单病毒示踪技术在动植物细胞中的应用进展

病毒(virus)是一种专营胞内寄生的简单微生物,是造成动植物病害的主要病原体之一。病毒的侵染过程高度动态且复杂,单病毒示踪技术的发展为揭示病毒生命活动的精细过程提供了可能。单病毒示踪是一种基于荧光标记与高时空分辨率成像的新方法,允许对单一或多个病毒的生命活动进行观察。近几年,单病毒示踪技术在病毒入胞、复制、细胞间传染等方面的研究中获得广泛应用,使病毒感染机制的研究取得较大的进展。本文介绍了病毒入侵细胞机制的研究进展,重点总结了荧光标记在单病毒示踪上的应用,特别是对病毒不同结构的标记和成像方法进行了详细论述,以期为优化标记策略、解决对不同种类和结构的病毒实现高效标记等问题提供新思路。

猪圆环病毒2型遗传标记毒株的构建及生物学特性鉴定

以临床分离的猪圆环病毒2型(PCV2)为材料,利用PCR法扩增病毒基因组,将2个基因组顺式连接插入到质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基,在病毒基因组内插入SalⅠ限制性内切酶位点作为遗传标记,经重组质粒转染细胞获得带有遗传标记的新毒株。采用免疫过氧化物酶单层细胞试验、免疫电镜、核酸序列分析表明,在病毒感染细胞中检出病毒特异抗原,其抗原性、病毒形态学及基因序列与亲本毒株一致。鉴于新病毒基因组内插入一个SalⅠ酶切位点,用PCR与限制性片段长度多态性分析法可与野生型病毒相鉴别。新毒株经细胞连续传60代,体外培养增殖性能稳定,毒价可达10^(6．6)TCID_(50)/mL。取病毒培养物经静脉和滴鼻途径接种35日龄抗体阴性仔猪4头,接种后表现出体温升高、进行性消瘦、被毛粗糙及体表淋巴结肿胀症状,迫杀后多种脏器中均能检测到病毒抗原与核酸。研究表明,利用感染性分子克隆手段构建带有遗传标记的PCV2新毒株,为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、分子诊断等研究奠定了基础。

O型与A型口蹄疫重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定

为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒全长重组质粒p OFS/3A_(91-105)中,构建FMDV A型和O型嵌合的全长重组质粒p O/3A_(91-105)-AP1。该重组质粒经NotⅠ酶切线性化后转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞中,拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3A aa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。

3A蛋白104–115位氨基酸缺失口蹄疫A型标记病毒的构建

【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构建全长重组质粒。全长质粒经NotI线化后转染表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系,拯救标记病毒。RT-PCR、序列分析、间接免疫荧光和Western blotting鉴定标记病毒。噬斑表型和一步生长曲线分析标记病毒的生物学特性,并用实验室开发的针对3A优势表位(AEKNPLE)的阻断ELISA方法分析其区分亲本和标记病毒感染的动物。【结果】成功拯救到一株含3A 104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,3A表位的缺失没有影响标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线。3A单抗阻断ELISA可以明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物。【结论】本研究构建的3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒可以作为发展口蹄疫鉴别诊断疫苗的候选毒株,用于我国未来口蹄疫A型的有效防控。

PRRSV标记病毒样颗粒的制备及其鉴定

当今预防猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的灭活苗和弱毒苗都存在不可避免的局限性,所以研制新型疫苗势在必行。病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）在形态结构上与天然病毒粒子无异,生物安全指数高,是理想的传统疫苗替代品。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）粒子主要由能够诱导产生中和抗体的GP5蛋白和具有强细胞免疫力的M蛋白组成基本框架结构。本研究以2型高致病性PRRSV的GP5蛋白和M蛋白为研究对象,通过Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建标记型PRRSV VLPs,同时探索核衣壳蛋白N对VLPs形成的影响。在本试验中将含有Myc标签的GP5（Myc-GP5）和含有His标签的M（His-M）蛋白基因分别克隆至pFastBac dual载体的p10和pH双元启动子下;N蛋白基因克隆至pFastBac HTB载体上,转染sf9和Highfive细胞后,GP5、M和N蛋白均被成功表达。透射电镜观察结果表明,Myc-GP5和His-M能够自动组装成VLPs,并且与天然PRRSV形态一致,具有双层膜结构,直径大小在40-60 nm。采用抗M蛋白的家兔血清进行免疫电镜观察,结果显示,Myc和His双标记型VLPs与天然病毒一样都能够被金颗粒标记,而且共感染的N蛋白不影响标记型VLPs的组装。本研究首次采用昆虫杆状病毒表达系统成功制备了PRRSV的双标记型VLPs,具备与天然病毒相似的特性,为开发高效安全以及能够区分感染与免疫VLPs疫苗奠定了基础。

乙肝病毒标记物阳性表型血清标本乙型肝炎病毒(HBV)-DNA临床检验分析的应用价值探讨

目的研究乙肝病毒标记物阳性表型血清标本乙型肝炎病毒(HBV)-DNA临床检验的结果分析,探讨其临床应用价值。方法选取350例乙肝病毒标记物模式不同的血清作为研究标本,测定乙肝病毒DNA与前S 1抗原在乙肝表面抗原阳性各种模式中的表达情况,并分析其表达相关性。结果除HBs Ag+、HBc Ab+外,在乙肝表面抗原阳性的各种模式中,乙肝病毒DNA在前S 1抗原阳性中的阳性表达率均明显高于其在前S 1抗原阴性中的阳性表达率,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 HBV-DNA与前S 1抗原在乙肝表面抗原阳性各种模式中的表达具有明显的相关性,前S 1抗原的阳性表达情况可以准确地提示HBV-DNA在乙肝患者中的复制情况,值得临床检验推广应用。

红色荧光蛋白遗传标记腺病毒衣壳蛋白pⅨ的实验研究

采用在细菌Bj5183中同源重组的方法成功构建了红色荧光蛋白mCherry标记pⅨ蛋白的腺病毒质粒载体.将PacⅠ线性化的腺病毒质粒载体转染HEK293细胞7～10d后获得病毒裂解液,然后将其在体外进一步扩增并经CsCl密度梯度离心纯化后获得mCherry标记腺病毒pⅨ蛋白的病毒颗粒.在采用荧光显微镜检测荧光标记的病毒颗粒之后,将其加入A549细胞中,并在不同时间点追踪观察荧光标记的病毒颗粒在细胞内的定位.结果表明,在荧光显微镜下观察到病毒颗粒的红色荧光;在病毒与细胞孵育过程中,随着荧光标记病毒与A549细胞孵育时间的延长,病毒颗粒逐渐向细胞核周围聚集.

^(125)Ⅱ标记病毒DNA探针制备方法的研究

本文报道以油桐尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)DNA、单纯疤疹病毒(HSV)DNA、λDNA为材料,用国产^(125)I-碘化钠制备探针。探讨了离子强度,pH值、反应温度及时间诸因素对以三氯化铊为氧化剂核酸标记的影响。在pH值为4.8—4.9,离子强度(以Na^+计)为0.1mol/L、反应温度为70℃、时间为30分钟条件下,可获得高比活性的产物。^(125)I的掺入率在10—30％之间,探针的比活性可超过10~6cpm/μgDNA。点杂交结果显示,探针最低可检测出1Pg同源DNA,探针的特异性强,存放于-20％冰箱的探针在两个月内最低检测量没有明显变化。

清肝颗粒对慢性乙型肝炎患者肝功能和血清病毒标记物的影响

目的 :观察清肝颗粒对慢性乙型肝炎患者的肝功能和血清病毒标记物 (HBVM )的影响。方法 :将 64例慢性乙型肝炎患者分为两组作对比治疗 :( 1)清肝颗粒治疗组 (清肝组 ) 3 4例接受清肝颗粒治疗 ,每次 1小袋 (含 10g) ,每日 3次 ,疗程 8周 ;( 2 )对照组 3 0例 ,仅给予一般护肝药物包括肝泰乐、肌苷、维生素C、复合维生素等治疗。所有患者治疗前后均检测肝功能和HBVM (采用ELISA法 )。结果 :清肝颗粒组对改善肝炎症状和体征以及降低血清ALT有明显效果 ,其疗效较对照组为佳 ,两组比较差异有显著性意义 (P <0 .0 0 1～ 0 .0 5 ) ;清肝组HBeAg的转阴率高于对照组 ( 2 3 .5 %vs6.7%) ,但经统计学处理差异尚未达到显著性 (P >0 .0 5 )。未见明显副作用。结论

乙型肝炎病毒前S2抗原与HBV血清标记物相关性分析

目的了解本地区HBV感染者血清学标记物与前S2抗原的关系。方法对324例HBsAg阳性标本酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清标记物与前S2(PreS2)。结果HBsAg阳性标本中HBV血清标记物模式4种常见模式PreS2阳性率有所不同,即模式1:HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗-HBc(+)PreS2阳性率为85.1%;模式2:HBsAg(+)、HBeAg(+)PreS2阳性率为78.6%;模式3:HBsAg(+)、抗-HBe(+)、抗-HBc(+)PreS2阳性率45%;模式4:HBsAg(+)、抗-HBc(+)PreS2阳性率63.2%。HBeAg与PreS2阳性率有差异性,PreS2的检出率高于HBeAg。结论PreS2比HBeAg更敏感的反映病毒存在和复制情况,PreS2与HBV血清标记物联合检测,具有重要的临床应用价值。

乙肝病毒标记物检测结果分析

目的 对乙肝病毒前S1抗原 (Pre-S1)、乙肝病毒基因组 (HBV -DNA)、乙肝病毒血清免疫学标记物检测的结果分析。方法 用酶联免疫吸附测定和多聚酶链反应检测 10 0份血清标本中的Pre -S1、乙肝五项和HBV -DNA ,并对结果进行分析。结果 乙肝五项检测得到 8种模式的结果 ,Pre-S1阳性率为 67% ,HBV -DNA阳性率为 72 %。结论 Pre -S1较HBV血清免疫学标记物更为敏感 。

大鼠视交叉上核与视上核的纤维联系—病毒跨神经元追踪,免疫组化双重标记法研究

大鼠视交叉上核与视上核的纤维联系—病毒跨神经元追踪，免疫组化双重标记法研究王蕾欧可群陈文玉操高原张军马玉琼（华西医科大学组织学研究室）有文献报道视交叉上核（ＳＣＮ）的传出纤维到达室旁核（ＰＶＮ），但是否有传出纤维投射至视上核（ＳＯＮ），目前尚未见报道...

假狂犬病毒标记研究神经传导通路的新进展

假狂犬病毒能在感染后寄生于周围神经系统,并跨突触感染相连的神经元或器官。由于能自我繁殖使信号放大,因此很早就被用作标记物研究神经传导通路。假狂犬病毒的结构决定了它的功能,特别是膜蛋白与病毒的侵袭,跨神经元传播密切相关。近年来,研究人员通过反复传代筛选或基因重组技术剔除了某些膜蛋白或加入了新的荧光蛋白,创造出一批新的病毒,使假狂犬病毒能够研究更多级神经元,直接通过荧光显微镜观察,通过多重标记来观察各神经通路间的相互作用。此外,特定的转基因动物和新型假狂犬病毒合用也显示出了广阔的应用前景。繁多的病毒种类和使用方法给研究带来极大便利的同时也对实验设计提出了更高的要求。合理选择,使用假狂犬病毒必然能够对神经传导通路研究起极大的推动作用。

慢性乙肝患者肝组织病理改变与病毒标记物表达模式的相关性研究进展

我国属乙型肝炎病毒（HBV）感染高流行区,一般人群的HBsAg阳性率为9.09%。其中慢性乙型病毒性肝炎（CHB）为2000～3000万例,每年死于HBV感染相关肝病约30万例。人类对于乙型病毒性肝炎的认识最初缘于肝炎病毒血清标志物的发现,目前对于乙型病毒性肝炎的诊治和随访,其血清学指标仍是常规开展项目,但由于血清中乙肝病毒标记物表达模式各有不同,以及病毒载量的高低各异,给临床医生带来了新的思考：

490例护士乙肝病毒标记物检测结果分析

了解院内护士乙肝病毒标记物水平,分析银川市某院2007年度490名护士体检乙肝HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗HBcAB。结果,全阴占27.35%,抗-HBs(+)占56.33%,感染模式占7.55%。需要加强护士人群乙肝疫苗的接种及工作期间的有效防护。

乙肝病毒标记物阳性表型血清标本HBV-DNA的检验分析

目的探讨乙肝病毒标记物阳性表型血清标本乙型肝炎病毒(HBV)-DNA临床检验分析的应用价值。方法选择该院收治的358例不同的HBV标记物模式的血清标本,测定乙肝5项及preS1抗原、HBV-DNA在各种HBV-M模式中的阳性表达水平,以及preS1抗原与HBV-DNA在各种乙肝表面抗原阳性(HBsAg+)模式中的表达相关性。结果乙肝表面抗原阳性(HBsAg+)、乙型肝炎e抗原阴性(HBeAg-)、乙肝表面核心抗体阳性(HbcAb+)模式组的HBV-DNA阳性率明显高于其他模式组的阳性率,差异有统计学意义(P<0.05);HBsAg+、HBeAg-、HBcAb+模式组的preS1+阳性率高于其他模式组的阳性率,差异有统计学意义(P<0.05);在各种HBSAg的阳性模式中,HBV-DNA在preS1+中的阳性表达率明显高于HBV-DNA在preS1-中的阳性表达率,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 preS1能准确反映患者体内HBV-DNA的复制情况,并且可以弥补传统乙肝5项测定中的漏诊情况,同时preS1测定所需成本较低,操作简单,值得对其进行进一步的研究。

乙肝病毒标记物阳性表型血清标本HBV-DNA检验分析的应用价值观察

目的对乙肝病毒标记物阳性表型血清标本进行HBV-DNA检验分析,探讨其在乙型病毒性肝炎诊断及治疗中的临床价值。方法抽取2014年3月~2015年11月本院接诊的460例血清检测Pres1、HBs Ab、HBs Ag、HBe Ag、HBe Ab、HBc Ab-Ig M、HBc Ab-Ig G中两项或两项以上呈阳性的患者作为研究对象,采用PCR荧光定量检测法进行HBV-DNA的测量,分析其检测结果。结果 HBe Ab、HBs Ag、HBc Ab-Ig G阳性组合的占比最高,达30.9%,其HBVDNA水平为（5.4±1.3）×104copy/ml。HBs Ag、HBe Ag、HBc Ab-Ig M阳性组合次之,占比22.8%,HBV-DNA水平为（1.2±0.3）×104copy/ml;对照组血清样本中的HBV-DNA含量显著低于研究组,组间比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论通过采用PCR技术对HBV-DNA含量的分析可加强乙型病毒性肝炎诊断的准确性,为患者提供了更加科学可靠的诊治依据。

乙肝病毒标记物阳性表型血清标本乙型肝炎病毒(HBV)-DNA临床检验分析的应用效果评价

目的研究乙肝病毒标记物阳性表型血清标本乙型肝炎病毒(HBV)-DNA临床检验分析的应用效果。方法选取2016年1月至2016年12月本院收治的2型病毒性肝炎患者25例,为观察组,并选取同期接受体检的健康人25例,为对照组,均实施PCR荧光定量检测,对比两组乙型肝炎病毒(HBV)-DNA水平。结果观察组受检人员HBV-DNA水平(4 799.32±12.55)×10^3 copy/ml,相比对照组HBV-DNA水平(0.61±0.02)×10^3 copy/ml较高(P<0.05)。结论实施PCR荧光定量检测能够对HBV-DNA水平进行分析,进而有效检出乙型病毒肝炎,为后期治疗提供有利依据,值得研究。

磁微粒化学发光法与酶联免疫吸附法检测乙肝病毒标记物的作用评价

目的比较磁微粒化学发光法(CLIA)与酶联免疫吸附法(ELISA)对乙肝病毒(HBV)标记物的检测效果。方法用随机数字分配法将我院从2017年6月-2018年6月收治的400例HBV携带者分为对照组和观察组两组,每组各200例,其中对照组予以ELISA进行检测,观察组予以CLIA进行检测,对比两种检测方法的HBV标记物阳性概率和灵敏度。结果两组HBV标记物的HBsAb和HBcAb阳性概率相差不大(P>0.05),观察组的CLIA检测法中HBsAg、HBeAg和HBeAb阳性概率明显高于对照组,灵敏度明显比对照组高(P<0.05)。结论 CLIA相较于ELISA检测灵敏度更高,对HBsAg、HBeAg和HBeAb的检测准确度更高,更值得推广。