人轮状病毒G1P[8]型感染树鼩原代小肠上皮细胞模型的建立

目的探究树鼩原代小肠上皮细胞的增殖特性,建立人轮状G1P[8]型病毒体外感染树鼩原代小肠上皮的细胞模型。方法采用胶原酶XI和中性蛋白酶I联合消化法获取树鼩原代小肠上皮细胞,经纯化和鉴定,用人轮状G1P[8]型病毒感染细胞,测定培养上清的病毒滴度和载量,并用Western blot和间接免疫荧光检测法检测人轮状病毒G1P[8]型VP6蛋白的表达情况,评价人轮状G1P[8]型病毒体外对树鼩原代小肠上皮细胞的感染性。结果分离的树鼩原代小肠上皮细胞经传代培养纯化,获得纯度达90%树鼩原代小肠上皮细胞。对树鼩原代小肠上皮细胞、原代肾细胞、HCT116细胞和MA104细胞进行轮状病毒易感性比较,确定树鼩原代小肠上皮细胞可以被人轮状病毒G1P[8]感染,培养72 h时病毒滴度可达到2.0×105TCID_(50)/m L。经Western blot和间接免疫荧光发现在人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞1~5 d均能检测到人轮状病毒VP6蛋白的表达和分布。结论确立了树鼩原代小肠上皮细胞的分离、纯化与培养方法,并建立了人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞的体外模型。

鸡胚小肠上皮细胞的分离及原代培养研究

取18日龄的SPF鸡胚,分别采用组织块培养法、胰蛋白酶、胶原酶I和嗜热菌蛋白酶消化法分离和体外培养小肠上皮细胞。结果表明:组织块培养法所获得的上皮细胞纯度较低;胰蛋白酶消化后多为单细胞,细胞贴壁和生长能力较弱;胶原酶Ⅰ单独消化50 min或嗜热菌蛋白酶单独消化110 min以及胶原酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶联合消化后均可得到大量隐窝细胞团块,经低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,可获得较纯的上皮细胞。分离的细胞接种培养12～24 h贴壁,48～72 h细胞团中的细胞向四周蔓延,形成一群群的细胞集落,6～7 d细胞汇合成片,成"铺路石样",细胞多呈扁平多角状,椭圆状,单层生长,边界清晰,互不重叠。经形态学观察、扫描电镜鉴定、碱性磷酸酶染色和免疫组化鉴定为上皮细胞。

猪小肠黏膜上皮细胞原代培养

分别采用酶消化法和组织块培养法,建立了猪小肠黏膜上皮细胞原代培养的方法。酶消化法于37℃分为4个处理组进行。处理1以2.5 g/L的胰蛋白酶消化30 min;处理2以2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min;处理3以50 mg/L嗜热菌蛋白酶消化50 min;处理4以50 mg/L嗜热菌蛋白酶+2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min。采用柠檬酸胰酶法分离纯化细胞。结果表明,组织块法原代培养获得的细胞活性较强。

树鼩小肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定

目的从树鼩小肠分离小肠上皮细胞,探索分离培养方法和条件,为药物开发和病原感染机制研究提供体外细胞模型,并且为建立树鼩小肠上皮细胞系奠定基础。方法采用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ及DTT联合消化树鼩小肠组织块,得到的细胞经完全培养液培养,用相差显微镜观察细胞形态,通过MTT法测定细胞生长曲线,并采用细胞角蛋白荧光染色等方法鉴定细胞。结果经优化分离法得到的肠上皮隐窝细胞团在24 h后贴壁,6 d汇合成片,在显微镜下观察发现细胞团延辐射状向外长出铺路石样和多角状的细胞;第二代后,每隔2~3 d可传代1次;细胞接种3~6 d为对数生长期;细胞角蛋白18进行免疫荧光鉴定后确定为小肠上皮细胞。结论本实验成功地从树鼩小肠分离到了小肠上皮细胞,并且建立了树鼩小肠上皮细胞体外培养的方法。

树鼩角膜原代上皮细胞的分离培养、纯化与鉴定

目的建立树嗣角膜上皮细胞(CECs)稳定的体外培养技术,为人类角膜疾病研究提供新的实验材料。方法使用改进的双酶消化法取得树嗣CECs,周转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂配合梯度消化对树鼩CECs进行纯化,角蛋白3/12抗体对CECs进行免疫荧光检测及鉴定。结果优化的酶消化法可以快速、有效得到高纯度的树鼩CECs。TGF-β抑制剂及梯度消化法可以达到良好的纯化目的,纯化的CECs在传代过程中仍保持良好形态。树鼩CECs免疫荧光染色显示角蛋白3/12单克隆抗体阳性。结论成功建立了一种有效、简单、经济适用的树鼩角膜上皮原代细胞的体外培养技术,所获得的原代细胞具有较好的上皮细胞形态特征并可以连续传代,为眼科疾病的研究提供一种新材料。

原代犬小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立原代犬小肠上皮细胞分离培养及纯化的方法,为犬肠道病毒性、细菌性及寄生虫相关疾病研究提供细胞材料。采用组织块培养法分离培养原代犬小肠上皮细胞,胰酶差速消化法进行纯化,利用细胞形态学、间接免疫荧光法鉴定上皮细胞特性,脂多糖(LPS)刺激原代上皮细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测炎性因子转录水平,鉴定原代犬小肠上皮细胞的功能。结果显示:组织块培养法获得的原代犬小肠上皮细胞可在24 h内贴壁,第3天细胞开始增殖,第4天时达到增殖顶峰,第5~7天细胞活性逐渐降低,在体外连续传代可培养至第10代。经胰蛋白酶差速消化纯化后,获得铺路石样原代犬小肠上皮细胞,生长曲线类似“S”形,上皮细胞特异性细胞角蛋白18(CK18)鉴定呈阳性,LPS可诱导犬小肠原代上皮细胞炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的转录水平在12 h(P<0.05)、24 h(P<0.01)表达量呈显著和极显著差异。研究表明,利用组织块培养法可成功分离获得数量较多、纯度较高且具有典型上皮细胞形态和功能的犬小肠上皮细胞,获得的细胞为研究犬肠道疾病致病机理和相关研究提供了细胞模型。

小肠粘膜上皮细胞原代培养最适条件的研究

本文定量研究了小肠粘膜上皮细胞原代培养方法的最适条件。Ｗｉｓｔａｒ系胎鼠小肠备成小肠绒毛细胞团悬液。接种于处理后的２４孔培养板，采用ＭＴＴ显色法定量研究影响小肠上皮细胞贴壁生长的各种因素。结果显示培养液质量、培养时间、ＣＯ２浓度、肠绒毛细胞团接种浓度、胎牛血清浓度和加药时间是影响肠上皮细胞贴壁生长的主要因素，并得到了上述因素的最适培养条件。上述研究结果可为体外探讨细胞生长因子和肠营养素对肠上皮细胞结构、功能、生长和分化的影响提供了一种可靠、定量的研究手段。

新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利,本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞。结果,利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22 h内贴壁并发生细胞分裂,6~7 d明显增殖,10~12 d汇合成单层,连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征。倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11~12代细胞发生变形,间隙增大。细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性。电镜下,纹状缘整齐,紧密连接结构清晰可见。结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞。

兔小肠上皮细胞体外分离培养

选用新生未哺乳仔兔,应用胶原酶Ⅳ消化法对小肠上皮进行分离培养,得到兔小肠上皮细胞后,联合应用相差消化法和相差贴壁法对兔小肠上皮细胞进行纯化。通过形态学观察及细胞免疫组织化学方法对所得到的纯化兔小肠上皮细胞进行鉴定。结果表明:应用胶原酶Ⅳ消化法得到的兔小肠上皮细胞生长状况良好,纯化后得到95%以上纯度的兔小肠上皮细胞,纯化所得的兔小肠上皮细胞经形态学观察及细胞角蛋白8单克隆抗体鉴定为阳性。

鸡肠上皮细胞体外原代培养研究

取1月龄三黄鸡十二指肠的上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC),经分离纯化进行培养。结果表明:胰蛋白酶-EDTA配合使用、短时间消化收获细胞法可获得大量的健全肠绒毛隐窝单位,进一步培养获得的IEC完全可供相关实验研究之用。

人胎小肠上皮细胞体外培养的研究

联合应用粗胶原酶和中性蛋白酶消化胎儿小肠组织小块，可简便、快速地获得大量活率高的小肠上皮细胞（ｉｎｔａｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ，ＩＥＣ）。培养细胞１～２ｄ内贴壁，７～８ｄ明显增殖，１０～１２ｄ汇合成片。免疫组化检查，细胞角质蛋白和上皮细胞膜抗原染色阳性。组化检查显示存在碱性磷酸酶表达。光镜下，培养细胞呈扁平多角形，单层排列。电镜下，细胞表面可见大量微绒毛及细胞间紧密联结、桥粒等。讨论了人ＩＥＣ体外培养应注意的问题及减少、异源细胞增殖的方法。

新生大鼠小肠上皮细胞分离培养研究

本实验比较了4种分离大鼠IEC的方法,结果显示联合应用粗胶原酶和中性蛋白酶分离效果最好,细胞贴壁生长能力强。胶原涂膜改善玻璃培养瓶或盖玻片表面的性状有利于细胞贴壁生长。细胞的增殖依赖于培养液的质量、成分及细胞间的相互作用。培养细胞一般1～2天贴壁,7～8天明显增殖,10～14天汇合成片。培养细胞细胞角质蛋白、碱性磷酸酶染色阳性,光镜和电镜检查均显示为IEC。本文所建立的新生大鼠IEC体外培养方法为研究IEC生理和病理提供了一个十分有用的实验模型。

鸡小肠上皮细胞的分离及体外培养研究进展

小肠是食物消化吸收的主要场所,而小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)在营养物质的消化吸收及转运、消化酶分泌及肠道免疫方面发挥着重要作用。利用体外培养方法分离培养IEC为研究其分化增殖、凋亡等生物学功能提供了重要手段。作者综述了培养组织样的选择、分离IEC的常用方法、影响IEC培养的因素及IEC的鉴定方法等鸡IEC体外分离培养过程中的相关研究进展。

鸽小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

本试验旨在建立鸽小肠上皮细胞体外分离培养和鉴定的方法体系,为研究鸽小肠上皮细胞的营养转运吸收、细胞增殖代谢等机制提供原代细胞模型。采用胶原酶消化法和组织块贴壁法分离鸽小肠上皮细胞,并通过相差消化法对其纯化,最后运用免疫荧光分析和基因表达分析鉴定鸽小肠上皮细胞。结果表明,2种方法均可成功分离培养鸽小肠上皮细胞,细胞呈铺路石状排列;细胞角蛋白8免疫荧光染色呈阳性;紧密连接蛋白基因CLDN-3和CLDN-4均有表达;细胞生长曲线呈"S"形。综上所述,本试验成功建立了鸽小肠上皮细胞体外分离培养体系,为后续开展雏鸽肠道营养研究提供了细胞模型。

干细胞标志Lgr5在糖尿病小鼠小肠上皮中的表达

目的探讨糖尿病小鼠小肠上皮干细胞标志分子G蛋白偶联受体5(Lgr5)的表达及干细胞数量的改变情况。方法采用链脲佐菌素腹腔注射的方法建立糖尿病小鼠模型,用免疫组织化学检查(免疫组化)检测糖尿病小鼠(6只)与正常小鼠(6只)小肠上皮组织中Lgr5的表达,并分离糖尿病小鼠与正常小鼠原代小肠上皮细胞,采用流式细胞技术测定Lgr5阳性细胞在上皮细胞中的比例。结果免疫组化结果显示糖尿病与正常小鼠小肠上皮每个隐窝单位的Lgr5阳性细胞数量分别为(3.7±0.5)个及(1.5±0.6)个,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞技术测得糖尿病与正常小鼠小肠上皮Lgr5阳性细胞比例分别为(28.75±3.69)%及(6.55±1.78)%,前者上皮组织中Lgr5阳性细胞比例显著高于后者(P<0.05)。结论链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠小肠上皮Lgr5阳性干细胞数量增加,Lgr5在糖尿病小鼠小肠上皮细胞高表达。

4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。

组织块法培养鸡胚肠黏膜上皮细胞

本试验采用组织块方法原代培养鸡胚肠黏膜上皮细胞,倒置显微镜下细胞呈圆形,透明状,成功培养原代鸡胚肠黏膜上皮细胞。试验表明,组织块法可用于鸡胚肠黏膜上皮细胞的原代培养,具有简便易行、培养周期短、纯度高等优点,是肠道疾病良好的体外研究模型。

新生仔猪小肠上皮细胞体外培养的研究

采用灌肠消化、组织块消化、机械刮取+胰蛋白酶消化和机械刮取+胶原酶消化等4种方法对仔猪小肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cell,IEC)的体外分离培养进行了比较.结果表明,使用机械刮取+胶原酶消化法分离IEC,可简便快速地获得数量大、活性高的小肠上皮细胞,其中原代培养细胞24 h出现贴壁,7～8 d明显增殖,10～12 d贴壁细胞汇合成片,18～21 d细胞呈"铺路石"状;传代培养细胞3 h出现贴壁,3～4 d快速增殖.采用碱性磷酸酶显色反应检测,90%以上的贴壁细胞呈阳性反应.

蓝狐源约氏乳杆菌菌株ZJBF004分离鉴定与体外益生潜能的评价

为获得犬科动物源乳酸菌并对其益生潜能进行评价,本研究通过测定生长曲线、产酸能力、对低pH和高胆盐环境的耐受性、在体外模拟胃肠道溶液中的存活能力、抑菌能力、抗生素抗性、对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力及抗氧化性评价了菌株ZJBF004的益生特性。结果表明:利用固体乳酸细菌培养基从蓝狐的肠道内容物中分离到1株优势乳酸菌,将其命名为菌株ZJBF004,经菌落菌体形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析鉴定其为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。菌株ZJBF004产酸能力较强且在37℃培养时能迅速进入对数生长期;在pH=5的培养基中耐受6 h时仍能保持较好的生长情况,在胆盐浓度为3 g/L的条件下至少可耐受6 h,且存活率高于70%,在人工模拟胃液和肠液中耐受3 h时存活率高于90%;对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果;对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力为(18.67±3.12)个/细胞;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率为28.50%,表明菌株ZJBF004具有一定的抗氧化活性。由此可见,新分离的蓝狐源约氏乳杆菌菌株ZJBF004具有优良的体外益生性能,可作为潜在犬科动物用益生菌进一步研究。