中国栗疫病菌群体遗传结构的空间自相关性分析

应用空间自相关分析方法对中国栗疫病菌 17个居群 RAPD遗传变异的空间结构进行研究 ,以探讨栗疫病菌居群遗传变异的分布特征及其形成机制。结果表明 :中国栗疫病菌居群缺乏空间结构 ,绝大多数 RAPD位点变异为随机分布的空间模式 ,但部分位点表现出渐变、斑块和双向渐变的非随机分布模式 ,又显示了一定的空间结构。推测其形成原因可能是长距离的基因流、人类活动、地理隔离以及栗疫病菌本身的繁殖特性综合作用的结果 ,并依据部分位点呈单向渐变的模式推测西南地区为中国栗疫病菌的起源中心。

栗疫病菌的营养体亲和性基因和dsRNAs对病毒传播的影响

研究了栗疫病菌[Cryphonectriapaasitica(murr.)Barr]的营养体系和性基因及dsRNA病毒对菌株间病毒特征传播的影响。试验选用已知4个VC基因座位的15个VC基因型菌株和3种dsRNA病毒，通过含病毒菌株与野生型菌株的配对培养，将病毒逐个转入不同VC基因型菌株。将不同VC基因型的含病毒菌株与具特定VC基因差异的野生型菌株配对培养，根据培养两周后野生型菌株培养性状的改变与否，统计菌株间的病毒传播率。结果表明，各个VC基因对菌株间病毒传播的影响不同；存在2个VC基因差异的菌株间病毒传播率低于相差1个VC基因的；病毒在相差1个VC基因的菌株间的传播多具单向性；不同类型的病毒在菌株间的传播率也有差异。

栗疫病菌菌株的毒性联合与毒性分离现象的初步研究

对来自 3个中国板栗居群的共 18个栗疫病菌株进行单株及混合菌株的毒力评价 ,结果表明各单株毒力差异显著 ,混合菌株存在毒性联合与毒性分离现象。同一种群的组合中有 6 4 4 %为毒性联合 ,不同种群的组合其毒性分离率高达 88%,同一种群组合的毒性联合强度比不同种群组合的毒性联合强度大 ,而不同种群组合的毒性分离强度比同一种群组合的毒性分离强度大。大多数组合的毒性联合或毒性分离的性状表达稳定。

栗疫病菌单个营养体不亲和性基因差异对弱毒性病毒传递的影响

研究了栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌株间单个营养体不亲和性(vegetative incompatibility,vic)基因差异对弱毒性病毒传递的影响。将含病毒菌株与具单个vic基因座位差异的野生型菌株配对培养,10 d后调查菌株间的病毒传递率。结果表明,相同vic基因型菌株间的病毒传递率为100%;在1个vic座位上的基因不同通常会降低病毒的传递率,在vic-Cc座位上基因差异菌株间的病毒平均传递率为85.93%,而在vic-Dd座位上基因不同菌株间病毒的平均传递率仅为10.30%,在vic-Aa、vic-Bb座位上基因不同的菌株间病毒平均传递率分别为44.12%、47.93%。vic-Bb座位上基因不同菌株间的病毒正反向传递率相差非常大,由vic-b菌株向vic-B菌株的平均病毒传递率为83.13%,而从vic-B菌株向vic-b菌株的平均病毒传递率只有23.15%;其他3个vic座位上基因不同菌株间的病毒传递率也具有方向性,但不明显。

栗疫病菌的培养性状、毒力与dsRNA的关系

根据菌落的培养性状将中国东部１２个省（市）的４２９个栗疫病菌（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａｐａｒａｓｉｔｉｃａ）菌株划分为５种培养类型。其中Ⅰ型为桔黄色菌落的野生型正常菌株，占总菌株数的８９．３％；Ⅱ～Ⅳ型为培养性状不正常菌株，共有４６株，菌落有黄褐色、白色和深褐色等类型。供试菌株间存在明显的毒力分化，可分为强中弱三种类型。培养性状正常的菌株毒力普遍较强，极少菌株检测到ｄｓＲＮＡ；培养性状不正常的菌株毒力一般较低，在菌落白色的菌株中都检测到ｄｓＲＮＡ。在所测试的７０个菌株中含ｄｓＲＮＡ的菌株有３８个，其中３２个属于弱毒力类型，其他６个属中毒力类型；分布于除河南、湖南和广东以外的其他９个省（市）。

亚欧美栗疫病菌群体的遗传多样性

从 12 0个随机引物中筛选出条带清晰、主带明显、重复性好的 9个引物 ,对来自不同地域和寄主的 7个群体的 14 2个栗疫病菌菌株进行 RAPD分析。 9个引物共扩增出条带 12 4条 ,其中多态性条带 111条 ,多态性比率为 89.5 2 %。利用 Popgen3.2软件对供试群体进行遗传多样性分析和 UPGMA聚类。结果表明 ,中国地区 4个群体间的遗传相似性较大 ,与美国、意大利和日本群体间的相似性较小 ;美国和意大利群体间的遗传相似性较大 ,且它们与日本群体间的相似性大于与中国群体间的相似性。病原菌群体的遗传变异率为 0 .2 35 1,其中在地区水平上 ,82 .34%由群体内的变异引起 ,17.6 6 %由群体间的差异引起 ,群体间的基因流动值为 2 .3311;而在寄主水平上 ,则 79.4 2 %由群体内的变异引起 ,2 0 .5 8%由群体间的差异引起 ,群体间的基因流动值为 1.92

栗疫病菌毒力与弱毒力菌株的抗逆性

研究栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)弱毒力现象的最终目的是利用弱毒力菌株防治栗疫病,为此必须更多地了解弱毒力菌株的生物学性状、生理生化性状以及环境因素对弱毒力菌株扩散的影响等。研究表明,栗疫病菌的弱毒力菌株与毒力菌株在许多生物学性状上均存在差异,如菌落形态、菌落颜色、生长速率和产孢量等。目前,两类菌株在生理生化方面的研究报道较少,作者试图通过研究毒力和弱毒力菌株对高温和紫外线的耐受力以及对化学试剂的敏感性,了解其抵御不良环境的能力。

栗疫病菌对板栗几丁质酶活性的诱导

以板栗 (Castanea mollissima Bl.)实生苗和嫁接苗 (怀黄 )为试材 ,研究了栗疫病菌 (Cryphonectriaparasitica)菌块、CFE、ME等对板栗几丁质酶的诱导 ,测定了几丁质酶活性、比活性 ,并对其进行初步纯化。结果表明 ,菌块对板栗几丁质酶总活性、比活性的诱导效果最佳 ;接种后 35～ 4 0 h几丁质酶活性持续上升并达到高峰 ,之后开始下降。能够同时检测到板栗几丁质酶的内切酶和外切酶 ,以内切酶活性稍高。初步确定板栗几丁质酶的分子质量为 6 0

一种简便易行的栗疫病菌单孢分离方法

介绍了一种分离栗疫病菌单分生孢子的简便易行的方法。此方法可以排除菌丝段的干扰,也适用于分生孢子器中产生微小分生孢子的其他真菌。

栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional ge-nomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment searchtool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基)。该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构。与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。

栗疫病菌菌株间营养体不亲和性影响对病毒传递的效率

为明确板栗疫病菌Cryphonectria parasitica菌株间营养体不亲和性(vegetative incompatibility,vic)基因差异对低毒力病毒传递的影响,将具有不同vic基因的毒力菌株(受体)和低毒力菌株(供体)进行配对培养,并对病毒的传染率进行统计分析和回归模型分析。研究结果表明,栗疫病菌的营养体不亲和性是低毒力病毒传递的重要障碍,但不是绝对障碍;不同vic基因位点对病毒传递的影响程度差异显著;相同vic基因型菌株间的病毒传递率为100%,相差的vic基因位点数越多,病毒的传递率越低。病毒的传递率具有vic基因位点的非对称性,同时还受到菌株的遗传背景、vic基因上位效应等因素的影响。

营养体不亲和性诱导栗疫病菌菌株间程序性细胞死亡

为了验证营养体不亲和性导致细胞凋亡的假说,对栗疫病菌融合细胞基因组DNA的降解物进行了琼脂糖凝胶电泳检测,观察了融合细胞的细胞核变化,测定了融合细胞的活性氧产生、脂肪粒积累以及进行了融合细胞死活鉴定。结果表明:不同亲和群菌株的孢子混合涂板,孵育后经历萌发、细胞融合,融合细胞基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳可以检测到DNA梯状条带,这一特征为营养体不亲和性诱导的程序性细胞死亡提供了新的证据;细胞学上可观察到不亲和性菌株融合细胞细胞核降解、活性氧产生减少、脂肪粒积累增多及融合细胞死亡,这些特征与细胞凋亡的特征相似。

中日美栗疫病菌群体遗传结构比较

采用RFLP技术 ,对中日美 3国的 2 6个子群体共 75 7个栗疫病菌菌株的核DNA进行了群体遗传结构分析。结果表明 ,栗疫病菌的中国子群体间遗传结构有明显的分化 ,日本子群体间的遗传结构差异不明显 ;在美国和亚洲的栗疫病菌群体间没有发现基因流的迹象 ;美国栗疫病菌群体的遗传结构与日本群体的关系比较密切 ,而与中国群体间的差异较大。

我国栗疫病菌体中dsRNA的初步研究

作者在西南、华东、华北的十多个地区共采集140株栗疫菌 Endothiaparasitiica,并对昆明、南京、北京等地的38株栗疫菌进行了dsRNA的提取,发现13株含有1—2组分的dsRNA。根据黑曲霉病毒Aspergillus niger virus dsRNA分子量,推算出栗疫菌核酸分子量为4.0—5.1×10~6道尔顿。对栗疫菌核酸性质进行鉴定,在高离子强度(2×SSC)下核酸抗RNase(20微克/毫升),但经106℃10分钟处理,变性后核酸对RNase敏感,结果表明栗疫菌核酸为dsRNA。

栗疫病菌dsRNA的传递及其影响因素

对ｄｓＲＮＡ通过分生孢子、继代培养和菌丝融合传递的效率及其影响因素进行了研究。ｄｓＲＮＡ可通过分生孢子传递，但效果不稳定；提供光照和延长培养时间均可降低其传递效率，光照的不利影响更为明显；继代培养３０代未发现ｄｓＲＮＡ片段丢失，表明ｄｓＲＮＡ通过继代培养可稳定传递；菌丝融合传递ｄｓＲＮＡ受到营养体不亲和性的限制，但不亲和菌株间仍可获得一定的转化率，有的高达１００％；本研究使用两步转化的方法，明显地提高了弱毒力的转化率。

栗疫病菌RAN/GSP1基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)ScGSP1蛋白基因从COGEME植物病原菌EST库中BLAST得到栗疫病菌的GSP1蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为651 bp,编码216个氨基酸残基组成的GSP1蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析表明,GSP1蛋白前体包括GTPase结合结构域和碳端细胞核定位序列,与21个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌GSP1蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。

栗疫病菌分生孢子后代培养性状分化的观察

通过对6个含dsRNA及4个不含dsRNA的菌株进行培养性状的观察，结果表明，含dsRNA的菌株其分生孢子后代发生明显的分化，表现为白色和桔黄色两种类型菌落；而不含dsRNA的菌株后代均不发生分化；并对各菌株的后代进行了dsRNA检测。

10种杀菌剂对板栗疫病菌的抑制作用

为了筛选防治板栗疫病的高效、低毒、低残留杀菌剂，采用菌丝生长速率法测定了10种杀菌剂对栗疫病菌菌丝生长的抑制效果。结果表明，苯醚甲环唑＋丙环唑、苯醚甲环唑、咯菌腈、咪鲜胺和多氧霉素对栗疫病菌具有很强的抑制作用，EC50在0．0148～8．752μg／mL之间，为生产上有效地防治板栗疫病提供了依据。

栗疫病菌低毒性病毒(CHV1)分子序列的多态性

为了探明欧洲栗疫病菌低毒性病毒(CHV1)病毒的起源,采用序列测定方法对来自中国、日本和意大利的30个CHV1的遗传多样性进行了分析。测定了所有病毒的部分序列,根据测序结果可将其分为29个单元型,分属于3个不同的亚型:中国菌株的病毒群体归属于亚型Ⅰ和Ⅲ;日本病毒群体除Ja55属于亚型Ⅲ外,其余属于亚型Ⅱ;意大利病毒群体除IT192属于亚型Ⅰ外,其余都属于亚型Ⅲ。中国CHV1病毒群体的地理分布特点为:亚型Ⅰ主要分布在长江以北,其中只有09344(来自湖南)例外;而亚型Ⅲ主要分布在长江以南,但09228(北京)、09235(北京)、09277(辽宁)例外。这不同于欧洲主要以一种亚型为主的情况,表明各群体之间存在着一定的基因流动。本研究的结果表明中国CHV1病毒群体的遗传多样性比日本群体和意大利群体都丰富。

栗疫病菌侵染板栗枝条的显微观察

栗疫病是一种严重危害栗属植物的病害。为了明确栗疫病菌侵染板栗枝条的过程及侵染的关键时间点,本研究利用病理组织切片技术、显微镜和扫描电镜技术对栗疫病菌侵染板栗枝条的过程进行了观察。结果表明:接种栗疫病菌后0~5 h,菌丝先降解枝条表皮,进行横向营养生长的同时沿着伤口纵向侵染,为进入皮层做准备;接种后6 h病菌开始在表皮定殖,并侵入皮层;接种后9 h在皮层可观察到侵染性菌丝沿着细胞间隙向相邻细胞延伸;接种后12 h栗疫病菌侵入韧皮部,在皮层的侵染面积扩大。随着侵染程度加深,皮层、韧皮部等处细胞被菌丝降解,最终在形成层附近聚集。接菌后9 h为栗疫病菌侵染板栗枝条的关键时间点。