标记酶及其研究进展

标记酶及其研究进展陈永健综述刘建栋审校（浙江省人民医院检验科，杭州３１００１４）关键词丝氨酸蛋白酶几丁质酶重组酶１常用标记酶及其特性见表１和表２。表１应用于固相酶免疫技术的标记酶酶来源ｐＨ催化活性（Ｕ／ｍｇ·３７℃）分子量显色底物测定波长（ｎｍ）过氧...

酶介导的邻近细胞标记方法探究细胞间相互作用

细胞-细胞相互作用(cell-cell interactions,CCIs)可以通过细胞表面蛋白质、聚糖、脂质等介导的细胞间突触形成而发生,以维持机体稳态和调控生理功能。这些CCIs是复杂的,涉及许多不同的细胞表面和细胞内分子的参与。随着基础研究和转化医学的不断发展,如何准确识别细胞间相互作用并对其进行表征和定量,引起了广泛关注。近年来,研究CCIs的技术手段不断推陈出新,而邻近标记是一种十分有前景的研究细胞间相互作用的化学生物学方法。目前,主要有两种类型的标记策略。一种是依赖基因工程操作,在“诱饵”细胞表面表达外源酶,通过其与相邻细胞上的受体底物的直接结合,以便发生细胞间邻近标记。另一种是使用酶或小分子催化剂(例如光催化剂),通过基因工程重组表达或借助化学(化学酶)方法将它们偶联在“诱饵”细胞表面,在适当的刺激或激活后,靶向递送感兴趣的标记分子,实现邻近标记。其中,酶介导的邻近细胞标记方法在检测和表征CCIs上具有重要的应用价值。该综述将标记过程中涉及有酶参与的方法定义为酶介导的邻近细胞标记方法,这种方法的一个明显优势是,由于酶和受体底物之间直接的物理接触或酶催化产生高反应活性标记分子而实现小的标记半径范围。该综述旨在归纳与总结近年来开发的酶介导的邻近细胞标记方法的原理、优缺点及现有应用。

基于衍生化3-氨基-2-恶唑烷酮的夹心酶联免疫分析

建立一种3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)夹心免疫检测方法。通过1,6-己二醇连接2-硝基-4-羧基苯甲醛和生物素合成针对AOZ的新型衍生试剂。在样品前处理时加入衍生试剂可对AOZ进行衍生,衍生产率为89%。在酶标板上包被抗AOZ单克隆抗体并以辣根过氧化物酶标记的亲和素或抗生物素抗体作为第二结合物可实现AOZ的夹心酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)。从实际应用的角度,得到双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下两个表位的极限距离,分别为12Å和13Å,理想距离分别为16Å和17Å。在双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下的检出限分别达到1.8 pg/mL和0.8 pg/mL(以AOZ质量浓度计),相对于竞争ELISA,其灵敏度最高提高了25倍。平均回收率为73%~85%,平均相对标准偏差为9.0%。

一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法

专利公开号:CN117607117A,申请人:四川大学,摘要:本发明提供了一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法。该方法的特点是利用荧光素标记酶蛋白,在水相介质中,标记酶蛋白、油、水在一定条件下充分接触,使脂肪酶在油水界面有效反应。

易文教授/朱强研究员团队提出高效标记和鉴定核心岩藻糖基化的新策略

2024年9月15日,浙江大学生命科学学院易文/朱强研究员团队与美国科学院院士Linda C. Hsieh-Wilson团队合作在《美国化学会志》(Journal of the American Chemical Society)在线发表了题为“Chemoenzymatic labeling,detection and profiling of core fucosylation in live cells”的研究论文(DOI:10.1021/jacs.4c09303)。该研究利用糖基转移酶1(GALT-1)的高度特异性以及对改造底物UDP-Gal-6-N3的适配性,实现了对核心岩藻糖基化修饰的高选择性和高灵敏度标记、荧光成像和富集等多功能检测。研究人员使用线虫来源的GALT-1作为酶标记方法的工具酶,设计并合成了带有叠氮基团的底物UDP-Gal-6-N3,并结合点击化学反应将荧光基团或生物素连接到核心岩藻糖基化修饰的蛋白上。

棉枯、黄萎病抗性的PPO同工酶标记鉴定

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测试分析了棉花萌动种子及棉株感病前后叶片的多酚氧化酶（ＰＰＯ）同工酶。结果表明，罹病反应中叶片ＰＰＯ同工酶谱的变化差异可作为鉴定抗枯、黄萎病大小的生化指标；棉花萌动种子ＰＰＯ同工酶在不同抗枯黄萎病品种间及品种内个体之间表达均存在多态性，确认了分别与抗枯萎病和抗黄萎病性状相关的两条标记酶带。根据这两条标记酶带频率的大小，可鉴定棉花品种（系）的抗性水平。同工酶测试分析后的种子经室内培养后在田间仍能正常生长，其标记酶带与田间抗病性表现一致，因而可作为筛选抗病品种的一种室内方法。

酶标仪在艾滋病血液检验中的应用分析

探讨酶标仪应用于检测艾滋病患者血液指标的价值。方法 选择本疾控中心在2022/7-2023/7间收治已确诊艾滋病的患者64例为研究对象,借助酶标仪与血液分析仪两种仪器对这些患者的血液进行检验,然后对比分析二者检验结果的准确度等有关指标。结论 酶标仪检测法应用下的阳性检出率指标、灵敏度指标和特异性指标均比血液分析仪的检测结果显著更高(P<0.05)。结论 在临床检测艾滋病患者中,采用酶标仪开展血液检测的特异性、准确度和灵敏度都显著更高,能够在临床开展推广与普及。

发光酶标记基因在微生物分子生态学研究中的应用

1 前言随着分子生物学向微生物生态学的渗透,微生物生态学的研究内容和水平正不断深化和提高,一门新的分支学科——微生物分子生态学也已日趋成熟[1]。对释放至环境中的遗传改良微生物(genetically modified microorganisms,简称GMMs)进行风险评估(risk assessment)、测量引入细菌在植物根部、叶面的定殖动态、容量或土壤中的群体数量则是微生物分子生态学的主要研究内容之一。但是,由于大多数细菌并不具有足以与同类土著细菌区分的特征而无法做到特异性的检测与回收。因此,通过遗传重组将外源基因(标记基因,marker gene)导入供试菌株,从而在检测或回收释放至土壤中的该种菌株时可以将其与同类土著细菌分开的方法(亦即标记基因技术)

部分烟草核心种质过氧化物同工酶标记分析

对40个不同类型烟草核心种质进行了过氧化物同工酶标记分析,结果表明,种间遗传差异是比较明显的,但多数品种间遗传差异不明显,这与过氧化物酶本身所能表达的遗传多样性有关,但也与实验环境控制及实验技术的掌握有关。40个种质的酶带可划分为13个种群,其中种群A、B和J包括较多的种质,3个野生种具有特异的谱型,种质间的遗传差异与栽培类型并无必然联系,主要取决于种质间演化关系。采用信息聚类法进一步将40个种质划分为3大聚类群,3个野生种分属3个不同聚类群,反映了与其它种质的亲缘关系。类群I包含种群A、C、D、M共17个种质;类群II包含种群B、E、F共9个种质;类群III包含种群G、H、I、J、K、L共14个种质。其聚类群的遗传差异以类群II最大,其次是类群I,类群III最小。

发光酶基因标记的荧光假单胞菌Xl6L2在小麦根圈的定殖动态

在土壤微宇宙系统内及田间土壤中,采用发光酶基因标记检测技术研究了荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens,简称Pf)Xl6L2在小麦根圈的定殖动态。研究结果表明:在不灭菌灰潮土微宇宙中,Pf·Xl6L2在小麦播种后36d定殖密度可达最高水平(32×104cfu.g-1根),然后开始下降,最后保持在一个相对稳定的较低水平(约32×102cfu.g-1根))。在田间条件下,Pf·Xl6L2通过种子表面接种在小麦根圈的定殖动态与微宇宙中的相似,可散布至种子下方10cm以内,水平移动距离在植物播种后125d不超过40cm。

金针菇杂交菌株的同工酶标记与菌株特性

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）法，利用酯酶同工酶谱和可溶性蛋白ＰＡＧＥ表型的差异，对金针菇的杂交后代作了遗传分析和鉴定。结果表明，金针菇杂交亲本及其后代的同工酶表型表现明显的多型性。４个杂交菌株的同工酶谱与其亲本有较明显的差异。２种生化（ＥＳＴ，ＰＲＯ）标记在杂交菌株中均表现有不同程度的遗传互补性，并有新的酶带产生。结合同工酶酶谱和标记杂合位点数目对杂种优势可进行早期预测和栽培验证。

等位酶标记快速鉴定杂交水稻种子初步研究

应用改进的淀粉凝胶同工酶电泳技术，对21种同工酶进行了分析，获得32个位点，47个等位酶基因，筛选出5个杂交水稻组合特异性等位酶标记，辅助标记鉴定标记9个，可对供试的9个杂交水稻组合进行真伪及纯度鉴定。应用该项技术每天每人可测定160个样品，每个样品检测成本在0．5元人民币左右。因此，应用等位酶标记适用于大样本量逐粒鉴定杂交水稻种子的真伪及纯度，并可初步区分混杂的原因，是一套可用于杂交水稻种子商业化鉴定的实用技术。

小麦根圈荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的发光酶基因标记

采用２亲本杂交的方法将Ｔｎ５－ｌｕｘＡＢ标记基因系统成功地转入了分离自小麦根圈的ＰＧＰＲ菌株荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｘｌ６菌株中。与亲本菌株相比，携有发光酶基因ｌｕｘＡＢ的标记菌株Ｘｌ６Ｌ２生理生化特征的变化很小，而且仍保留有在小麦根圈的定殖能力。Ｔｎ５－ｌｕｘＡＢ片段在Ｘｌ６Ｌ２中的稳定性很强，在没有卡那霉素选择压力的情况下，ｌｕｘＡＢ也能稳定表达。即使在４０℃温度下。

酶标记羊抗兔间接法检测烟草马铃薯Y病毒的研究

本文是对辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG间接法检测浸染烟草的马铃薯Y病毒（PVY）的报导。试验证明该方法检测烟草植株内的PVY具有特异性，健株对照及非PVY病毒均为阴性，检测烟草植株汁液的稀释度可达1／1000，在我们的测试条件下，第一抗血清浓度1／2000，测试抗血清（酶标记羊抗兔）浓度1／140为好。

利用同工酶标记水稻亲本遗传差异及其在杂交水稻育种中的利用

利用淀粉凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳显示的同工酶差异 ,分析 17个杂交水稻亲本、3个新株型株系和2 2个光壳稻、爪哇稻品种的遗传差异 ,研究光壳稻和爪哇稻及其与温带粳稻之间的关系 ,探索同工酶标记水稻亲本遗传差异在杂交稻育种中利用的可能性。在本研究中 ,8个同工酶 18个多态性位点至少在 2个基因型间存在差异。每个具有多态性的酶谱带分别以 1和 0记录存在与否 ,由同工酶数据计算的Nei’s遗传距离创建聚类树状图。聚类分析结果表明 ,籼稻和粳稻容易被分开 ,普通粳稻与光壳稻、爪哇稻混合聚在一起 ;光壳稻与爪哇稻之间的遗传距离要比它们与普通粳稻之间的遗传距离小。利用光壳稻、爪哇稻选育不同生态群方向的恢复系和不育系 ,已配组育成了强优势的杂交稻组合。

斑茅F2杂种选育与同工酶标记辅助选择

2000/01杂交季以甘蔗与斑茅属间杂交F1杂种崖城95-41 作母本,与父本CP57-614和川蔗57-416杂交,在二个组合后代实生苗中分别取13个单株进行过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶分析。结果表明,除1个单株为可疑后代外,其它均为斑茅的F2后代。过氧化物酶同工酶标记PxA6、PxA7和PxA9在斑茅F2中出现机率高,特别是PxA6和PxA7,其酶带清晰易辨,可作为F2后代辅助选择的工具。

酶标记鸡卵黄抗E.coli O157∶H7抗体的制备与特性研究

目的：研究制备特异性抗E.coli O157：H7鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）及酶标记抗体（IgY-HRP）的工艺条件。方法：分别用灭活菌体、脂多糖及O抗原多糖抗原免疫临产母鸡，水稀释法结合离子交换色谱分离提取IgY，再用过碘酸钠法和戊二醛法进行HRP标记，各种制品的分析用电泳及ELISA法。结果：可获得纯度为79．6％～85．3％的IgY，提取率74％～77％；过碘酸钠氧化法标记效果较好，IgY-HRP（1mg／ml）最高效价640。结论：免疫制备IgY方法可行，过碘酸钠法标记IgY-HRP取得良好效果。

利用发光酶基因标记技术跟踪棉花根圈中的绿针假单胞菌PL9L

采用细菌转化和杂交的方法，成功地将全套发光酶基因标记系统Ｔｎ７ｌｕｘＣＤＡＢＥ引入绿针假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）ＰＬ９，得到稳定的发光标记菌ＰＬ９Ｌ。采用发光菌落平板计数法和Ｘ射线胶片自显影法，通过盆栽试验和盒裁试验，研究了发光标记菌ＰＬ９Ｌ在棉花根圈的定殖动态和分布规律。盆栽试验结果表明，在灭菌土盆栽中，播种后６ｄ左右ＰＬ９Ｌ在棉花根圈的定殖水平达最高（３１×１０９ｃｆｕ／ｇ根土），播种后５６ｄ左右趋向稳定，ＰＬ９Ｌ数量为１７×１０２ｃｆｕ／ｇ根土；未灭菌土盆载中，播种后８ｄ左右ＰＬ９Ｌ的定殖水平达最高（１１×１０９ｃｆｕ／ｇ根土），４６ｄ左右趋向稳定，菌数为１４×１０２ｃｆｕ／ｇ根土。盒栽试验结果表明，ＰＬ９Ｌ可从种子向根尖方向扩散，但并不与根的伸长生长同步，播种后３６ｄ，灭菌土盒栽中ＰＬ９Ｌ可扩散至种子下方１２０ｃｍ以内，而未灭菌土盒栽中ＰＬ９Ｌ扩散至１１０ｃｍ以内。在棉花根尖区域均未检测到ＰＬ９Ｌ。

免疫组化双酶双标记和组织化学复合染色方法的探讨

免疫组化双酶双标记和组织化学复合染色方法的探讨赵秀兰，孙保存，林建韶，王欣，李薇，谭郁彬随着免疫组化技术的发展，已有可能在同一张切片上标记出不同的细胞成分，若与组织化学染色相结合，则可显示更多的细胞成分，为同时观察几种细胞的分布特点、相互关系提供了新...