实时无标记细胞分析系统与传统MTT法在测定乳腺癌细胞增殖中的比较

目的:通过实时无标记细胞分析法与传统MTT法对乳腺癌细胞增殖进行监测以对比确定研究细胞增殖的最佳实验方法手段。方法:采用MTT法、实时无标记细胞分析法测定瘦素刺激乳腺癌MCF-7细胞增殖的效果。结果:MTT法和实时无标记细胞分析法结果均表明瘦素作用浓度为0.625 nmol/L、作用时间为24 h的条件下对乳腺癌MCF-7细胞有诱导生长的效果。但实时无标记细胞分析法能够实时监测细胞生长和增殖的动态生物学反应过程,观察效果更加直观、准确。结论:实时无标记细胞分析法可较好地弥补MTT法的缺点,成为一种新的研究细胞增殖的实验方法。

免疫双标记细胞的检测在中枢神经系统白血病诊断中的意义

目的 :观察末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)及淋巴细胞系列相关抗原双标记细胞在脑脊液中的检出对中枢神经系统白血病 (CNS L)的临床意义。方法 :采用免疫荧光标记技术配合流式细胞术 ,检测初治或完全缓解期急性淋巴细胞白血病脑脊液中TdT及淋巴系列相关抗原双标记细胞及其治疗后的变化。结果 :6 4例中 8例脑脊液检出上述免疫双标记细胞 ,均为急性淋巴细胞白血病 ,其中 1例无CNS L临床迹象 ,免疫双标记细胞占3.38% ,经治疗后免疫双标记细胞在脑脊液均明显减少或消失。结论 :脑脊液中免疫双标记细胞的检出对CNS L的诊断及治疗指导具有重要的临床意义 。

固定剂、封片剂、温度及除菌方式对量子点标记细胞的影响

为了为利用量子点标记细胞、组织，进一步研究其功能提供新的方法，本实验观察了3种发射波长的量子点（quautum dost，QDs）对所标记的小鼠腹腔巨噬细胞和正常皮肤的影响。利用发射波长610mm的红色荧光水溶液（量子点610）、发射波长为523mm的绿色荧光水溶液（量子点523）和发射波长576nm的黄色荧光脂溶性溶液（量子点576）的3种量子点（5mg／ml）以及具有吞噬能力的小鼠腹腔巨噬细胞、正常皮肤为载体，观察不同的除菌方式、温度、封片剂及固定剂对量子点标记细胞、组织的影响，为量子点在生物体内的应用及在生物制片过程中对其性能的影响等研究奠定基础。

特发性血小板减少性紫癜患儿外周血T_（48）^（＋＋）双标记细胞的分布

用减数法观察了３０例原发性血小板减少性紫癜（ＩＴＰ）患儿外周血Ｔ双标记细胞（ＤＬＣ）的分布及ＤＬＣ分别与血小板计数（ＰＣ）、血小板表面相关抗体ＩｇＧ（ＰＡＩｇＧ）、ＨＬＡ－ＤＲ＋Ｔ细胞及ＨＬＡ─ＤＱ＋Ｔ细胞的关系。发现：ＩＴＰ患儿的ＤＬＣ较正常对照组显著升高（Ｐ＜０．０１）。ＤＬＣ与ＰＡＩｇＧ、ＨＬＡ─ＤＲ＋Ｔ及ＨＬＡ─ＤＱ＋Ｔ均呈显著正相关（Ｐ分别＜０．０５、０．０５及０．０１），与ＰＣ呈负相关（Ｐ＜０．０５）。提示ＤＬＣ在外周血中的大量出现与ＩＴＰ发病密切相关。

用子宫内膜中PCNA标记细胞探讨人与小鼠子宫内膜细胞增殖的差异

因良性疾患行手术摘除的人子宫内膜标本40例，将子宫标本分成8个期。BDF1雌性小鼠50只，分成5个期。用免疫组织化学法进行子宫内膜增殖细胞核抗原（Proliferatingcellnudearantigen，PCNA）染色反应。结果人子宫内膜PCNA标记细胞在增殖初期腺上皮细胞（40％）和增殖中期子宫内膜中部（48％）较多，表面上皮PCNA标记细胞很少。而小鼠动情期PCNA标记细胞（22％）最多，并主要分布在表面上皮（60％）。提示人与小鼠子宫内膜细胞的增殖时间与增殖部位有明显差异。此实验将丰富不同种属间子宫内膜增殖差异的基础理论研究。

电穿孔法在量子点标记细胞中的应用

An electroporation method was proposed to make QDs pass through the membranes of K562 leukaemia cells. This method is operated simply and facilitates the tagging experiment greatly. The results show that when the electroporation voltage is 200 V and the lasting time is 1 ms, a high tagging rate is reached. A lot of cells can be tagged at the same time and the livability of the cells is 60%. The whole process can be completed in 20 min. This method brings forward some more extrusive advantages than cell endocytosis and microinjection method, and there should have a very good foreground for further applications.

CFSE标记细胞的影响因素探讨

目的探讨影响CFSE标记细胞效果的多种因素。方法用不同配制时间、不同浓度的CFSE标记不同浓度的HL60细胞、MCG803细胞以及人淋巴细胞。结果配制的CFSE在存放2年以后标记率下降12．32％；在10μmol／L范围内细胞标记率与CFSE浓度成正比；低浓度细胞的标记率比高浓度的更高；同等条件下HL60细胞的标记率高于MCG803细胞；细胞的异质性使同一群细胞的标记率发生差异；散点图比直方图更适合CFSE标记细胞的传代分析。结论2．5～5μmol／L的CFSE是理想的标记浓度,10^6／mL是合适的标记细胞浓度。均一的细胞是高质量标记的关键。

猫腹腔神经节注射HRP后脊神经节标记细胞的节段分布

本文以1或2mg HRP水溶液,注入9只猫的10侧腹腔神经节内,藉穿经该节的内脏感觉纤维的摄取和逆行传递,在脊神经节中证实了这些纤维起源的胞体及其分布的节段范围。结果表明:行经猫一侧腹腔神经节内出自脊神经的内脏感觉纤维绝大部分起源于同侧的脊神经节内。虽然它们的来源范围可自胸_(2)到腰_(2),但出自胸_(5~9)脊神经节的占78.1%,胸_(6~8)三节中占半数以上,最多的是胸7脊神经节(占22.19%)。标记的细胞体以中小型者为主,大型极少见,只占2.78%,且主要分布在胸_(5~9)脊神经节。比较了左右侧注射的结果,标记细胞出现的节段范围及分布形势未见明显的差别;在脊神经节内的位置分布也未见有任何规律。此外,对实验方法、标记细胞的数量和机能意义等进行了讨论。

实时无标记细胞分析（RTCA）与CCK-8方法条件下LPS对奶牛乳腺上皮细胞增殖的比较分析

无标记细胞分析法(RTCA)与CCK-8法,可用于奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)活性监测。本研究选择RTCA和CCK-8两种方法,在0、5、10、20ng/μL4种不同浓度LPS条件下,研究LPS对MAC-T增殖的影响。结果表明,RTCA和CCK-8法均在不同浓度LPS条件下使MAC-T活力下降,均在浓度20ng/μL、时间6h时,下降最为明显。但相比之下,CCK-8法在定点测定时有局限性,而RTCA方法可以不间断、无标记和实时监测细胞贴壁、迁移和增殖的动态等生物反应过程,观察效果更加直观、准确,可较好地弥补CCK-8法的缺点,是较理想的研究奶牛乳腺上皮细胞增殖的方法。

纳米荧光染料C-dots标记细胞的应用

目的探讨一种新型纳米荧光染料C-dots作为细胞标记物的应用。方法不同直径的C-dots和B16小鼠黑色素瘤细胞共同培养,用激光共聚焦荧光显微镜观察C-dots被摄取及在细胞内分布情况。利用MTT比色法测定C-dots标记的细胞及未标记细胞的增殖情况;用台盼蓝染色法检查标记细胞活性。结果直径10 nm和5 nm C-dots可用于标记细胞。在共聚焦显微镜下,可见C-dots标记细胞的细胞膜带有近红外荧光。利用MTT比色法测定标记及未标记细胞的A值无显著差异,C-dots标记细胞的活性与对照组相比也无显著差异。结论C-dots可作为细胞内的标记物,用于细胞示踪、增殖试验等研究。

酶介导的邻近细胞标记方法探究细胞间相互作用

细胞-细胞相互作用(cell-cell interactions,CCIs)可以通过细胞表面蛋白质、聚糖、脂质等介导的细胞间突触形成而发生,以维持机体稳态和调控生理功能。这些CCIs是复杂的,涉及许多不同的细胞表面和细胞内分子的参与。随着基础研究和转化医学的不断发展,如何准确识别细胞间相互作用并对其进行表征和定量,引起了广泛关注。近年来,研究CCIs的技术手段不断推陈出新,而邻近标记是一种十分有前景的研究细胞间相互作用的化学生物学方法。目前,主要有两种类型的标记策略。一种是依赖基因工程操作,在“诱饵”细胞表面表达外源酶,通过其与相邻细胞上的受体底物的直接结合,以便发生细胞间邻近标记。另一种是使用酶或小分子催化剂(例如光催化剂),通过基因工程重组表达或借助化学(化学酶)方法将它们偶联在“诱饵”细胞表面,在适当的刺激或激活后,靶向递送感兴趣的标记分子,实现邻近标记。其中,酶介导的邻近细胞标记方法在检测和表征CCIs上具有重要的应用价值。该综述将标记过程中涉及有酶参与的方法定义为酶介导的邻近细胞标记方法,这种方法的一个明显优势是,由于酶和受体底物之间直接的物理接触或酶催化产生高反应活性标记分子而实现小的标记半径范围。该综述旨在归纳与总结近年来开发的酶介导的邻近细胞标记方法的原理、优缺点及现有应用。

乙酰辅酶A羧化酶相关树突状细胞标记预测肝癌患者的预后及潜在治疗药物识别

目的研究乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coa carboxylase 1,ACACA)基因在肝癌中的表达、预后价值及其与免疫细胞的相关性,构建肝癌预后模型。方法整合基因型组织表达(genotype-tissue expression,GTEx)数据库和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据分析ACACA基因在癌症及癌旁组织的表达差异,预后分析。分析ACACA与免疫细胞的相关性。使用GSE156625单细胞转录组测序(single cell RNA seq,scRNA-seq)数据研究ACACA在树突状细胞(dendritic cells,DCs)中的表达。建立基于载脂蛋白C-Ⅰ(apolipoprotein c-Ⅰ,APOC1)和载脂蛋白C-Ⅲ(apolipoprotein c-Ⅲ,APOC3)的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)预后模型,使用Kaplan-Meier生存曲线和时间依赖性受试者操作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线评估预后能力,并通过分子对接分析中药成分在APOC1和APOC3中的作用。结果ACACA在多种癌症中表达差异显著,与肝癌预后相关。高表达ACACA降低树突状细胞含量。APOC1和APOC3是主要DCs标记基因,与ACACA表达正相关。基于APOC1和APOC3的原发性HCC预后模型具有中等的敏感性和特异性。使用列线图预测TCGA队列中肝癌患者的1年,3年和5年总生存期(overall survival,OS)的可能性,并通过校准曲线分析证实了其可靠性。Salvianolic acid B、Asiaticoside和Neohesperidin可能对APOC1和APOC3具有作用潜力。结论ACACA与肝癌预后密切相关,基于APOC1和APOC3的预后模型可作为预测指标,部分中药成分可能对肝癌治疗有潜力。

体外纳米磁标记骨髓间充质干细胞生物学特性及其MR成像

目的研究超顺磁性氧化铁粒子(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)体外标记兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及MR细胞成像示踪可行性。方法从兔骨髓中分离培养MSCs,体外不同浓度SPIO联合硫酸鱼精蛋白标记,未标记细胞设为对照组。普鲁士蓝染色和电镜检查鉴定细胞内铁颗粒,台盼蓝染色检测细胞存活,MTT法测定细胞生长曲线的变化,磁标记MSCs转入成骨、成脂肪培养基中进行诱导培养后进行鉴定,应用1.5TMR梯度回波T2加权(GRET2*WI)扫描序列和自旋回波T2加权(SET2WI)扫描序列对磁标记细胞成像示踪。结果普鲁士蓝染色和电镜检查显示细胞质内含致密铁颗粒,磁标记对MSCs活性和增殖无统计学差异(P>0·05),标记细胞可正常成骨、成脂肪分化。GRET2*WI序列和SET2WI序列提示与未标记细胞信号强度(SI)相比,1×106(标记细胞)、5×105(标记细胞)SI均显著性下降(P<0·05),其中GRET2*WI的信号强度衰减率(△SI)显著高于T2WI序列(P<0·05)。在2个序列中1×106(标记细胞)△SI均高于5×105(标记细胞)△SI,但不具有显著性差异(P>0·05)。结论SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功标记MSCs,磁标记对细胞存活、增殖及潜在多向分化能力无影响。磁标记细胞在MR上产生特征性的低信号改变。应用1.5TMR成像示踪标记细胞可行,以GRET2*WI序列成像最为敏感。

绿荧光蛋白标记人骨髓源性神经干细胞的体外实验研究

目的:探讨重组腺相关病毒包装绿荧光蛋白(rAAV-GFP)标记人骨髓源性神经干细胞(BM.NSCs)的可行性,为进一步行标记细胞移植实验研究奠定基础。方法:以成人自愿者的骨髓为研究对象,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞并用“Cytokine·神经干细胞培养基”诱导分化为神经干细胞,分化的细胞以免疫细胞化学鉴定。对接种生长的BM.NSCs(1×105～6/mL)以无血清培养基冲洗并重悬细胞,依最佳病毒感染指数(MOI)为105的标准计算、加入包装了GFP的rAAV病毒颗粒,连续培养12h(37℃,50mL/LCO2)以感染细胞;补加100g/L胎牛血清后,于神经干细胞培养基中继续细胞培养24h(37℃,50mL/LCO2)以上,荧光显微镜(OlympusIX70,Japan)追踪观察rAAV-GFP标记的BM.NSCs。结果:BM.NSCs于标记后1周内见不到GFP阳性表达;在标记10d后才出现有GFP阳性表达情况(平均每个200倍镜下视野可见到5～10个GFP阳性细胞),所标记的细胞在荧光显微镜下呈亮绿色;随着培养时间延长,BM.NSCs表达GFP也逐渐增强、阳性细胞数量逐渐增多,并可于1个月时最明显(标有GFP阳性的细胞可达BM.NSCs总数的60%),追踪观察到到2.5个月时亦未见衰减。结论:rAAV-GFP在人骨髓源性神经干细胞中的表达较迟,但呈渐强趋势;rAAV-GFP标记人骨髓源性神经干细胞具有可行性。

Ferumoxides标记神经干细胞及其对增殖分化的影响

目的:研究超顺磁性氧化铁(superparamagneticironoxides.SPIOs)标记神经干细胞及其生物学特性。方法:神经干细胞培养、传代和诱导分化;菲立磁(Ferumoxides,一种SPIOs)标记神经干细胞,制备磁标记神经干细胞;利用免疫细胞化学、透射电镜和Prussianblue染色等方法对磁标记神经干细胞的生长、分化等生物学特性进行研究。结果:在原代及传代细胞中有Nestin阳性细胞即神经干细胞。血清诱导下,神经干细胞可分化为GFAP、MAP - 2、NSE、Tau蛋白及NF2 0 0阳性细胞。Feru moxides与神经干细胞共同孵育后,透射电镜及Prussianblue染色显示胞浆中含有铁颗粒,SPIOs也可以随细胞的分裂增殖而传到子代细胞中。随Ferumoxides浓度的增高(2 .8μg/ml～16 .8μg/ml) ,Ferumoxides对神经干细胞存活、分化能力的影响无显著性差异(P >0 .0 5 )。当Ferumoxides的浓度大于2 2 .4 μg/ml时,SPIOs影响其存活和分化(P <0 .0 5 )。结论:本实验在国内首次利用Ferumoxides作为磁标记探针,对神经干细胞进行成功磁标记。为进一步利用核磁共振(MRI)对神经干细胞活体追踪奠定实验基础。

骨髓骨片法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞和PKH26标记

目的 旨在建立一种高效的方法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的方法,并应用PKH26进行体外标记,探讨PKH26标记对BMSCs生物学特性的影响,以及体外示踪情况。方法 将大鼠5 d乳鼠双后肢骨进行分离,去除周围的肌肉和筋膜,并将其剪成小块进行培养,利用换液、传代提纯BMSCs,应用流式细胞仪测定第3代细胞表面抗原。在培养条件相同的情况下,取第3代BMSCs应用PKH26进行标记,标记组与未标记组在荧光显微镜下对细胞形态学、增殖状态进行观察,比较标记组与未标记组成骨成脂诱导特点及鉴定。结果 骨髓骨片法分离乳鼠双后肢骨,培养BMSCs呈细长梭形,形态均一,短时间内可迅速获得大量BMSCs;经流式细胞仪鉴定结果表明,表达CD29为(91.18±1.29)%,表达CD90为(95.04±0.11)%,表达CD45为(1.74±0.36)%;PHK26标记对BMSCs细胞形态,增殖无明显影响(P>0.05),对成骨成脂诱导无影响。结论 采用大鼠5 d乳鼠骨髓骨片法能够快速培养出大量高纯度的BMSCs,该细胞可作为种子细胞用于骨组织工程;PKH26可对体外大鼠BMSCs进行标记。

低浓度超顺磁性氧化铁标记兔骨髓间充质干细胞的体外磁共振成像研究

目的：以浓度为25μg Fe／ml的超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO）体外标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），并探讨1.5T核磁共振仪成像的特征和成像所需最低标记细胞浓度，以及在标记后1d、1周、2周、3周、4周的信号变化特征。方法：分离、纯化、培养兔BMSCs并以25μg Fe／ml的SPIO培养液浓度标记，对标记后不同时间的细胞行普鲁士监染色和台盼蓝拒染后显微镜观察，并进行MR成像，测量不同序列下不同浓度标记细胞管的信号强度，以确定扫描敏感序列及成像所需最低标记细胞浓度；再测量不同细胞浓度不同时相信号强度，来观察信号强度随时间变化的规律，并进行统计学分析。结果：浓度为25μg Fe／ml的超顺磁性氧化铁纳米粒子标记BMSCs的有效率接近100％，普鲁士蓝染色见细胞浆内有大小不等的蓝染铁颗粒，且在标记后4周内细胞仍具有活力，标记后的BMSCs在T2WI、尤其是GRE（T2WI）序列信号明显降低；并且细胞浓度越高信号降低越明显，GRE序列MR成像的最低细胞浓度为5×10^4／ml。当标记细胞浓度为5×10^4／ml时，信号在T2WI序列的降低2周后失去统计学意义；而在细胞浓度为5×10^5／ml时，标记3周后，信号在T2WI序列的降低才失去统计学意义。结论：25μg Fe／ml铁浓度标记干细胞不仅标记效率高．而且对细胞生长及增殖活力无明显影响．标记后MR信号改变与干细胞数目及标记时间相关。

DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究

目的:研究随着时间延长,DAPI标记间充质干细胞(MSCs)的标记率变化。方法:分离培养纯化成年大鼠骨髓MSCs,DAPI标记,不同时点荧光显微镜观察,计算MSCs中DAPI阳性率。将标记的MSCs移植到缺血下肢模型动物骨骼肌中,不同时点取材,冰冻切片,观察移植细胞。结果:标记当天,荧光镜下MSCs胞核呈明亮蓝色荧光,标记率接近100%,随着培养时间延长,标记率逐渐下降。移植1周和2周组织切片中,可见密集移植MSCs,3周以后,可检出的DAPI阳性细胞明显减少。结论:DAPI短期标记细胞效率很高,但标记率随着时间延长而迅速下降。

磁标记大鼠神经干细胞移植入脑缺血大鼠的磁共振示踪

【目的】使用菲立磁(Feridex)体外标记胎鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs),并在移植脑缺血大鼠后进行活体MRI示踪观察。【方法】分离、培养大鼠胚胎源性神经干细胞,使用"Feridex一多聚赖氨酸复合物(FE-PLL)"标记神经干细胞,对标记细胞分别进行普鲁士蓝染色、电镜观察,将FE-PLL标记神经干细胞分别移植人脑缺血大鼠左右侧脑室内,活体移植后1、5、14d体内MRI示踪。【结果】菲立磁可以高效率地标记神经干细胞,普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记神经干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示FE-PLL标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。MRI检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变。【结论】菲立磁可以用来体外标记神经干细胞,利用MRI技术可以对脑内移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。