记比色法测定溶菌酶活性的灵敏度和可重复性,分别以人溶菌酶标准品建立标准曲线,用两种方法对不同稀释倍数的人溶菌酶进行5次重复测定,并分析测定结果的标准差、变异系数和误差率。结果表明:两种方法测定溶菌酶的灵敏度分别为1.5和0.5μg·mL-1,RBB-R染料法标准差、变异系数、误差率均小于琼脂平板扩散法。用RBB-R染料标记比色法测定的正常鸡蛋清中溶菌酶含量为2.84-4.19mg·mL-1,与报道的相符,说明RBB-R染料标记比色法具有操作简便、定量准确和重复性好等优点,适合大批样品及微量样品的检测。

大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏的GJIC功能和意义

目的:研究大鼠肝卵圆细胞(HOC)增殖模型肝脏缝隙连接蛋白32,43(CX)的表达及缝隙连接细胞间通讯(GJIC)的功能,探讨HOC增殖的可能机制.方法:健康(?)Wistar大鼠,随机分成正常对照组(n=6),模型组.模型组大鼠按每天20 mg/kg剂量灌喂2-AFF,连续4 d,第5天不灌喂行2/3肝切除,术后次日按每天20 mg/kg剂量继续灌喂5 d(2-AFF/PH).模型组在术后4h,4,8,12和16d随机取6只大鼠检测.采用组织病理技术观察肝组织的形态学变化;免疫组化和细胞形态学方法计数HOC;切开标记/染料示踪技术(incision loading/dye transfer,IL/DT)技术确定GJIC;免疫组化及RT-PCR技术检测CX32蛋白及mRNA表达;免疫组化、Western blot及RT-PCR技术分析CX43蛋白及mRNA水平.结果:对照组及模型组4 h未见HOC增殖.模型组4d汇管区有HOC增殖反应,8d HOC增殖达峰值,12d HOC从汇管区向肝实质内浸润,16d HOC增殖减少较12 d减少;IL/DT检测结果显示,模型组各时点(4h,4,8,12和16d)染料扩散距离低于对照组(84.5±3.4,60.6±3.3,108.6±4.2,150.6±2.6,199.6±3.7μm vs 250.0±5.0 um,P<0.01),GJIC功能降低.模型组各时点CX32表达均低于对照组(P<0.05),在4 h下调,4d达低峰(2.85±0.39),8d后逐渐恢复;RT-PCR显示模型组CX32 mRNA在4h开始下降,4d达低峰(0.33±0.11),8 d后逐渐恢复,16 d高于对照组,但无显著差异(P>0.05).Western blot结果显示模型组CX43蛋白表达在4 h上调(P>0.05)、4-16 d明显升高;RT-PCR显示模型组4h CX43 mRNA上调(P>0.05),4 d表达明显升高,12 d达高峰(5.46±0.58),16 d低于对照组,但无显著差异(P>0.05).结论:采用Solt-Farber方法成功建立了HOC增殖动物模型;大鼠2-AAF/PH肝脏CX表达呈时空特异性变化,使肝脏GJIC功能抑制.肝脏的GJIC抑制可能启动了HOC增殖.

肝脏GJIC对大鼠体内肝卵圆细胞增殖的影响

目的:研究肝脏缝隙连接细胞间通讯(GJIC)对大鼠体内肝卵圆细胞(HOC)增殖的影响.方法:健康♂Wistar大鼠,随机分成对照组(n=6)、模型组、苯巴比妥(Phenobarbital,PB)组.模型组大鼠按每天20 mg/kg剂量灌喂2-AFF,连续4 d,第5天不灌喂行2/3肝切除,术后次日按每天20 mg/kg剂量继续灌喂5 d (2-AFF/PH);PB组予以0.8 g/L PB饮水7 d,第8天按模型组处理,0.8 g/L PB饮水持续至实验结束.模型组、PB组在术后4 h,4,8,12和16 d随机取6只大鼠检测.采用组织病理技术观察肝组织的形态学变化;免疫组化和细胞形态学方法计数HOC;切开标记/染料示踪技术(incision loading/dye transfer,IL/DT)技术确定GJIC:免疫组化及RT-PCR技术检测CX32蛋白及mRNA表达:免疫组化、Western blot及RT-PCR技术分析CX43蛋白及mRNA水平.结果:对照组及模型组和PB组4 h未见HOC增殖.模型组4 d汇管区有HOC增殖反应,8 d HOC增殖达峰值,12 d HOC从汇管区向肝实质内浸润,16 d HOC增殖较12 d减少.与模型组比较PB组4-16 d各时点HOC明显增加(P<0.01);IL/DT显示各时点模型组大鼠肝脏GJIC均低于对照组(P<0.01),与模型组比较PB组各时点GJIC进一步降低(P>0.01):模型组、PB组各时点CX32的表达低于对照组(P<0.05),与模型组比较PB组CX32表达在4 h,12,16 d时点减少(P<0.05),在4,8 d时点表达增多(P<0.05):模型组4 h-16 d时点CX32 mRNA水平分别为对照组的0.82±0.13,0.33±0.11,0.51±0.13,0.68±0.14,1.12±0.18倍,与模型组比较PB组4 h时点无显著差异(P>0.05),4-16 d时点明显升高(P<0.05).模型组4 h-16 d各时点CX43蛋白表达分别为对照组的1.14±0.17,3.87±0.35,5.28±0.48,2.96±0.33,2.12±0.19倍,与模型组比较PB组CX43蛋白4 h上调(P>0.05),4-16 d明显减少(P<0.05).模型组4 h-16 d各时点CX43 mRNA水平分别为对照组的1.09±0.16,2.82±0.23,5.46±0.58,3.34±0.64.0.91±0.11倍.与模型组比较PB组各时点CX43 mRNA表达上调(P<0.05).结论:改变大鼠2-AAF/PH模型肝脏CX32、CX43的时空表达模式,降低肝脏肝细胞及HOC与其偶联细胞的GJIC,可解除HOC生长抑制,促进HOC的增殖.

定量蛋白质组学分析方法及应用

蛋白质组学经历了近10年的发展,现在已经初具规模。但是由于它是动态地观察生物体不断变化的所有蛋白质,所以技术难度非常之大。为使研究简化并更具针对性,人们着重进行比较蛋白质组学的研究。为了具体量化这些蛋白质的变化产生了定量蛋白质组学,近几年各种标记技术的进步使得该学科得以迅猛发展。

不同恶化程度胃癌细胞系的细胞间隙连接通讯功能及Cx43表达的差异

以人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1和不同恶化程度的人胃癌细胞系(低恶化AGS细胞系、中恶化SGC-7901细胞系、高恶化BGC-823细胞系)为研究对象,采用激光共聚焦显微镜的荧光漂白恢复技术及划痕标记荧光染料示踪技术研究不同恶化程度的胃癌细胞系细胞间隙连接通讯(Gap junctional intercellular communication,GJIC)功能的差异;采用荧光定量PCR技术和间接免疫荧光技术检测间隙连接蛋白(Connexin43,Cx43)基因在mRNA和蛋白水平的表达差异,探求其与胃癌恶性程度的相关性.结果表明,在正常胃细胞系和低、中及高恶化胃腺癌细胞系中,细胞间的GJIC功能随着恶性程度的升高而减弱(AGS、SGC-7901)或消失(BGC-823),且Cx43蛋白及mRNA的表达量随着恶性程度的升高而下调(AGS、SGC-7901)或缺失(BGC-823).这提示胃癌恶性程度与胃癌细胞的GJIC功能显著相关(P<0.05),GJIC在胃癌发生中起重要作用.

头花蓼对幽门螺旋杆菌相关性胃炎的细胞间隙连接通讯功能的影响

目的探讨头花蓼对幽门螺旋杆菌相关性胃炎的胃黏膜上皮细胞株-GES-1细胞间隙连接通讯功能的影响。方法采用划痕标记荧光染料示踪技术检测不同比例(幽门螺旋杆菌与细胞之比为25∶1,50∶1,100∶1)的幽门螺旋杆菌数对胃黏膜上皮细胞株-GES-1细胞作用24h后间隙连接通讯功能的影响。构建幽门螺旋杆菌相关性胃炎(Helicobacter pylori-associated gastritis,HPAG)细胞模型基础上,采用划痕标记荧光染料示踪技术检测不同浓度的头花蓼(8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL)作用24h后对幽门螺旋杆菌相关性胃炎的细胞间隙连接通讯功能的影响。结果 (1)通过划痕标记荧光染料示踪技术检测结果表明细菌与细胞之比为50∶1作用24h时,减弱了胃黏膜上皮细胞株-GES-1细胞间隙连接通讯功能(P<0.05);(2)通过划痕标记荧光染料示踪技术检测结果表明头花蓼(64μg/mL)作用24h改善了幽门螺旋杆菌相关性胃炎细胞模型的细胞连接通讯功能(P<0.05)。结论头花蓼(64μg/mL)作用24h改善了幽门螺旋杆菌相关性胃炎细胞模型的细胞连接通讯功能,为头花蓼对H.pylori相关性胃炎的抗菌、抗炎机制奠定了实验基础。

基于氧化石墨烯及染料标记的核酸三色荧光探针检测汞离子

利用氧化石墨烯(GO)、两种荧光染料标记的单链DNA及核酸染料SYBR GreenⅠ(SG-Ⅰ),构建了能特异性识别Hg^(2+)的三色荧光探针,建立了一种快速、高效、高灵敏定量检测水体中汞离子(Hg^(2+))的新方法。在这种探针中,两种染料Tetramethyl-6-carboxyrhodamine(TAMRA)和Cyanine-5(Cy-5)分别标记在两条单链DNA的5’端,这两条单链DNA中有一部分碱基互补配对,未互补的碱基均为胸腺嘧啶(T碱基)。在没有Hg^(2+)存在时,两种荧光染料标记的单链DNA被吸附在GO的表面,TAMRA和Cy-5与GO靠近,荧光被GO猝灭,它们的荧光信号都很弱;此时,SG-Ⅰ被吸附在GO的表面或游离在溶液中,荧光信号也很弱。在有Hg^(2+)存在时,两种荧光染料标记的单链DNA通过T-Hg^(2+)-T结构特异性结合形成双链DNA,从而脱离GO的表面,TAMRA和Cy-5远离GO,荧光信号恢复;与此同时,SG-Ⅰ与双链DNA结合,荧光强度显著增强。根据TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度增加的程度即可对Hg^(2+)进行定量分析。在优化条件下,当Hg^(2+)的浓度在1.0×10^(-9)~5.0×10^(-8)mol/L范围内时,TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度之和与汞离子的浓度具有良好的线性关系,方法的检出限(LOD)为1.1×10^(-10)mol/L,实际水样的加标回收率在96.00%~105.00%之间。该方法用于实际水样中Hg^(2+)检测,获得了较为满意的结果。

高等植物叶绿体的遗传转化

利用不同方法在两个大不相同的实验室里首次获得了高等植物细胞器的遗传转化.MaxPlanck细胞生物学研究所和Heidelberg大学的G.Weber及同事利用一紫外线激光微束把外源DNA组合到油菜叶绿体中.他们将携带敌菌灵抗性基因并用荧光染料标记的DNA注入油菜细胞的胞质中.然后用3毫微秒氮激光微束(接入一倒置显微镜的光径里)脉冲击穿细胞内的叶绿体.通过处理叶绿体的荧光性以及敌菌灵抗性在油菜细胞中的瞬时表达证实了DNA的摄取.处理细胞存活并再生成株.但是,在再生株里并未发现引入基因的表达.

SA45型自卫手枪——一种非杀伤性武器

长期以来,人们就要求有一种自卫武器,它既具有手枪的所有优点,同时又不是致命的,不会造成损伤。SA45型自卫手枪就是这样一种武器。早先为了保护被劫持情况下的空中乘员而设计的这种非杀伤性武器,现在已在许多保安部队中广泛使用。

面部支持系统：皮下脂肪室间隔界限的组织学评价

背景与目的对于美容外科和修复重建外科来讲，皮下脂肪室具有显著的重要性，所以验证这些关于脂肪室的解剖学研究和相关概念就显得尤其重要。因此，笔者就多个面部邻近脂肪室的间隔界限进行了组织学研究。方法本研究选取18侧半面尸头（男性5具，女性4具；年龄39～87岁）。将组织标记染料注入前额中部，以及颊内侧、中部、外侧、近颞侧脂肪室。染料注入后向周围蔓延，4h后标记处的染料凝固着色，皮肤上可见红色的标记。以此方法处理所有标本并浸泡于甲醛溶液中过夜。至此，标准的组织学处理已完成。结果本组所有尸头，每部分脂肪室经分段染色．呈现出连贯的、相同的模式。各个脂肪室间彼此以致密的纤维性结缔组织分隔。这些隔膜起自浅筋膜，向上插入皮肤真皮层。在额部，隔膜起自额肌筋膜，因此，此类隔膜与表浅肌腱膜系统（SMAS）无必然联系，但却存在于皮下筋膜与皮肤之间的多个部位。结论本实验证实，皮下脂肪是以脂肪室的形式存在的，尤其是贯穿于皮下筋膜与真皮层之间的致密隔膜更能证明这一理论。这些间隔相互交联形成一个整体的框架，从而限制面部的剪（切）力。这个整体框架为人面部提供了一个“支持系统”。因此，我们可以理解人面部老化是一个三维的变化过程．各脂肪室在位置和容量上都发生着变化，并与邻近脂肪室有相互作用。

鱼藤酮对星形胶质细胞缝隙连接耦联功能的影响

目的观察鱼藤酮对星形胶质细胞缝隙连接耦联功能的影响。方法建立星形胶质细胞与常用的神经细胞株PC12细胞共培养鱼藤酮染毒模型,应用划痕染料标记示踪技术观察染毒星形胶质细胞缝隙连接耦联功能的变化,采用RT-PCR法检测CX43 mRNA的表达,Western Blot技术观察CX43蛋白活性变化。结果随着染毒剂量的增加,鱼藤酮对星形胶质细胞缝隙连接耦联功能的抑制作用愈发明显;与正常对照组比较,0.5、1.0μmol/L鱼藤酮染毒组CX43 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01)。结论鱼藤酮可引起星形胶质细胞CX43表达水平降低,显著抑制细胞缝隙连接耦联功能,这可能是其诱导神经细胞损伤的原因之一。