Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞的提取与鉴别

背景:树突状细胞在未成熟阶段表现出极强的抗原吞噬功能,它可以在免疫耐受、癌症的免疫治疗等方面都表现出极大的优越性。但由于未成熟树突状细胞在生物体内含量极微,这就严重限制了它在临床、科研方面的应用。目的:提取鉴别Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞。方法:从Lewis大鼠骨髓中分离骨髓前体细胞,应用20 ng/mL粒细胞集落刺激因子、10 ng/mL白细胞介素4培养7 d诱导为未成熟树突状细胞,然后在未成熟树突状细胞中加入1μg/mL脂多糖继续培养2 d诱导为成熟树突状细胞。采用荧光倒置显微镜观察树突状细胞形态,流式细胞仪鉴定成熟和未成熟树突状细胞表面特异性分子,ELISA检测成熟和未成熟树突状细胞培养上清白细胞介素10、白细胞介素12和白细胞介素17A因子的分泌水平,混合淋巴细胞反应检测成熟和未成熟树突状细胞对T淋巴细胞的刺激反应。结果与结论:①普通荧光倒置显微镜下观察树突状细胞具有明显的突起结构;②流式细胞仪可见未成熟树突状细胞低表达CD40、CD86等共刺激分子;相反,成熟树突状细胞高表达上述共刺激分子;③未成熟树突状细胞的白细胞介素10、白细胞介素17A分泌水平要远高于成熟树突状细胞(P<0.01);未成熟树突状细胞的白细胞介素12分泌水平低于成熟树突状细胞(P<0.05);④成熟树突状细胞对T细胞的刺激明显比成熟树突状细胞强,当成熟树突状细胞与T淋巴细胞比例达到1∶10时刺激能力更强;⑤结果表明:Lewis大鼠骨髓前体细胞可以分化为树突状细胞,通过流式细胞鉴定、相关因子检测、混合淋巴细胞反应能够鉴别树突状细胞的成熟和未成熟状态。

麻黄附子细辛汤联合孟鲁司特钠对咳嗽变异性哮喘症状改善及外周血树突状细胞mDCs和pDCs水平的影响

目的分析麻黄附子细辛汤联合孟鲁司特钠对咳嗽变异性哮喘患儿症状改善及外周血髓样树突状细胞(myeloid dendritic cells,mDCs)和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDCs)及肺功能的影响。方法选取医院2019年1月—2020年12月收治的132例咳嗽变异性哮喘患儿作为研究对象。按随机数字表法分为两组,对照组66例,在常规雾化治疗基础上给予孟鲁司特钠治疗;观察组66例,在对照组基础上给予麻黄附子细辛汤治疗。检测两组患儿治疗前、治疗后1、2、3、4周外周血mDCs、pDCs及mDCs/pDCs数据变化、症状改善情况及肺功能的影响。随访1年观察复发情况。结果两组治疗前后外周血mDCs比例没有变化(P>0.05);两组治疗后外周血pDCs比例均持续下降(P<0.05),但观察组治疗后2周和3周外周血pDCs比例低于对照组(P<0.05);两组治疗后mDCs/pDCs比值升高(P<0.05),但观察组治疗后2周和3周的mDCs/pDCs比值高于对照组(P<0.05)。治疗4周后,观察组早晚的咳嗽评分低于对照组(P<0.05);治疗4周后观察组肺功能各指标优于对照组(P<0.05);随访1年后,病例均未脱落,观察组复发率4.55%(3/66)低于对照组15.15%(10/66)(P<0.05)。结论麻黄附子细辛汤联合孟鲁司特钠治疗咳嗽变异性哮喘,更能快速降低外周血pDCs比例、提升mDCs/pDCs比值,有助于快速纠正患儿体内Th1/Th2的失衡状态同时减轻临床症状、优化肺功能,预后较好。

活动性肺结核合并糖尿病患者血糖水平与树突状细胞亚群及T细胞亚群的相关性研究

目的研究活动性肺结核合并糖尿病患者血糖水平与树突状细胞(DCs)亚群及T细胞亚群的相关性。方法选取2020年1月至2022年1月惠州市中心人民医院接受诊治的200例患者为研究对象,按照病情分为单纯活动性肺结核患者(对照组)和活动性肺结核合并糖尿病患者(研究组),每组各100例。按照患者糖化血红蛋白(HbA1c)水平将研究组患者分为轻度高血糖组(10 mmol/L≤HbA1c<13.9 mmol/L)45例、中度高血糖组(13.9 mmol/L≤HbA1c<22 mmol/L)33例、重度高血糖组(HbA1c≥22 mmol/L)22例。比较每组患者血糖指标、DCs亚群、T细胞亚群、细胞因子水平,并分析不同血糖程度与DCs、T细胞亚群的相关性。结果四组患者各血糖指标比较为对照组<轻度高血糖组<中度高血糖组<重度高血糖组(P<0.05);DCs亚群(cDC1、cDC2、pDC)及T细胞亚群(CD4^(+)、CD8^(+)、CD3^(+))分布值比较为对照组>轻度高血糖组>中度高血糖组>重度高血糖组(P<0.05);四组患者各炎性细胞因子水平比较为对照组<轻度高血糖组<中度高血糖组<重度高血糖组(P<0.05);外周血DCs亚群、T细胞亚群分布情况与血糖水平呈负相关(P<0.05)。结论针对活动性肺结核合并糖尿病患者,不同血糖程度患者炎性细胞因子水平、DCs亚群及T细胞亚群分布情况不同,且DCs亚群及T细胞亚群分布情况与患者血糖水平呈负相关。

高迁移率族蛋白B1对树突状细胞表型、吞噬功能及ERK/JNK/P38 MAPK信号通路的影响

目的探究高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)对硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)诱导的树突状细胞(DCs)表型、吞噬功能及细胞外信号调节激酶(ERK)/氨基末端蛋白激酶(JNK)/丝裂原活化蛋白激酶P38抗体(P38 MAPK)信号通路的影响。方法分别以30、300、600μmol·L^(-1)IS干预人原代DC细胞24 h,分为Control组、IS-30组、IS-300组、IS-600组,通过流式细胞分析鉴定细胞表型并检测细胞吞噬功能;细胞经600μmol·L^(-1)IS干预24 h后加入1 mg·L^(-1)anti-HMGB1或经1 mg·L^(-1)HMGB1单独处理后分为Control组、IS组、HMGB1组、IS^(+)anti-HMGB1组,通过流式细胞分析鉴定细胞表型并检测细胞吞噬功能;Western blot和免疫荧光染色检测ERK/JNK/P38 MAPK信号通路相关蛋白表达。结果随IS浓度增加,CD83^(+)和CD86^(+)细胞数逐渐增加(P<0.01),DCs吞噬能力逐渐下降(P<0.01);与IS组相比,IS^(+)anti-HMGB1组的CD83^(+)和CD86^(+)细胞数明显减少(P<0.01),细胞吞噬能力增加(P<0.01)。此外,与Control组比较,IS或HMGB1组p-ERK/ERK、p-P38/P38、p-JNK/JNK的蛋白表达升高(均P<0.01);与IS组相比,IS^(+)anti-HMGB1组p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK的蛋白表达降低(均P<0.01)。结论拮抗HMGB1可抑制IS诱导的DCs表型及成熟并抑制ERK/JNK/P38 MAPK信号通路激活。

健脾益肠散对TNF-α诱导的树突状细胞NLRP3炎症小体信号通路表达的影响

目的观察健脾益肠散对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的树突状细胞(DCs)NLRP3炎症小体信号通路相关蛋白表达的影响,探讨其治疗溃疡性结肠炎的作用机制。方法分离培养C57BL/6小鼠原代DCs,分为正常组、模型组、阴性对照组、阳性药组和中药组,TNF-α诱导构建DCs炎症微环境模型,各组分别予相应处理后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,免疫荧光、Western blot分别检测DCs核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1)蛋白表达,Western blot、RT-PCR分别检测DCs白细胞介素(IL)-1β、IL-18蛋白和mRNA表达。结果与正常组比较,模型组DCs增殖能力显著下降(P<0.01),细胞NLRP3、ASC、Caspase-1阳性表达显著升高,NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达及IL-18、IL-1βmRNA表达显著升高(P<0.01);与模型组和阴性对照组比较,阳性药组和中药组DCs增殖能力显著上升(P<0.01),细胞NLRP3、ASC、Caspase-1阳性表达显著降低(P<0.01),NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),IL-1β、IL-18mRNA表达显著降低(P<0.01),且中药组细胞增殖能力、Caspase-1阳性表达、IL-18 mRNA表达均明显高于阳性药组(P<0.05),IL-1βmRNA表达明显低于阳性药组(P<0.05)。结论健脾益肠散能抑制TNF-α诱导的DCs炎性反应,其治疗溃疡性结肠炎作用机制可能与调控NLRP3炎症小体信号通路NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β表达有关。

鸭骨髓源树突状细胞的诱导培养及功能分析

旨在建立鸭骨髓源树突状细胞(DC)体外诱导培养方法,分析DC基本生物学功能。在无菌条件下分离鸭骨髓单核细胞,优化粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)工作浓度,在体外进行诱导培养,然后通过形态学观察、吞噬活性检测、表面标志物流式鉴定、分泌细胞因子和刺激淋巴细胞增殖能力的测定,对制备的DC进行形态和生物功能评价。结果:添加20 ng/mL的IL-4和40 ng/mL的GM-CSF可以诱导出高吞噬活性的DC,诱导培养后3 d可见菱形、有纤突的细胞;经脂多糖(LPS)刺激成熟的DC,呈现典型的树突状结构,细胞表面CD11c、CD80和MHCⅡ分子表达量分别为80.08%、81.27%和91.47%;DC培养体系中白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)分泌量随着培养时间延长而增加,并在成熟后分泌量显著升高(P<0.05);CCK-8法检测结果显示成熟后的DC以1∶5比例与淋巴细胞混合培养,能够显著刺激淋巴细胞增殖。本试验成功建立鸭骨髓源DC体外诱导培养方法,制备细胞具备了树突状细胞的基本生物学功能。

肝脏滤泡树突状细胞肉瘤的MRI特征

目的:探讨肝脏滤泡树突状细胞肉瘤(FDCS)的MRI特征。方法:回顾性分析7例经手术及病理证实的肝脏FDCS的术前MRI表现特征。MRI图像分析包括观察病灶部位、大小、形态、边缘、病灶内囊变、出血、脂肪,平扫信号、强化方式和其他伴随征象,有无肝包膜回缩,邻近胆管有无扩张、肝门区及腹膜后有无淋巴结转移等征象。结果:7个病灶均为肝内单发类圆形或椭圆形病灶,边缘清晰光滑,肿瘤实性部分T1WI呈低信号,T2WI呈高信号,DWI呈高信号,ADC图实性部分呈低或稍低信号,2个病灶表现为信号均匀的实性肿块,5个病灶为实性肿块伴有不同程度的囊变,其中1个病灶囊变明显,并见出血。动态增强扫描5个病灶表现为“速升平台型”模式;2个病灶表现为“速升缓降型”模式;1个病灶周围异常灌注,2个病灶见延迟强化的包膜;1个病灶周围胆管轻度扩张,所有病例肝门区及腹膜后未见肿大淋巴结。结论:肝脏FDCS的MRI表现有一定的特征,多表现为边界清楚的肿块,常伴有不同程度囊变,实性部分信号均质,动脉期均呈明显强化,多数表现为明显持续强化。

肝癌患者外周血中抑制树突状细胞分化的蛋白成分筛选及鉴定

目的肝癌患者外周血中靶向抑制树突状细胞分化成熟的蛋白成分筛选及鉴定。方法利用免疫磁珠分选健康人外周血CD14^(+)单核细胞,诱导分化为未成熟的树突状细胞(iDCs),进一步诱导分化为成熟的树突状细胞(mDCs),鉴定iDCs纯度。酶切健康人和肝癌患者血清孵育的iDCs的结合蛋白,回收酶切后的多肽,筛选对iDCs分化成熟有潜在调控作用的互作候选蛋白。靶向鉴定差异候选蛋白。构建过表达蛋白质粒,转染至正常肝细胞(HL7702),将细胞培养上清液与iDCs共同培养,诱导iDCs成熟,对特异性抑制iDCs成熟的肝癌源性血清蛋白进行特异性筛选和鉴定。结果TNF-α诱导前抗原标志物阳性细胞表达CD86^(+)比例为79.2%、黏附分子CD40^(+)比例为83.3%、MHC-Ⅱ抗原分子HLA-DR^(+)比例为67.6%、CD83^(+)比例为5.5%以及CD1a^(+)比例为13.7%,符合iDCs的抗原表型特征;TNF-α诱导后抗原标志物阳性细胞表达CD86^(+)比例为92.0%、CD40^(+)比例为89.0%、HLA-DR^(+)比例为68.3%、CD83^(+)比例为37%、CD1a^(+)比例为48.3%,提示iDCs已迅速分化成熟为mDCs,符合mDCs的抗原表型特征。初步确认40多种对iDCs分化成熟有潜在调控作用的互作候选蛋白。选择10种差异候选蛋白,对其过表达进行验证,显示AFP蛋白、AGXT蛋白、ATP1A1蛋白过表达能够明显抑制iDCs分化成熟为mDCs。结论共筛选出10种靶向抑制树突状细胞分化的肝癌外周血清蛋白,其中AFP蛋白、AGXT蛋白、ATP1A1蛋白能够显著抑制树突状细胞分化成熟。

补中益气汤含药血清对树突状细胞VDR甲基化及PI3K-AKT-mTOR通路的影响

目的补中益气汤对树突状细胞(dendritic cells,DCs)免疫耐受机制的体外研究。方法小鼠树突状细胞株于体外进行培养,分为空白对照组(A组)、中药组(B组)、维生素D组(C组)、中药+维生素D组(D组)、中药+LY组(E组)、维生素D+LY组(F组)、中药+VitD+LY组(G组)。以15%含药血清,10μmol·L-1维生素D、1.5μmol·L-1LY294002(PI3K阻滞剂)分别干预7组细胞,于培养箱中分别培养24、48 h后,BSP法检测树突状细胞维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)基因DNA甲基化情况;ELISA法检测细胞上清液中VDR、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的含量;流式细胞术检测细胞共刺激分子CD40、CD80、CD86、主要组织相容性复合物-Ⅱ(major histocom-patibility complex,MHC-Ⅱ)的表达水平;Western Blot、qPCR检测各组细胞PI3K-AKT-mTOR通路mRNA及蛋白情况。结果(1)中药及维生素D干预后,DCs上VDR的表达增多(P<0.001或P<0.05),VDR基因DNA甲基化情况显著降低(P<0.05)。(2)中药及维生素D能够提高DCs上清液中IL-10含量(P<0.05或P<0.001),阻滞剂作用后,DCs分泌IL-10的功能均降低(P<0.05或P<0.001)。(3)中药及维生素D能够降低DCs表面因子CD40、CD80、CD86及MHCD-Ⅱ的表达(P<0.05或P<0.001),阻滞剂作用后,CD40、CD80、CD86及MHCD-Ⅱ表达均提高(P<0.001)。(4)Western Blot、qPCR结果显示,中药及维生素D能够升高DCs PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达(P<0.05或P<0.001),抑制剂作用后,PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白水平均下降,其中磷酸化蛋白降低显著(P<0.001)。(5)24 h与48 h两个时间点并未见明显差异(P>0.05)。结论补中益气汤通过抑制DCs VDR基因DNA甲基化,激活PI3K-AKT-mTOR通路,使其维持免疫耐受状态。

新抗原脉冲树突状细胞疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用

新抗原脉冲树突状细胞疫苗(Neo-DCVac)是一种新型肿瘤免疫治疗手段。新抗原是指肿瘤细胞突变产生的具有较强免疫原性和肿瘤特异性的肽段。Neo-DCVac是基于新抗原被树突状细胞摄取、加工后递呈并激活T细胞引发机体免疫反应,从而发挥抗肿瘤作用。在高通量测序基础上发展而来的个体化Neo-DCVac有望成为肿瘤精准免疫治疗的新方向。本文从个体化Neo-DCVac构建、在实体瘤中联合治疗的临床应用、适宜接种人群和目前存在的局限性等方面进行综述,旨在为肿瘤免疫治疗的相关研究提供参考。

单细胞测序揭示心脏移植物中树突状细胞和B细胞的抗原提呈特性

目的探讨心脏移植物中树突状细胞(DC)和B细胞的抗原提呈特性。方法将BALB/c小鼠的心脏移植到C57BL/6J小鼠腹腔内,术后5 d(急性排斥反应早期)提取并流式分选心脏移植物中的CD45+细胞,进行单细胞RNA测序。以心脏移植物中的DC和B细胞的亚群为主要对象,通过生物信息学分析和流式细胞术,研究其在心脏移植后变化趋势、抗原提呈能力及其与T细胞之间的胞间通讯情况。采用基因本体(GO)功能富集差异分析佐证细胞亚群特异性功能和细胞亚群注释可信度。结果生发中心样B细胞(GC-L B)是急性排斥反应期心脏移植物中增幅最大、比例高达87%的B细胞亚群,经典DC(cDC)2是心脏移植急性排斥期间唯一大量增多的DC亚群,占44%,是心脏移植后与T细胞的胞间通讯中占据最高通讯强度的DC亚群;单核样DC(moDC)与记忆性B细胞(MBC)是未心脏移植中T细胞输入信号的主要发出者,而在心脏移植后急性排斥反应期中,转变为cDC2与GC-L B;其中MBC与GC-L B分别是心脏移植前后的主要T细胞输入信号来源。结论在未移植心脏和移植心脏指向T细胞的胞间通讯中,与DC相比,B细胞均占据更高的通讯数量和权重,推测在心脏移植急性排斥反应早期,B细胞的抗原提呈活动比DC更加活跃,强度更大。

单细胞RNA测序联合实验验证树突状细胞在慢性阻塞性肺疾病中的核心基因

目的 单细胞RNA测序(scRNA-Seq)联合实验验证树突状细胞在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的核心基因。方法从基因表达数据集(GEO)数据库下载单细胞数据GSE173896和芯片数据GSE38974。GSE173896进行质控、批次矫正、降维聚类、细胞类型注释及组间树突状细胞差异表达基因(DC-DEG)鉴定。GSE38974差异分析得到的差异基因(DEG)与DC-DEG取交集获取共有DC-DEG,评估共有DC-DEG对COPD的诊断效能和共有DC-DEG富集分析及其与GSE38974免疫细胞浸润中激活的树突状细胞(DC)、浆细胞样树突状细胞(pDC)和Th17细胞的相关性。肺气肿小鼠模型肺组织对共有DC-DEG的mRNA表达量进行实验验证。结果 GSE173896得到组间DC-DEG 18个,GSE38974得到646个DEG,两者取交集得到3个DC-DEG,包括白细胞介素1受体拮抗剂(IL1RN)、 S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100A9,曲线下面积(AUC)值分别为0.841、 0.804和0.966。基因本体论分析(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)主要富集于慢性炎症反应、含胶原蛋白的细胞外基质、晚期糖基化终产物受体(RAGE)结合、 Toll样受体(TLR)结合、白细胞介素17(IL-17)信号通路等。IL1RN、 S100A8和S100A9均与激活的DC、 pDC及Th17细胞呈正相关。实验验证结果显示肺气肿小鼠肺组织IL1RN、 S100A8和S100A9的mRNA相对表达量上调。结论 IL1RN、 S100A8和S100A9可能是DC在COPD发病机制中的核心基因,为后续COPD的免疫治疗提供潜在靶点和理论依据。

健脾益肠散对TNF-α处理树突状细胞炎症因子水平及共刺激分子CD40表达的影响

目的:观察健脾益肠散对肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理的树突状细胞(DC)炎症因子水平及其刺激分子CD40表达的影响。方法:原代分离、培养C57BL/6小鼠DC细胞,采用流式细胞术对DC的主要标记物CD11c进行鉴定,并将培养的DCs随机分为正常组、模型组、阴性对照组、阳性药组及受试药组,TNF-α处理细胞构建DC炎症微环境模型,各组给予不同处理后,于倒置荧光显微镜下观察各组DCs的形态,采用CCK-8检测细胞的增殖能力,采用ELISA法检测各组DC培养上清液中CD40、IL-1β及IL-18含量,采用Western blot及RT-PCR技术分别检测各组DCs中CD40的蛋白和mRNA表达水平。结果:分离纯化的DC的CD11c表达率为85.1%,与正常组比较,模型组DC培养上清液中CD40、IL-1β及IL-18的含量、细胞中CD40的蛋白及其mRNA表达均明显增多,而增殖能力显著下降(P<0.01);受试药组DC培养上清液中CD40、IL-1β及IL-18的含量、CD40的蛋白及其mRNA表达减少,且细胞增殖能力上升,与模型组及阴性对照组相比较皆有统计学意义(P<0.01)。结论:健脾益肠散对TNF-α处理的DCs共刺激分子CD40的蛋白和mRNA表达及炎症因子的含量具有明显的抑制作用,可能是其发挥免疫耐受作用治疗溃疡性结肠炎的重要机制之一。

儿童母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤1例

母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm,BPDCN)属于造血组织来源的一种恶性肿瘤,其患病率在人群中的占比约为0.04/10万,且多发于老年男性[1]。患者常表现出皮肤病变,并可伴有骨髓、中枢、淋巴结等多部位侵犯。该疾病进展较快,预后不佳,但由于其症状缺乏特异性容易被误诊,且目前尚无标准化的治疗方案,在临床诊治方面存在一定的困难。本研究介绍了1例发生于儿童的BPDCN病例,分析其细胞免疫表型特点,并就该疾病的治疗和预后方面展开讨论,以期为临床提供参考。

耐受性树突状细胞在肝移植免疫耐受中的作用研究进展

肝移植术后排斥反应严重影响受者生存,长期应用免疫抑制药是预防排斥反应的重要手段,但其存在毒性作用,以及会增加全身感染、肿瘤复发等不良事件的风险。因此,在成功肝移植手术之前,如何对受者实施个体化免疫耐受诱导,实现术后免疫抑制药完全或早期撤退,仍然是器官移植工作者不断探索的研究方向。近年来,耐受性树突状细胞诱导肝移植免疫耐受的机制研究取得了一些新的进展,临床试验初显成效。本文就耐受性树突状细胞的特征、参与重塑肝脏免疫微环境的机制及其诱导肝移植免疫耐受基础研究与临床应用进展进行综述,以期为耐受性树突状细胞在肝移植免疫耐受中的应用研究提供参考。

蛋白C受体(PROCR)在全葡聚糖颗粒(WGP)诱导小鼠骨髓来源树突状细胞成熟中的作用

目的探究蛋白C受体(PROCR)在全葡聚糖颗粒(WGP)作用下对小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)成熟过程及其免疫相关功能的调控效应。方法从NCBI的基因表达数据集(GEO)数据库中下载GSE2197数据集,随后通过深入分析该数据集的芯片数据,识别并获得了差异表达基因(DEG)。从免疫学数据库和分析门户网站(IMMPORT)数据库中下载并整理与免疫功能相关的基因,与DEG取交集得到免疫相关的差异基因。通过运用专门的R包等生物信息学算法,成功识别了关键基因并解析了相关的信号通路。实时定量PCR检测BMDC经WGP刺激前后的差异基因。在体外实验中,从小鼠的胫骨和腓骨中抽取骨髓,并利用FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)诱导这些骨髓细胞分化成BMDC。经过诱导后,对这些BMDC进行转染处理,并随后使用WGP进行刺激。为了评估BMDC的免疫表型,利用流式细胞术分析了细胞表面分子CD40、CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅰ/Ⅱ(MHC-Ⅰ/Ⅱ)以及程序性死亡蛋白1配体1(PD-L1)的表达情况。此外,为了探究BMDC的免疫调节功能,利用ELISA技术检测了BMDC上清液中细胞因子白细胞介素12p40(IL-12p40)、IL-6、IL-10的分泌含量。在T细胞实验中,我们利用OT-Ⅰ和OT-Ⅱ小鼠的淋巴结和脾脏,通过磁珠分选试剂盒成功分离出CD8^(+)和CD4^(+)T细胞。随后,我们将这些T细胞与特异性抗原卵清蛋白(OVA)以及之前制备的BMDC进行共培养。最后,利用流式细胞术检测了T细胞的增殖与分化情况,以评估BMDC在抗原特异性T细胞反应中的作用。结果经过分析WGP诱导的与CpG(GSE2197)刺激的BMDC的差异基因,与IMMPORT数据库中的免疫基因取交集,筛选到PROCR基因。数据显示敲低PROCR基因后,经WGP激发的BMDC的表面分子MHC-Ⅰ明显降低,细胞因子IL-10的分泌显著增多;其驱使CD8^(+)T细胞产生γ干扰素(IFN-γ)的能力明显减弱。结论在WGP诱导BMDC成熟的过程中,PROCR对MHC-Ⅰ的表达以及IL-10的分泌具有调控作用,进而调节BMDC诱导CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞增殖与分化的功能。

树突状细胞在多发性硬化免疫治疗中的应用

树突状细胞是机体功能最强的专职抗原呈递细胞,基于其亚型和环境信号在诱导炎症或耐受性免疫反应中起关键作用。树突状细胞对于多发性硬化的发生和疾病进展至关重要。在多发性硬化动物模型和早期临床试验中,诱导耐受性树突状细胞具有强大的治疗潜力。与体外诱导耐受性树突状细胞相比,特异性靶向其表面受体的体内诱导策略表现出更大的前景和优势。本文总结树突状细胞在调节免疫耐受和多发性硬化发生和进展中的作用,并对有潜力作为靶点的树突状细胞表面特异性受体进行梳理,以为耐受性免疫治疗多发性硬化提供新的靶点和策略。

Luts法制备鹅骨髓源树突状细胞及其初步鉴定

为制备鹅骨髓源树突状细胞(Dendritic cells,DCs),试验采用改良的Luts方法经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)协同诱导骨髓单个核细胞分化成为DCs,通过形态观察、表面标志鉴定以及特征性生物功能分析初步鉴定培养获得的DCs。结果显示,培养至第10天细胞表面刺突、伪足明显,细胞集落生长,呈现典型树突状细胞形态;RT-qPCR检测到DCs成熟后表面标志物CD40、CD80和CD86转录水平的上调;培养至第8~10天细胞吞噬能力逐步达到峰值,至第12天细胞培养上清中IL-2和IFN-γ含量分别为(92.39±5.13)pg/mL和(1345.68±76.84)pg/mL;制备的DCs作为刺激细胞与淋巴细胞以1∶5混合培养时能显著刺激淋巴细胞增殖(P<0.05)。研究表明在体外成功诱导培养出鹅骨髓源DCs,制备的细胞表现出体内DCs所具备的部分生物学特性。

补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎小鼠脾脏树突状细胞免疫耐受状态的量效研究

目的研究补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)小鼠脾脏树突状细胞(Dendritic cells,DCs)免疫耐受状态的影响及其量效关系。方法选取90只6^8周龄SPF级雌性NOD.H-2^(h4)小鼠,随机分为正常(NC)组、对照(AIT)组、补中益气汤高剂量(BZH)组、补中益气汤中剂量(BZM)组、补中益气汤低剂量(BZL)组、亚硒酸钠(SS)组,共6组,每组15只。BZH组每日予以16.38 g·kg^(-1)补中益气汤灌胃,BZM组每日予以8.19 g·kg^(-1)补中益气汤灌胃,BZL组每日予以4.10 g·kg^(-1)补中益气汤灌胃,SS组每日予以0.26 mg·kg^(-1)亚硒酸钠片灌胃,NC组及AIT组每日予以等体积蒸馏水灌胃,连续灌胃8周后,HE染色检测各组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润情况;ELISA检测各组小鼠血清中甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin antibody,TgAb)、TSH及脾脏IL-10水平;流式细胞术检测各组小鼠脾脏树突状细胞表面MHC-II及CD80、CD86、CD40分子表达,以及脾脏Th17/Treg细胞比例。结果(1)HE染色可见AIT组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润显著,各治疗组甲状腺淋巴细胞浸润情况均有所恢复,其中BZM组小鼠每日灌胃8.19 g·kg^(-1)补中益气汤效果最为显著。(2)Elisa检测各组小鼠血清TgAb、TSH水平发现,AIT组小鼠血清TgAb较NC组显著升高,其余各治疗组均能够降低小鼠血清TgAb水平,其中BZH组效果最为明显,但BZH组与BZM剂量组之间差异没有统计学意义;与NC组相比,其余组小鼠血清TSH均有所升高,但各组间差异没有统计学意义。(3)AIT组小鼠脾脏IL-10分泌较NC组降低,其余各治疗组均能够升高脾脏IL-10的分泌水平,与TgAb结果相似,BZH组效果最为明显,但BZH组与BZM组之间差异没有统计学意义。(4)AIT组小鼠较NC组比较脾脏DCs表面因子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ表达升高,脾脏T细胞Th17/Treg水平升高,各治疗组脾脏DCs表面因子水平降低,Th17/Treg水平降低。结论补中益气汤能够降低AIT小鼠甲状腺自身抗体水平,改善甲状腺组织病理损伤,降低DCs表面CD80、CD86、CD40及MHC-II的表达,促进IL-10的分泌,维持Th17/Treg轴平衡,延缓AIT发生。推荐小鼠最佳灌胃剂量为9.18 g·kg^(-1)。

培养时间对小鼠树突状细胞及其外泌体免疫相关膜蛋白的影响

目的明确培养时间对树突状细胞及其外泌体免疫相关膜蛋白(CD80、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)的影响,为今后相关研究提供实验依据。方法小鼠骨髓细胞经重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化成树突状细胞,再加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导为成熟树突状细胞;超速离心法提取外泌体;蛋白印迹法和Amnis量化成像流式细胞仪对外泌体进行鉴定;Amnis量化成像流式细胞仪检测小鼠树突状细胞以及树突状细胞外泌体膜上免疫相关蛋白CD80、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达情况。结果体外培养第5天后,约50%以上的树突状细胞表达CD80、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ,第13天达最高水平,其中CD80阳性率为(97.29±0.63)%,CD11c阳性率为(92.31±1.18)%,MHC-Ⅰ阳性率为(97.91±0.49)%,MHC-Ⅱ阳性率为(97.91±0.49)%,差异具有统计学意义(P<0.001)。第13天后逐渐减少,至第30天,仍有约80%的树突状细胞表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ免疫分子。外泌体膜上CD80、CD11c、和MHC-Ⅱ表达水平以第5天最高,然后随培养时间延长,总体呈下降趋势,除外MHC-Ⅰ分子,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论体外培养的小鼠树突状细胞表达较高的免疫相关膜蛋白,在合适的培养条件下可长时间稳定维持。其分泌的外泌体表面也携带有丰富的免疫相关膜蛋白,但树突状细胞与外泌体膜表面的免疫相关蛋白未发现明显相关性。