小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段CLEC7A-p IRES2-EGFP重组到中间载体p DONR221上,再与腺病毒骨架质粒p AD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,收获重组腺病毒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组(Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011IU/m L,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。

基于CRISPR-Cas9构建树突状细胞相关C型凝集素-1基因敲除小鼠模型

目的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建树突状细胞相关C型凝集素-1(Dectin-1)基因缺失小鼠模型,研究Dectin-1基因缺失对小鼠肿瘤生长的影响。方法通过CRISPR-Cas9基因编辑技术设计靶向目的基因的sgRNA实现Cas9蛋白对DNA双链的特异性切割。将体外转录纯化得到的sgRNA和ssDNA并与Cas9混合后,通过显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内并经胎盘移植到代孕小鼠体内,获得F0代小鼠。F0代小鼠通过基因鉴定和DNA测序获得Dectin-1基因缺失阳性子代小鼠。最后构建野生型与Dectin-1敲基因小鼠的肿瘤模型,经β-葡聚糖治疗后,观察两组小鼠的肿瘤生长情况。结果利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功敲除C57BL/6野生型小鼠的Dectin-1基因。PCR技术及DNA测序进一步显示Dectin-1基因部分碱基缺失,功能实验显示Dectin-1敲基因小鼠口服β-葡聚糖后肿瘤生长速度高于对照组小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Dectin-1基因敲除小鼠模型,验证了Dectin-1对β-葡聚糖抗肿瘤的影响,为进一步研究Dectin-1基因在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。

Dectin-1对侵袭性肺曲霉病大鼠半乳甘露聚糖、胸腺细胞凋亡及肺损伤的影响

目的:探究树突状细胞相关性C型凝集素-1(Dectin-1)对侵袭性肺曲霉病大鼠半乳甘露聚糖(GM)、胸腺细胞凋亡及肺损伤的影响。方法:大鼠随机分为对照组、Ad-EGFP组和Ad-Dectin-1-EGFP组。检测大鼠肺功能(肺容积变换、静息通气量);ELISA法检测大鼠肺泡灌洗液中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)含量和血清中GM含量;H-E染色观察肺组织病理学变化;检测胸腺指数;TUNEL检测胸腺细胞凋亡;免疫印迹检测肺组织中Dectin-1、T-bet、GATA-3蛋白表达。结果:与对照组相比,Ad-EGFP组大鼠IFN-γ含量、胸腺指数、肺容积变换和静息通气量均明显降低,IL-4含量、GM值、胸腺细胞凋亡指数明显升高;与Ad-EGFP组相比,Ad-Dectin-1-EGFP组大鼠IFN-γ含量、胸腺指数、肺容积变换和静息通气量均明显升高,IL-4含量、GM值、胸腺细胞凋亡指数明显降低。与对照组相比,Ad-EGFP组大鼠肺组织中Dectin-1、T-bet蛋白表达明显降低,GATA-3蛋白表达明显升高;与Ad-EGFP组相比,Ad-Dectin-1-EGFP组大鼠肺组织中Dectin-1、T-bet蛋白表达明显升高,GATA-3蛋白表达明显降低。结论:Dectin-1重组质粒可减轻侵袭性肺曲霉病大鼠肺损伤,降低血清中GM值,通过抑制胸腺细胞凋亡维持体内免疫功能平衡,其机制可能与T-bet、GATA-3蛋白表达有关。

Fonsecaea monophora对巨噬细胞TLR2、TLR4、Dectin-1和TNF-α表达的影响

目的探讨F.monophora对巨噬细胞模式识别受体TLR2、TLR4及Dectin-1的表达及介导炎症因子TNF-α分泌的影响。方法 F.monophora分生孢子突变株(色素株,CBS122845)及白化突变株(CBS125149)菌液分别与小鼠巨噬细胞(RAW264.7)共培养,RAW264.7巨噬细胞作为阴性对照。采用Real Time PCR检测各组TLR2、TLR4、Dectin-1和下游信号分子MyD88、NF-κB mRNA的表达情况,流式细胞术检测TLR2、TLR4、Dectin-1蛋白的表达水平,ELISA法检测培养上清中TNF-α因子的分泌情况。结果与对照组比较,CBS122845和CBS125149组中巨噬细胞TLR2、TLR4、Dectin-1和MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白表达量均升高;与CBS125149比较,CBS122845组中TLR2的mRNA和蛋白的表达量无明显变化,而TLR4、Dectin-1和MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白的表达量升高更明显;与对照组比较,CBS122845组培养上清TNF-α因子的分泌量明显减低,CBS125149组TNF-α因子的分泌量明显升高。结论 TLR2、TLR4、Dectin-1这三个模式识别受体可能共同参与巨噬细胞对F.monophora的识别过程,并可激活下游信号分子MyD88和NF-κB;且CBS122845可以通过抑制TNF-α分泌来抑制炎症反应,维持菌体在巨噬细胞中的长期生存和繁殖。

模式识别受体树突状细胞相关C型凝集素1在免疫调节中的作用

树突状细胞相关C型凝集素1(Dectin-1)是模式识别受体(PRRs)家族重要的组成之一,在抗真菌的固有免疫中发挥了重要作用,而且还能和β-葡聚糖特异性结合通过诱导胞内信号传导而介导多种细胞反应。本文将对Dectin-1的结构、信号通路、与其他受体的相互作用和在固有免疫和适应性免疫调节方面的作用予以综述。

Dectin-1、CARD9基因在角质形成细胞对红色毛癣菌应答中的作用

目的研究树突状细胞相关性C型凝集素-1(Dectin-1)和胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)基因在角质形成细胞对红色毛癣菌应答中的作用。方法将红色毛癣菌与正常HaCaT细胞、Dectin-1、CARD9基因敲除HaCaT细胞共培养,用ELISA分析其细胞上清液中IL-6、IL-8的表达情况。结果Dectin-1基因敲除导致HaCaT细胞IL-6和IL-8基础分泌明显增加,敲除CARD9基因导致HaCaT细胞IL-6基础分泌增加(P<0.05)。在红色毛癣菌的刺激下,和未感染相比,HaCaT细胞分泌的IL-8明显减少(P<0.05);Dectin-1基因敲除的HaCaT细胞则表现为IL-6、IL-8分泌量明显减少(P均<0.05);CARD9基因敲除的HaCaT细胞的IL-6、IL-8分泌则无明显变化(P均>0.05)。结论Dectin-1基因和CARD9基因可能参与了维持表皮免疫稳态,CARD9基因还可能介导了红色毛癣菌引起的免疫应答。

Dectin-1/Syk信号通路介导脂多糖诱导的BV2细胞中的炎症反应

目的探讨脂多糖(LPS)诱导BV2细胞神经炎症反应中树突状细胞相关C型凝集素1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)及其下游脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)信号通路发挥的作用。方法采用LPS建立BV2细胞炎症模型。将BV2细胞分为对照组、LPS 3 h组、LPS 6 h组、LPS 12 h组和LPS 24 h组,然后用免疫印迹法检测Dectin-1,Syk和p-Syk的表达,随后选出LPS最佳刺激时间。根据LPS最佳刺激时间,再将BV2细胞分为空白对照组、对照+LAM组、对照+PIC组、LPS组、LPS+LAM组和LPS+PIC组;用免疫印迹法检测Dectin-1、p-Syk、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和一氧化氮合酶(iNOS)的表达,观察抑制Dectin-1和Syk对促炎因子表达的影响。结果与对照组相比,LPS诱导3,6,12,24 h组Dectin-1,Syk和p-Syk蛋白在BV2细胞中的表达均增加,且在24 h表达量最高(P<0.05)。与空白对照组比较,对照+LAM组和对照+PIC组中各蛋白表达无明显差异(P>0.05);与LPS组相比较,LPS+LAM组Dectin-1,p-Syk,TNF-α和iNOS的蛋白表达明显下调(P<0.05)。类似的,与LPS组比较,LPS+PIC组TNF-α和iNOS的蛋白表达也明显下调(P<0.05)。结论Dectin-1/Syk信号通路可作为治疗神经炎症反应的潜在靶点。

DC-SIGN基因在阿萨希毛孢子菌小鼠皮肤感染时的表达与调控

目的了解树突细胞C型凝集素(DC-SIGN)是否参与了皮肤毛孢子菌感染过程中的免疫应答。方法25只BALB/C小鼠备皮后皮下接种3.2×107cfu/ml的阿萨希毛孢子菌悬液,分别于接种后1、3、7、14d处死小鼠,切取皮损,RT-PCR检测皮肤毛孢子菌感染过程中DC-SIGN mRNA的表达,基因芯片技术观察免疫相关基因的改变。结果皮下接种后3、7、14d接种侧皮肤组织标本可扩增出DC-SIGN目的片段,而未接种侧皮肤组织标本均未扩增出DC-SIGN目的片段。补体C2、前列腺素EP4受体、肿瘤坏死因子诱导蛋白cg12-1(CG12-1)、干扰素诱导蛋白(Ifit3)、淋巴细胞抗原6复合物、CD53抗原、CD22抗原等下调。结论DC-SIGN参与了皮肤毛孢子菌的感染过程,它不仅抑制Th1型细胞免疫,而且可抑制前列腺素EP4受体及部分补体因子等,从而导致皮肤毛孢子菌感染的慢性化。

Dectin-1受体信号通路研究进展

β-葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分,近年研究发现,树突状细胞相关性C型植物凝集素-1(dectin-1)受体可作为真菌的主要模式识别受体,通过对β-葡聚糖的识别及信号转导,诱导机体产生一系列的细胞因子和趋化因子,启动免疫功能。Dectin-1受体广泛分布于单核巨噬细胞系统、树突状细胞及中性粒细胞等。本文主要对Dectin-1受体的结构、作用机制和信号通路进行综述。

慢性化脓性中耳炎真菌感染危险因素及与Dectin-1基因多态性的关联

目的 分析慢性化脓性中耳炎真菌感染危险因素及与树突状细胞相关C型凝集素-1(Dectin-1)基因多态性的关联。方法 回顾性分析2017年8月-2021年8月嘉兴市第二医院收治的慢性化脓性中耳炎患者100例病例资料,根据是否感染真菌分为感染组38例和非感染组62例。比较两组患者临床一般资料,采用Logistic多因素回归分析慢性化脓性中耳炎发生真菌感染的危险因素,采用流式细胞仪检测外周血CD_(3)^(+)、CD_(4)^(+)、CD_(8)^(+)和CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)比值,免疫比浊法检测患者血清免疫球蛋白(Ig)G、IgA、IgM,限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测Dectin-1基因型分布。结果 慢性化脓性中耳炎合并真菌感染患者年龄>60岁比例、既往存在中耳炎史比例、合并糖尿病比例、上呼吸道感染比例、变应性鼻炎比例和抗菌药物滥用比例均高于非感染组患者(P<0.05),Logistic回归分析结果显示,年龄、滥用抗菌药物和合并糖尿病是慢性化脓性中耳炎患者发生真菌感染的危险因素(P<0.05)。感染组患者免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)和T淋巴细胞亚群(CD_(4)^(+)、CD_(8)^(+)和CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)比值)低于非感染组(P<0.05)。两组患者基因型及等位基因分布比较,无统计学差异。感染组携带Dectin-1等位基因型(GG和TT)患者血清免疫球蛋白(IgA、IgM)和T淋巴细胞亚群(CD_(4)^(+)、CD_(8)^(+)和CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)比值)水平低于携带GT患者(P<0.05)。结论 慢性化脓性中耳炎患者携带Dectin-1等位基因患者可能免疫功能低下,可影响疾病的发展。

桉柠蒎肠溶软胶囊联合两性霉素B治疗真菌性鼻窦炎的临床研究

目的探讨桉柠蒎肠溶软胶囊联合两性霉素B治疗真菌性鼻窦炎的临床疗效。方法选取2021年7月—2023年7月青岛市城阳区人民医院收治的112例真菌性鼻窦炎患者,随机分为对照组(56例)和治疗组(56例)。对照组患者静脉滴注两性霉素B,25 mg加入生理盐水100 mL,每2天1次。治疗组在对照组的基础上口服桉柠蒎肠溶软胶囊,0.3 g/次,3次/d。两组治疗14 d。观察两组患者临床疗效,比较治疗前后两组患者症状缓解时间,生活质量量表(SF-36),血清因子干扰素-γ(INF-γ)、树突状细胞相关C型凝集素-1(Dectin-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-17(IL-17),及不良反应情况。结果治疗后,治疗组临床总有效率为98.21%,明显高于对照组总有效率(82.14%,P<0.05)。治疗后,治疗组症状缓解时间均明显早于对照组(P<0.05)。治疗后,两组患者内容生理功能(RP)、社会功能(SF)、情感职能(RE)、总体健康(CH)评分比治疗前均明显升高(P<0.05),且治疗组评分明显高于对照组(P<0.05)。治疗后,两组血清因子IL-17、TNF-α、Dectin-1明显降低,而INF-γ水平明显升高(P<0.05),且治疗组血清因子水平明显好于对照组(P<0.05)。治疗后,对照组不良反应发生率为14.20%,明显高于治疗组(3.57%,P<0.05)。结论桉柠蒎肠溶软胶囊联合两性霉素B治疗真菌性鼻窦炎可较好改善临床症状,降低鼻窦炎症反应状态,有效提升生活质量。

Dectin-2基因多态性与乳腺癌根治术后继发侵袭性真菌感染的关联

目的探究树突状细胞相关C型凝集素受体2(Dectin-2)基因多态性与乳腺癌根治术后继发侵袭性真菌感染(IFI)的关联。方法选取2019年1月-2021年6月于中国医科大学附属盛京医院接受根治术的乳腺癌患者124例,根据患者术后是否发生IFI分为IFI组39例和非IFI组85例。调查患者病历档案收集临床资料,分析患者术后发生IFI的危险因素。采用酶联免疫吸附法检测两组患者血清Dectin-2、白细胞介素-1β(IL-1β)和干扰素-γ(IFN-γ)水平,聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-EFLP)技术检测Dectin-2基因rs11045418位点单核苷酸多态性。结果IFI组合并糖尿病、住院时间≥10 d及进行辅助化疗占比高于非IFI组(P<0.05),但两组年龄、体质量指数(BMI)及高血压分布占比的比较,无统计学差异;Logistic回归模型分析显示,合并糖尿病、住院时间是乳腺癌患者根治术后继发IFI的危险因素(P<0.05);IFI组患者Dectin-2、IL-1β和IFN-γ水平高于非IFI组(P<0.05);rs11045418位点CC基因型是乳腺癌患者根治术后继发IFI的保护因素(P<0.05),但两组rs11045418位点基因型和等位基因分布频数的比较,无统计学差异。结论Dectin-2基因rs11045418位点CC基因型可能降低乳腺癌患者根治术后继发IFI风险,血清Dectin-2水平在IFI患者中也异常升高。

免疫抑制剂对小鼠肺泡巨噬细胞抗曲霉感染相关受体mRNA表达的影响

目的探讨免疫抑制剂对小鼠肺泡巨噬细胞抗曲霉感染相关受体mRNA表达的影响。方法30只昆明小鼠随机分为2组：正常对照组（6只）和免疫抑制组（24只，环磷酰胺150mg／kg腹腔注射）。免疫抑制组小鼠注射环磷酰胺后4h、8h、16h及24h，分别随机取6只进行支气管肺泡灌洗，收集肺泡巨噬细胞。正常对照组小鼠注射生理盐水24h后处死，收集肺泡巨噬细胞。使用逆转录-聚合酶链反应检测小鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体2（TLR2）、TLR4、树突状细胞相关C型凝集索1（Dectine-1）mRNA表达变化。结果与正常对照组比较，腹腔注射环磷酰胺4h后，TLR2mRNA表达即出现显著下降（P〈0．01）；在腹腔注射环磷酰胺8h后TLR4mRNA表达出现显著下降（P〈0．01）；Dectine-1 mRNA在腹腔注射环磷酰胺后无明显变化。结论免疫抑制剂环磷酰胺能够下调肺泡巨噬细胞抗曲霉感染相关受体TRL2和TLR4mRNA的表达，对Dectine-1mRNA的表达未见明显影响。

模式识别受体在抗真菌免疫中的作用

真菌感染机体后，通过模式识别作用及细胞内信号传导，启动固有免疫和适应性免疫应答。模式识别作用是抗真菌免疫的始动环节，Toll样受体（TLRs）和树突状细胞相关性C型凝集素-1（Dectin-1）是参与抗真菌免疫的主要模式识别受体（RPP）。两者活化后启动机体免疫应答，产生各种细胞因子和趋化因子，并直接诱导巨噬细胞、自然杀伤细胞吞噬和杀灭病原体。TLRs和Dectin-1的信号传导、抗真菌感染的免疫机制以及两者之间的相互作用等已成为目前研究的热点．