树舌灵芝深层发酵产物抑菌作用的研究

以分离自广西乐业天坑群的树舌灵芝的深层发酵产物(菌丝体、发酵液)为试材,采用滤纸片法、二倍稀释法,研究了树舌灵芝发酵产物提取物的抑菌作用,以期为开发防腐、食品保鲜产品提供参考依据。结果表明:树舌灵芝菌丝体提取物和发酵液提取物中均含有抗菌活性物质,发酵液乙酸乙酯提取物的抑菌能力最强,对10种供试菌均有较好的抑菌效果;发酵液乙酸乙酯提取物梯度洗脱、分离纯化后得到的30%乙酸乙酯组分(B5)的抑菌能力最高,对10种供试菌的抑菌圈直径基本上均最大;B5对藤黄微球菌的最低抑菌浓度(MIC)值为25 mg·mL^(-1),对大肠杆菌等5种菌的MIC值为50 mg·mL^(-1),对酿酒酵母的MIC值为200 mg·mL^(-1),对黑曲霉、米曲霉和绿色木霉的MIC值为400 mg·mL^(-1)。

一株野生树舌灵芝菌株鉴定及其液态发酵特性

为进一步丰富灵芝真菌资源,对从野外桃树上采集的灵芝子实体,采用形态学观察和ITS序列比对进行菌种鉴定,并对其摇瓶发酵液的菌丝体生物量和胞内外代谢物特性进行分析。结果表明:该灵芝菌株在分类上属于多孔菌科灵芝属,学名为树舌灵芝,序列上传GenBank,登录号为OK037622。液态发酵研究表明,其菌丝体生物量为15.16 g∕L,底物葡萄糖利用率为77.63%,胞内外多糖含量和质量浓度分别为16.04 mg∕g和1.23 g∕L,胞内代谢物主要有糖醇类(45.07%)、糖类(40.05%)、脂肪酸类(13.33%),胞外代谢物主要有氨基酸类(40.02%)、糖类(15.74%)、糖酸类(12.09%)、糖醇类(9.85%)、脂肪酸类(6.28%)、有机酸类(5.82%)、酯类(4.34%)、醇类(2.83%)、核苷类(2.79%)。该研究可为下一步开展灵芝研究提供菌种准备,并为后续的开发应用提供参考。

树舌灵芝总三萜提取工艺优化及其抗氧化作用研究

以树舌灵芝为原料,研究总三萜的提取工艺及其抗氧化性。选择料液比、乙醇浓度、超声温度和超声时间进行单因素实验,在单因素实验基础上,采用Box-Behnken试验设计,以树舌灵芝总三萜得率为响应值进行响应面分析,确定最优工艺参数为:料液比1∶20(g/m L),乙醇浓度70%,超声温度55℃,超声时间60 min。在此工艺条件下进行5次验证性实验,树舌灵芝总三萜的提取得率平均值为1.75%。并通过测定DPPH的清除率、羟基自由基的清除率以及总还原力,研究其抗氧化活性。

树舌灵芝化学成分分析及其多糖、三萜组分的抗氧化活性

本研究测定了树舌灵芝子实体的粗多糖、粗蛋白、粗脂肪、矿物质元素以及三萜的含量,分析了其氨基酸、脂肪酸及矿物质元素组成,并通过测定DPPH·与HO·的清除率,研究三萜及多糖的抗氧化活性。研究结果表明,树舌灵芝子实体含有总糖43.8%,三萜1.75%,蛋白质11.4%,粗脂肪0.40%,灰分1.80%,维生素C 10.5%,维生素A 15.6%;还包含丰富的矿物质元素如Ca、Fe、Zn等,其含量分别为5740、29.7、15.6 mg/kg。树舌灵芝子实体还富含甲硫氨酸(19.3 g/kg)、天冬氨酸(5.5 g/kg)、缬氨酸(19.4 g/kg)、亮氨酸(4.2 g/kg)以及亚油酸(340.9 mg/kg)等,是一种营养丰富且气味独特的食药用菌,通过测定DPPH·的清除率与HO·的清除率得知,三萜与多糖均具有一定的抗氧化活性,且三萜的抗氧化能力比多糖强。

树舌灵芝发酵液中灵芝酸的提取及测定

利用有机溶剂萃取法提取树舌灵芝MP-01发酵液中灵芝酸,并用分光光度法测定提取液中灵芝酸的含量,确定了分光光度法测定的最佳比色条件为:比色波长为520 nm,5%香草醛-冰醋酸和高氯酸用量分别为0.2 mL和1.0 mL(在反应系统中浓度分别为1.0%和83%),显色温度70℃,显色时间为25 min,在此条件下测得醇溶物和醇沉物提取液中灵芝酸含量分别为0.022 mg/g和0.049 mg/g。

树舌灵芝液体深层发酵菌丝体化学成分研究

目的对工业化生产的树舌灵芝液体深层发酵菌丝体化学成分进行系统化研究。方法采用有机溶剂浸提法提取菌丝体的化学成分,经硅胶柱色谱和大孔树脂吸附色谱对提取物进行分离纯化,通过薄层制备、结晶、重结晶等方法获得4个单体化合物,并鉴定结构。结果从树舌灵芝液体深层发酵菌丝体中分离并鉴定得到4个单体化合物(其中2个化合物为同一种物质),即麦角甾醇、甘露醇和赤藓糖醇。结论从树舌灵芝液体深层发酵菌丝体中分离到3种化合物:麦角甾醇、甘露醇和赤藓糖醇,其中赤藓糖醇为首次在树舌灵芝的化学成分研究中报道。

树舌灵芝菌丝体多糖提取条件的研究

对树舌灵芝菌丝体粗多糖的提取条件进行研究,通过单因素试验和L(934)正交试验设计等方法,重点考察不同的浸提剂、浸提温度、料液比、浸提时间、乙醇沉淀倍数对树舌灵芝多糖提取率的影响。结果表明,最佳提取条件为:浸提剂为氢氧化钠(4%),料液比为1∶30(g/mL),温度为80℃,时间为4h,乙醇沉淀体积为3倍,多糖提取率为4.022%。

树舌灵芝发酵产漆酶培养基优化

在单因素试验的基础上,采用Plackett-Burman设计对影响树舌灵芝产漆酶活性的因素进行了评价,筛选出具有显著影响的因素并优化了树舌灵芝产漆酶培养基的主要成分。结果表明,产酶培养基中小麦麸皮、豆粕、硫酸铜和香兰素的添加量对树舌灵芝产漆酶活性具有显著影响;预测得到最佳培养基组成为:小麦麸皮(20 g/L)、豆粕(2 g/L),硫酸铜(0.625 g/L)和香兰素(0.037 5 g/L);优化培养基后漆酶活性达到45.85 IU/m L,约为优化前的56倍,为大规模发酵生产漆酶提供技术支持。

UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS整合网络药理学探讨树舌灵芝有效成分及其防治新型冠状病毒肺炎的可行性

目的基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术阐明树舌灵芝主要成分,结合网络药理学探讨其防治新型冠状病毒肺炎的作用机制。方法采用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术鉴定树舌灵芝的主要成分;采用Swiss Target Prediction数据平台对鉴定成分进行靶点预测,对核心靶基因进行GO和KEGG富集分析,运用Cytoscape 3.8.0绘制关联网络图,同时通过分子对接评价树舌灵芝核心成分与血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)及3种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)蛋白的结合作用。结果该研究从树舌灵芝中鉴定化合物62个;30个活性化合物主要作用在IL-6、PTGS2和MAPK1等32个核心靶点,通过PI3K/Akt、TNF及肺结核等多条与肺损伤保护相关通路,发挥防治COVID-19的作用;分子对接显示小白菊内酯、1,4-二羟基-2-萘甲酸和瑞香素等核心成分与ACE2及3种SARS-CoV-2蛋白的亲和作用较好。结论该研究初步阐明树舌灵芝的化学成分及潜在作用机制,为筛选树舌灵芝防治COVID-19的药效成分及深入阐明作用机制提供了科学的理论依据。

树舌灵芝深层发酵培养基的优化研究

通过单因素试验,确定以米糠和蔗糖为复合碳源,黄豆粉为氮源,以筛选的碳源、氮源与无机盐KH2PO4和MgSO4.7H2O为考察因素,以菌丝干重和总三萜产量为主要指标,利用正交设计法优化树舌灵芝菌丝体培养基配方比例,确定树舌灵芝液体发酵培养基最佳配方为:米糠40.0g/L,蔗糖10.0g/L,黄豆粉40.0g/L,磷酸氢二钾2.0g/L,硫酸镁0.5g/L,自然pH。于25℃、120r/min振荡培养7d,该菌菌丝体干重高达21.41g/L,总三萜产量为69.94g/L。

树舌灵芝免疫调节蛋白基因克隆,生物信息学分析及真核表达载体构建

树舌灵芝(Ganoderma applanatum)为灵芝属内独特的一类,克隆树舌灵芝免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory protein,FIP)基因,对其进行生物信息学分析并构建真核表达载体,将为高效表达重组树舌灵芝FIP和揭示其生物学功能奠定基础。采用染色体步移的方法从树舌灵芝菌丝体基因组DNA中扩增得到1个新型真菌免疫调节蛋白基因—FIP-gap,对其核苷酸序列进行生物信息学分析,结果表明,FIP-gap基因属于灵芝属FIP家族,含有342 bp,编码113个氨基酸。对其氨基酸序列分析表明:树舌灵芝免疫调节蛋白FIP-gap分子量为12.7 k D,理论等电点为4.93,富含丝氨酸,缬氨酸和苏氨酸,不含组氨酸和半胱氨酸。另外将FIP-gap与其他灵芝属FIP进行蛋白质序列比对分析,其具有FIP典型的保守序列,并与灵芝(G.lucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)、紫灵芝(G.japoncium)、紫芝(G.sinensis)、小孢子灵芝(G.microsporum)和黑灵芝(G.atrum)具有78%、78%、78%、79%、78%和77%的同源性,为一新型的FIP。构建灵芝属真菌免疫调节蛋白系统进化树,结果表明树舌灵芝FIP-gap与其他灵芝属FIP均不聚类,说明其与其他灵芝属FIP的亲缘性相对较远。同时,构建了毕赤酵母重组表达载体p PIC9-FIP-gap,为进一步研究FIP-gap的生物学功能提供基础,为全面了解真菌免疫调节蛋白提供理论依据。

树舌灵芝粗提物体外抗肿瘤作用的研究

目的探讨树舌灵芝各溶剂提取物的抗癌作用。方法采用系统溶剂法从树舌灵芝得到一系列提取物,运用MTT法研究了各提取物对体外培养的人乳癌MCF-7细胞增殖的影响。结果氯仿提取物对肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用,其余各层样品抑制作用不明显。结论树舌灵芝抗肿瘤成分可能在氯仿部分。

树舌灵芝菌丝体不皂化物GC-MS分析

在树舌灵芝菌丝体化学成分研究中,采用乙醚抽提法获取树舌灵芝菌丝体脂溶性物质,经皂化后使用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)进行分析,共鉴定出19种物质,所得到的丁羟甲苯、乙酰菲、5,6-二氢麦角甾醇对树舌灵芝菌丝体化学成分研究具有较高价值。

树舌灵芝碳氮营养源利用的研究

测定不同碳源、氮源、碳氮比对树舌灵芝营养需求的影响。结果表明:玉米粉最利于菌丝体生长,地瓜淀粉对粗多糖的积累有利,酵母膏对生长和粗多糖积累均有利;最佳碳氮比为20∶6。液体发酵培养8d后,发酵液总糖达到最高24.3mg/mL。

一株高漆酶活性树舌灵芝降解木质素条件的优化

以1株具有选择性降解木质素能力的树舌灵芝(Ganoderma applanatum)为基础菌株,通过液体发酵培养,对该菌株的木质素降解酶系进行初步分析,进而以木质素磺酸钙为底物,利用正交试验优化该菌株对木质素的降解条件.结果 表明,树舌灵芝可同时合成漆酶、锰过氧化酶和木质素过氧化物酶,其中漆酶活性显著高于锰过氧化酶和木质素过氧化物酶;经优化后,确定较适合树舌灵芝降解木质素的条件为:以3.0 g·L-1豆粕为氮源,底物浓度2.5 g·L-1,初始pH 6.0,发酵温度28℃,在此条件下木质素降解率达到44.72%.

树舌灵芝复合诱变选育漆酶高产菌株

以一株产漆酶树舌灵芝的菌丝片段为试材,利用紫外线和硫酸二乙酯逐级诱变;采用愈创木酚显色圈初筛突变菌株,并通过摇瓶复筛对优势菌株产酶能力进行验证,以期选育稳定高产漆酶菌株。结果表明:最终诱变获得一株遗传稳定的高产突变株,与原始菌株相比,漆酶活性提高63.3%,同时发酵周期缩短1 d。

树舌灵芝发酵特性的研究

研究了树舌灵芝摇瓶发酵过程中生物量、pH值、电导率、胞外粗多糖、纤维素酶活力的变化趋势。结果表明,在树舌灵芝发酵过程中,生物量和pH值均在5d后趋于稳定,电导率先下降3d后逐步上升,胞外粗多糖、纤维素酶活力均在3d时达最大值,此后逐渐下降,5d后基本趋于稳定。

野生树舌灵芝菌株的分子鉴定

采集泰安市及其周边地区野生树舌灵芝,将其组织分离并纯化,得到10个菌株的纯培养,利用真菌总DNA提取试剂盒提取其基因组总DNA,通过PCR扩增获得其rDNA ITS区域序列,将获得的序列进行同源性比对和构建系统进化树。结果表明,10个分离物与GenBank中的3个树舌灵芝分离物(DQ424996、DQ425009、JN008873)聚为一簇,ITS核苷酸一致率为99.46%~100%,从分子水平上证明10个分离物为树舌灵芝(Ganoderma applanatum)。

树舌灵芝优良菌株的筛选

以采集分离的10个树舌灵芝(Ganoderma applanatum)菌株为试验材料,进行固体培养、液体培养和出菇试验。结果表明,10个供试菌株在PDA固体和液体培养基中生长情况差异较大,普照树舌(PZSS)、肥城树舌(FCSS)菌株菌丝生长速率最快,均为6.29 mm·d^(-1),其次是孔树舌5516 (KSS5516)和孔树舌5 (KSS5)菌株;液体培养中孔树舌5菌株菌丝球形成早、生长快,菌丝体得率最高,为4.1 g·L^(-1);品比试验中孔树舌5和普照树舌菌株综合农艺性状表现优良,产量最高,生物学效率分别为9.10%和8.53%。

不同配方培养基对树舌灵芝子实体培养的影响

用木屑及麸皮为原料设计10个配方、再选用11种不同树种树枝分别对树舌灵芝进行栽培试验,测定菌丝体生长速度、子实体形成情况、产量、物料消耗。结果表明,在10种麸皮添加量的配方中,树舌灵芝栽培培养基的麸皮最适添加量为5%～10%,树舌灵芝菌丝体、子实体生长及生物学效率最佳的培养基配方为:木屑95%,麸皮5%;在11种树枝培养基中,菌丝体生长最快的树种是苦楝树,子实体产量最高的是枫树。