栝楼桂枝颗粒抗缺血性脑卒中大鼠神经元及原代海马神经元凋亡研究

目的:观察栝楼桂枝颗粒(GLGZG)抗缺血性脑卒中大鼠神经元及原代海马神经元凋亡的作用,探讨其作用机制,为其治疗脑卒中提供依据。方法:建立谷氨酸诱导原代海马神经元兴奋性毒性损伤模型、大鼠脑缺血再灌注损伤模型,采用MTT、LDH法测定GLGZG对原代海马神经元细胞活性和LDH活性的影响,采用Western Blot、Real-time PCR检测GLGZG对原代海马神经元及大鼠海马组织中Caspase-3、Bcl-2、Bax m RNA及蛋白表达水平的影响。结果:用不同浓度(100μg/m L、200μg/m L、300μg/m L)的GLGZG分别作用于原代海马神经元24 h,3个剂量组细胞存活率较谷氨酸组细胞存活率升高,其中GLGZG 200μg/m L、300μg/m L 2组细胞活力显著升高(P<0.05,P<0.01);3个剂量组LDH活力较谷氨酸组显著降低,其中GLGZG 200μg/m L、300μg/m L 2组可显著抑制谷氨酸损伤神经元LDH的释放(P<0.05,P<0.01)。GLGZG 200μg/m L、300μg/m L 2组干预后,与谷氨酸组比较可显著降低原代海马神经元Caspase-3 m RNA、Bax m RNA的表达(P<0.05,P<0.01),升高Bcl-2 m RNA的表达(P<0.05),蛋白表达的趋势与m RNA相似;GLGZG组与模型组比较,可降低大鼠海马组织Caspase-3、Bax蛋白的表达(P<0.05或P<0.01),升高Bcl-2蛋白的表达(P<0.01)。结论:GLGZG对缺血性脑卒中大鼠及原代海马神经元有一定的保护作用,其保护作用与其抗细胞凋亡作用有关。

栝楼桂枝颗粒对谷氨酸诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞兴奋性毒性损伤的影响

目的观察栝楼桂枝颗粒对谷氨酸诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)兴奋性毒性损伤的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用谷氨酸诱导PC12兴奋性毒性损伤造模。将细胞随机分为正常组、谷氨酸组和栝楼桂枝颗粒低(200μg/m L)、中(400μg/m L)、高(800μg/m L)剂量组,MTT法和LDH法检测PC12活力;Caspase-3活性检测法、Annexine V/PI双染色法检测细胞凋亡,Western blot和RT-PCR分别检测Bcl-2、Bax蛋白和m RNA表达。结果与谷氨酸组比较,MTT法栝楼桂枝颗粒各剂量组PC12活力升高,LDH法栝楼桂枝颗粒各剂量组细胞活力降低;Annexine V/PI双染色法栝楼桂枝颗粒各剂量组PC12凋亡率降低;Caspase-3活性检测法栝楼桂枝颗粒各剂量组Caspase-3活性降低;RT-PCR及Western blot检测栝楼桂枝颗粒各剂量组Bax表达降低、Bcl-2表达升高。结论栝楼桂枝颗粒对谷氨酸诱导PC12兴奋性毒性损伤有一定的保护作用,其保护作用与其抗细胞凋亡作用有关。

HPLC法测定栝楼桂枝颗粒中芍药苷含量

目的建立HPLC方法测定栝楼桂枝颗粒芍药苷含量。方法采用Kromasil C18色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸(16∶84)为流动相,流速1.0m L·min-1。结果制剂中芍药苷与其他组分均达到基线分离,加样回收率平均值为100.5%,RSD为1.8%。结论所建立的方法简便、快速、准确,可用于栝楼桂枝颗粒质量控制。

栝楼桂枝颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Ca^(2+)/CaMKⅡ/CREB信号通路的影响

目的观察栝楼桂枝颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Ca^(2+)/Ca MKⅡ/CREB信号通路的影响,探讨其作用机制。方法采用线栓法致大脑中动脉栓塞建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型。SD大鼠随机分为假手术组、模型组和中药组,中药组给予栝楼桂枝颗粒药液灌胃,连续7 d。采用改良的神经功能缺损评分法进行大鼠神经功能评分,测定大鼠脑梗死面积,采用透射电镜观察大鼠海马神经元超微结构,RT-PCR检测大鼠脑组织钙活化调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca MKⅡ)、c AMP反应元件蛋白(CREB)的基因表达,Western blot检测大鼠缺血侧脑组织p-CREB、p-CaMKⅡ、Ca MKⅡ、CREB和钙调蛋白(Ca M)的蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损和脑梗死面积评分显著升高,海马神经元超微结构改变明显,细胞高度水肿、细胞核和细胞质收缩,p-CREB蛋白表达降低,Ca M蛋白表达升高;与模型组比较,中药组大鼠神经功能评分和脑梗死面积显著降低,缺血区神经元超微结构改善,细胞损伤减少,p-CREB和p-CaMKⅡ蛋白表达升高,Ca M蛋白表达降低。结论栝楼桂枝颗粒能改善模型大鼠神经功能,抑制神经细胞凋亡,其作用机制可能与促进CREB、Ca MKⅡ的磷酸化,抑制Ca M的表达有关。

UHILIC-MS/MS同时测定栝楼桂枝颗粒中22个氨基酸的含量

目的建立一种超高效亲水作用色谱串联三重四极杆质谱法(UHILIC-MS/MS)对栝楼桂枝颗粒中22个氨基酸类成分(亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸等)进行含量测定。方法采用超高效亲水作用色谱串联三重四极杆质谱法,正离子多反应监测(MRM)模式进行含量测定。色谱条件:采用亲水作用色谱柱,Acquity BEH(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱,以(0.25%甲酸+2 mmol·L^(-1)甲酸铵)水(A)和乙腈(B)为流动相,梯度洗脱,进样量:1μL;流速:0.4 mL·min^(-1),柱温:45℃。结果在所设定的色谱条件下,6 min内完成对栝楼桂枝颗粒中上述22个成分的含量测定,在考察的浓度范围内呈良好的线性关系(r>0.9953),回收率和RSD分别在96.12~103.93%和1.49%~2.94%范围内,精密度、重复性、稳定性考察均符合分析要求。3批样品含量测定结果发现22个氨基酸中,瓜氨酸(Cit)、γ-氨基丁酸(GABA)、脯氨酸(Pro)、天冬酰胺(Asn)、精氨酸(Arg)含量较高,达到0.3 mg·g^(-1)以上。结论超高效亲水作用色谱串联三重四极杆质谱法定量分析方法简便、快捷、准确,分离效果较好,为揭示栝楼桂枝颗粒中氨基酸类成分的物质基础奠定实验依据。

HPLC法测定栝楼桂枝颗粒中芍药苷含量

目的 建立栝楼桂枝颗粒中芍药苷含量的测定方法.方法 采用高效液相色谱法测定芍药苷的含量：色谱柱为Hypersil ODS C18柱（250mm×4.60mm,5μm）;流动相为乙腈-水（81：19）;流速1.0mL·min-1;检测波长为233nm;柱温30℃;进样量为10μL.结果 HPLC法测定芍药苷含量,芍药苷在0.1～2.5μg范围内线性关系良好,平均回收率为100.26%,RSD为2.86%.结论 该方法简便可行、重复性好,可用于该制剂中芍药苷的质量控制.

栝楼桂枝颗粒质量标准研究

目的:研究并建立栝楼桂枝颗粒的质量标准。方法:采用薄层色谱法对处方中的天花粉、白芍、桂枝和甘草这四味中药进行鉴别,采用高效液相色谱法测定制剂中9种成分的含量。流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液,梯度洗脱;所使用的色谱柱为Diamonsil C_(18)柱(4.6mm×250mm,5μm);柱温:30℃,流速为0.8mL/min,检测波长为254nm。结果:天花粉、白芍、桂枝和甘草的薄层色谱斑点清晰,分离度好,9种指标成分在各自浓度范围内均与其峰面积具有优良的线性关系。加样回收率均在97.06%~99.58%之间(RSD=1.18%~1.95%,n=6)。结论:所建立的质量标准可用于栝楼桂枝颗粒的质量控制,确保其临床疗效。

RRLC-MS/MS法测定栝楼桂枝颗粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸含量

目的采用快速液相色谱-串联质谱法（RRLC-MS/MS）测定栝楼桂枝颗粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸含量。方法采用RRLC-MS/MS法,以极性AQ-C18柱为色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸水（5∶95）为流动相。质谱采用电子喷雾离子源（ESI）进行离子化,正离子模式下采集,选择以多反应监测（MRM）对这2种氨基酸的母离子及子离子进行检测,三重四级杆质谱进行定量分析。结果γ-氨基丁酸与瓜氨酸在0.265 0~10.60μg/m L和0.019 6~9.800μg/m L范围内与峰面积呈良好线性关系,平均样品加样回收率分别为99.4%和102.4%,RSD%分别为2.24%和1.85%。结论 RRLC-MS/MS法测定栝楼桂枝颗粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸的含量,方法简便、准确、稳定,重复性好。

栝楼桂枝颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠的血脑屏障通透性及神经保护作用

目的:探讨栝楼桂枝颗粒(GLGZG)对脑缺血再灌注损伤大鼠的血脑屏障(BBB)通透性的影响及神经保护作用。方法:文章采用大脑中动脉栓线阻断法制备局灶性脑缺再灌注损伤模型(MCAO),缺血2h后进行再灌注。采用HPLC-MS/MS定性分析正常大鼠及MCAO模型大鼠血浆、脑组织及脑脊液中GLGZG的成分。同时观察MCAO模型大鼠的神经功能缺损、BBB通透性变化、脑梗死体积测定和病理组织学变化。结果:经HPLC-MS/MS定性分析得出,GLGZG中的成分瓜氨酸、芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷可以通过BBB进入脑组织中,而在模型组中,成分异甘草素以及甘草酸亦可在脑组织或脑脊液中检测到。同时GLGZG能降低MCAO模型大鼠的神经功能缺损、减少伊文思蓝(EB)的渗透量、缩小脑梗死体积、减轻脑缺血再灌注的病理组织损伤。结论:GLGZG中的成分瓜氨酸、芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素以及甘草酸可以透过BBB进入脑组织中,对脑缺血再灌注损伤的大鼠起到神经保护作用,为今后进一步研究及临床用药提供实验依据。

栝楼桂枝颗粒激活Nrf2信号通路减轻脑缺血再灌注损伤大鼠氧化应激损伤作用

目的:探讨栝楼桂枝颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠氧化应激的保护作用及分子机制。方法:建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,栝楼桂枝颗粒灌胃给药后,核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检测大鼠脑梗死面积,化学荧光法测定脑组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,硫代巴比妥酸法(TBA)测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,水溶性四唑蓝法(WST)测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,紫外法测定过氧化氢酶(catalase,CAT)和比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力;蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR法(Realtime PCR)分别检测脑组织中核转录因子-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2),细胞质中血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1),醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]及Kelch样ECH联合蛋白1(Kelch-like ECHassociated protein1,Keap1)的蛋白表达和mRNA相对含量。结果:栝楼桂枝颗粒能够明显减小大鼠脑梗死面积,减少ROS和MDA的产生(P<0.01),增加SOD,CAT和GSH-Px活力(P<0.01)。此外,栝楼桂枝颗粒能够上调脑组织中Nrf2,HO-1,NQO1及Keap1的表达。结论:栝楼桂枝颗粒可能通过上调Nrf2信号通路,从而抑制脑缺血再灌注损伤引起的氧化应激反应。

栝楼桂枝颗粒对神经元兴奋性毒性损伤后钙信号通路的影响

目的研究栝楼桂枝颗粒对N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid,NMDA)诱导神经元兴奋性毒性损伤后钙信号通路的影响,并探讨其可能的机制。方法建立NMDA诱导神经元兴奋性毒性损伤模型,栝楼桂枝颗粒干预后,采用MTT、LDH法检测神经元活性,免疫荧光染色法检测神经元特异性指标MAP-2蛋白的表达。Real-time PCR法检测神经元中CaMKⅡ、CREB mRNA的表达,Western blot法检测p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB及CaM蛋白的表达。结果与NMDA组比较,栝楼桂枝颗粒(200,300μg·mL^-1)组可显著提高细胞活力,降低LDH浓度(P<0.05或P<0.01),明显升高CREB、CaMKⅡ mRNA水平(P<0.05或P<0.01),明显升高MAP-2、p-CREB、p-CaMKII及CREB水平(P<0.01),而显著降低CaM水平(P<0.01)。结论栝楼桂枝颗粒对NMDA诱导的神经元兴奋性毒性损伤具有保护作用,此作用可能与促进CREB、CaMKⅡ的磷酸化,抑制CaM的表达有关。

栝楼桂枝颗粒对NMDA诱导海马神经元兴奋性毒性损伤的保护作用

目的:建立NMDA诱导大鼠海马神经元兴奋性毒性损伤模型,探讨栝楼桂枝颗粒对NMDA损伤神经元的保护作用,为栝楼桂枝颗粒临床治疗缺血性脑卒中提供实验依据。方法:选用出生24h内的新生大鼠分离培养原代海马神经元,采用免疫荧光法鉴定神经元纯度。在此基础上建立NMDA诱导的大鼠海马神经元兴奋性毒性损伤模型,不同浓度的栝楼桂枝颗粒干预后,采用MTT、LDH法检测神经元细胞活性,电子显微镜下观察神经元超微结构改变,采用Hoechst 33342染色法、流式细胞术检测神经元凋亡情况。结果:大鼠海马神经元生长状态良好,鉴定纯度在90%以上。不同浓度的栝楼桂枝颗粒与海马神经元共培养24h,海马神经元生长状态良好。细胞活性检测、Hoechst染色、Annexine V/PI双染法测定结果一致表明,NMDA诱导了神经元凋亡;与NMDA组比较,栝楼桂枝颗粒200、300μg/m L组可显著提高神经元活性(P<0.05,P<0.01),栝楼桂枝颗粒100、200、300μg/m L组显著减少LDH释放(P<0.05,P<0.01),抑制NMDA诱导的神经元凋亡。结论:该大鼠海马神经元体外原代培养方法简便可行;一定浓度的栝楼桂枝颗粒可减轻NMDA诱导的原代海马神经元损伤,提高神经元活力、抑制其凋亡,对其具有保护作用。

栝楼桂枝颗粒抑制MCAO大鼠神经元凋亡的机制研究

目的研究栝楼桂枝颗粒(Gualou Guizhi granule,GLGZG)是否通过调控PI3K/AKT通路抑制脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡而达到抗脑缺血再灌注损伤的作用。方法 SD大鼠36只,♂,分为假手术组、大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)组、GLGZG组,每组12只。其中MCAO组、GLGZG组采用线栓法致MCAO建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,GLGZG灌胃给药,连续给药7 d。采用改良的神经功能缺损评分法对大鼠神经功能损伤进行评分,MRI观察大鼠脑梗死体积,Real-time PCR检测脑组织中PI3K、Akt m RNA的表达,Western blot法检测大鼠缺血侧脑组织PI3K(p85)、Akt、p-Akt、PDK1、Bcl-2、Bcl-x L、cleaved-caspase-3、Bad、Bax蛋白表达。结果与MCAO组比较,GLGZG组神经行为学评分降低,第5、7天神经评分显著低于MCAO组(P<0.05);与MCAO组比较,MRI观察发现GLGZG组大鼠脑梗死体积显著减小(P<0.05);PI3K(p85)、p-Akt、PDK1、Bcl-2、Bcl-x L蛋白的表达上调(P<0.01),cleaved-caspase-3、Bad、Bax蛋白的表达下调(P<0.01),对Akt的表达没有影响。结论 GLGZG能够提高MCAO大鼠神经功能,抑制神经细胞凋亡,其作用机制可能是通过激活PI3K/AKT信号通路抑制MCAO大鼠神经元凋亡。

栝楼桂枝颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体能量代谢的影响

目的:探讨栝楼桂枝颗粒是否通过调控线粒体能量代谢对脑缺血再灌注损伤大鼠起到脑保护作用。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组和中药组。采用线栓法制备脑缺血再灌注模型,采用神经功能缺损评分法(mNSS)进行大鼠神经功能评分,测定大鼠脑梗死面积,采用透射电镜观察脑线粒体超微结构的改变;采用分光光度法测定线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ的活力来评价栝楼桂枝颗粒对模型大鼠线粒体能量代谢的影响;利用免疫组化法观察解偶联蛋白4(UCP4)和ATPase 6在脑组织中的表达。结果:与模型组比较,中药组大鼠神经行为学情况得到显著改善(P<0.05),缺损程度降低(P<0.05);中药组对模型大鼠脑线粒体超微结构病理状态有改善作用;中药组能够提高模型大鼠脑组织中线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ的活力(P<0.05)、脑组织中ATP的含量(P<0.05),显著提高模型大鼠脑组织中Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性(P<0.05,P<0.01);中药组能够恢复模型大鼠脑组织中UCP4和ATPase 6的表达(P<0.01)。结论:栝楼桂枝颗粒可以通过保护线粒体而调节线粒体能量代谢从而起神经保护作用。

栝楼桂枝颗粒对脑缺血再灌注损伤模型大鼠缺血区脑组织内质网应激及细胞凋亡的影响

目的探讨栝楼桂枝颗粒治疗脑缺血再灌注损伤的可能作用机制。方法54只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、栝楼桂枝颗粒组,每组18只。模型组、栝楼桂枝颗粒组大鼠采用线栓法致大脑中动脉栓塞建立脑缺血再灌注损伤模型,假手术组除不插入线栓外其余操作同模型组。各组于造模后2 h开始干预,假手术组和模型组给予生理盐水10 ml/kg灌胃,栝楼桂枝颗粒组给予栝楼桂枝汤颗粒剂3.6 g/(kg·d)灌胃。各组均每日1次,连续7天。采用改良的神经功能缺损评分(mNSS)、转角实验对大鼠神经损害程度进行评价;采用TUNEL法检测大鼠缺血区脑组织细胞凋亡情况,采用Western blot法检测脑组织中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、神经元特异核蛋白(NeuN)的相对表达量;Real-Time PCR法检测缺血区脑组织内质网应激相关因子真核生物起始因子2α(elF2α)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、内质网源性转录因子(CHOP)、转录激活因子4(ATF4)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的mRNA表达;Western blot法检测缺血区脑组织ATF4、CHOP、PERK、elF2α、磷酸化真核生物起始因子2α抗体(p-elF2α)、磷酸化蛋白激酶RNA样内质网激酶(p-PERK)蛋白的表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠mNSS评分、转角百分率升高,缺血区脑组织细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2及NeuN蛋白表达降低(P<0.01);缺血区脑组织中GRP78、PERK、eIF2α、CHOP、ATF4 mRNA升高,CHOP、ATF4蛋白表达及p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α值亦升高(P<0.01)。与模型组比较,栝楼桂枝颗粒组大鼠上述各指标均明显改善(P<0.05或P<0.01)。结论栝楼桂枝颗粒可通过抑制内质网应激,从而抑制脑缺血损伤后神经细胞凋亡,进而发挥抗脑缺血再灌注损伤作用。

栝楼桂枝解痉颗粒的制备工艺研究

目的：探讨栝楼桂枝解痉颗粒的制备工艺。方法：采用L9（34）正交试验法，以干膏得率为指标，通过方差分析，对提取工艺进行优选；并通过对辅料、颗粒流动性、颗粒吸湿率的考察，确定最佳成型工艺。结果：栝楼桂枝解痉颗粒最佳制备工艺为：桂枝粉碎成细粉备用，其余五味加水提取二次，每次加10倍量水，煎煮1．5小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.20（60℃）的清膏，加人上述桂枝细粉及适量糊精，混匀，制成颗粒，50～60℃干燥，整粒，即得。结论：该工艺简便、稳定、可行，适用于我院栝楼桂枝解痉颗粒的生产。