广西岭景镇某山村蝙蝠携带SARS样冠状病毒及狂犬病毒的调查研究

目的了解广西岭景镇某山村蝙蝠携带SARS样冠状病毒及狂犬病毒的情况。方法对广西岭景镇某山村开展流行病学调查,捕捉蝙蝠,采集咽拭、肛拭及粪便标本,进行RT-PCR和细胞分离培养检测狂犬病毒(Rabies virus,RV)、SARS样冠状病毒(SARS-like Coronavirus,SARS-like-CoV)。结果本次调查收集了4只犬蝠(Cynopterus sphinx)、6只普氏蹄蝠(Hipposideros pratti,)和7只中菊头蝠(Rhinolophus affinis),在采集的标本中未检测到SARS样冠状病毒及狂犬病毒。结论未发现调查的3种蝙蝠携带SARS样冠状病毒及狂犬病毒。

蝙蝠SARS样冠状病毒S蛋白受体结合域在昆虫细胞中的表达和纯化

目的:在昆虫细胞表达系统中表达蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白的受体结合域,并探讨其表达动力学和纯化条件。方法:以PCR扩增蝙蝠SARS样冠状病毒Spike基因的受体结合域片段,产物连接到pMD-T载体,再亚克隆至供体质粒pFAST-HTB,经序列测定确认基因正确克隆,进一步将其转座入Bacmid中,在昆虫细胞Sf9中进行表达,采用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析,并通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白。结果:在昆虫细胞表达系统中表达出蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白的受体结合域片段,当感染复数(multiplicity of infectiin,MOI)为2时,重组病毒感染细胞56 h后,重组蛋白的表达量达到峰值。结论:蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白的受体结合域片段在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达,并可通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白。

蝙蝠SARS样冠状病毒WIV1利用小鼠ACE2受体研究

严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)是一种感染人类的高致病性病毒,由蝙蝠SARS样冠状病毒(SL-CoV)演化而来。血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS-CoV受体,影响病毒宿主范围、致病性和种间传播。先前研究表明,SARS-CoV和一些SL-CoV株(如WIV1)可以有效利用人、果子狸、蝙蝠ACE2入侵细胞,而SARS-CoV可以低效利用小鼠ACE2。啮齿动物种类多,分布广,包括多种重要的试验动物模型,不过SL-CoV利用啮齿动物ACE2的研究较少。本研究通过假病毒感染试验,比较了SARS-CoV BJ01株和SL-CoV WIV1株利用人类、果子狸、蝙蝠、小鼠ACE2及其突变体进入细胞的效率,并利用蛋白结合试验比较了BJ01和WIV1受体结合结构域(RBD)结合不同ACE2及其突变体的能力。结果显示,SL-CoV WIV1可以有效利用小鼠ACE2进入细胞,且WIV1 RBD与小鼠ACE2结合效率与人和果子狸ACE2相同,强于蝙蝠ACE2;而不同物种ACE2的L440P突变能显著降低其与BJ01及WIV1的RBD结合的能力,抑制假病毒入侵。研究结果表明,小鼠ACE2是SL-CoV WIV1的功能受体,且ACE2的L440是影响病毒入侵的关键氨基酸位点。本研究有助于进一步了解SL-CoV的受体识别、跨种传播机制,对今后类似冠状病毒的防控具有重要意义。

能利用ACE2受体的蝙蝠SARS样冠状病毒的分离和鉴定

2002年3月由严重急性呼吸综合征冠状病毒（severeacuterespiratorysyndromecoronavirus，SARS．CoV）导致的疫情大流行无疑是当代最受关注的公共卫生事件。近来中东呼吸综合征冠状病毒（MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus）疫情的爆发表明这类病毒仍然具有很大威胁，而且其分布比预期的更加广泛。尽管蝙蝠被认为是这2种冠状病毒的自然宿主，但是目前仍未能从蝙蝠中分离出SARS-CoY的祖先病毒（progenitorvires）。据报道，在中国、欧洲和非洲的蝙蝠中曾经发现了多种SARS样冠状病毒（SARS-likecomnavimses，SL-CoVs），但是它们都不是SARS冠状病毒的直接祖先，。因为其系统发生与SARSCoY不一致，而且其突起蛋白都不能利用SARS．CoV的细胞受体分子，

蝙蝠来源的重症急性呼吸综合征样冠状病毒WIV1刺突蛋白利用浣熊狗血管紧张素转换酶Ⅱ受体侵入细胞能力的研究

目的研究蝙蝠来源的重症急性呼吸综合征(SARS)样冠状病毒WIV1刺突蛋白利用浣熊狗血管紧张素转换酶Ⅱ(ACE2)受体侵入细胞的能力,并探究SARS样冠状病毒WIV1潜在的跨宿主传播风险。方法构建来自浣熊狗、果子狸、中华菊头蝠和人等不同动物来源的ACE2表达质粒,转染至293T细胞并利用免疫印迹方法检测其在293T细胞中的表达水平;建立SARS冠状病毒(Tor2株系)及蝙蝠SARS样冠状病毒(WIV1株系)假病毒感染系统,并进行假病毒感染实验;利用假病毒感染系统及荧光素酶报告基因检测WIV1刺突蛋白对浣熊狗等不同动物来源ACE2受体利用能力;构建跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)质粒,并转染至T Rex 293细胞,借助假病毒感染系统检测TMPRSS2对WIV1侵入能力的影响。结果本研究所获赠及构建的不同动物来源的ACE2质粒可经瞬时转染至细胞进行表达;与pc DNA3.1载体相比,浣熊狗、中华菊头蝠、果子狸和人的ACE2均可使蝙蝠SARS样冠状病毒WIV1侵入细胞的能力增加上万倍,上述ACE2组与载体组的荧光素酶活性差异均具有统计学意义(t=27.744、P<0.001,t=18.740、P<0.001,t=32.297、P<0.001,t=15.902、P<0.001);与TMPRSS2阴性组相比,TMPRSS2在靶细胞的表达可使WIV1假病毒的感染能力增加10倍以上,两组荧光素酶活性差异具有统计学意义(t=29.460、P<0.001)。结论蝙蝠SARS样冠状病毒WIV1的刺突蛋白除了利用人类、果子狸及中华菊头蝠的ACE2受体感染细胞,还可利用浣熊狗的ACE2受体侵入细胞,且TMPRSS2可显著促进其侵入能力,提示WIV1可能存在多种跨宿主传播的风险。

SARS冠状病毒基因溯源分子生物信息学分析

目的:对广东省两次流行的SARS冠状病毒(SARS-CoV)进行分子水平的溯源分析,为进一步研究SARS冠状病毒提供分子生物信息学资料。方法:对GenBank登录的SARS冠状病毒和SARS样冠状病毒(SARS-like CoV)核酸序列进行了分析,以Breda病毒为外组,构建了SARS冠状病毒和SARS样冠状病毒系统进化树,并进行单核苷酸变异分析。结果:发现两次SARS自然流行的病毒可分为两个明显不同的聚类;第二次流行时从人类中分离的SARS冠状病毒和从果子狸等动物中分离的SARS样冠状病毒可分为两个基因型,两型的主要鉴别依据是病毒的全基因组变异而非Spike基因序列。结论:前后两次SARS自然流行病毒可能以不同的特性感染人类而不是简单的重复。结合流行病学资料,对第二次流行时的SARS冠状病毒进行分子水平溯源分析的结果表明,分离自前2例指标患者的病毒基因序列与来自果子狸等动物的SARS样冠状病毒的基因序列存在较大的差异。提示第二次流行的SARS冠状病毒由果子狸等动物传染人的论据不足。

广州及周边地区蝙蝠携带SRAS冠状病毒的流行病学调查

目的了解野生动物市场果蝠携带SARS冠状病毒(SARS-CoV)和SARS样冠状病毒(SARS-like-CoV)情况。方法2004年9月至2005年11月,在广州及广州野生动物市场收集来自广州及周边地区的分属两个亚目9个种的蝙蝠共905只,有犬蝠(Cynopterussphinx)、棕果蝠(Rousettusleschenaulti)、普通长翼蝠(Miniopterusschreibersi)、普氏蹄蝠(Hipposiderospratti)、中华菊头蝠(Rhinolophussinicus)、小黄蝠(Scotophiluskuhlii)、大耳双色蹄蝠(HipposiderosPomona)、中菊头蝠(Rhinolophusaffinis)和小菊头蝠(Rhinolophuspusillus)。收集的蝙蝠分别取得咽拭813份、血清524份、肺组织853份及直肠粪便853份标本共计3043份,用新型冠状病毒(N-蛋白)测定试剂盒(酶联免疫法)、SARS-CoVRNA检测试剂盒、荧光PCR及基因芯片检测并通过RT-PCR和细胞分离培养检测SARS-CoV和SARS-like-CoV。结果收集的9个种905只蝙蝠共3043份标本未检测、分离出SARS-CoV和SARS-like-CoV。结论调查的广州及周边地区的9种蝙蝠均未检测到SARS-CoV和SARS-like-CoV。

电镜观察从非典型肺炎患者尸检标本中发现衣原体样和冠状病毒样颗粒(摘要)

目的 探索 2 0 0 2年末暴发于广东等地的非典型肺炎的病原。方法 对来自广东、山西、四川省和北京市的 7例非典型肺炎死亡病人的尸体解剖标本进行超薄切片电镜观察 ,将病人肺组织提取物接种于 2 93细胞 (人胚肾转化细胞系 ) ,分离病原 ,对病人组织中和分离的病原进行免疫学鉴定。结果 超薄切片电镜观察 ,在死亡患者的肺 (7例 )、脾 (2例 )、肝 (2例 )、肾 (3例 )和淋巴结 (1例 )中均观察到衣原体样包涵体和网质小体、中间体、原生小体颗粒的存在 ,并在 3例病人肺组织中同时见到了冠状病毒样颗粒和未知的基质样结构。用RT PCR方法从 2例病人肺组织中扩增出冠状病毒RNA聚合酶基因片段。将病人肺组织提取物接种于 2 93细胞进行培养 ,取第 2代细胞作电镜观察 ,也发现衣原体样颗粒和包涵体的存在。在病人组织和培养细胞中见到的衣原体样颗粒均不能与衣原体属特异性抗体和抗肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体抗体反应 ,提示可能为新的衣原体样因子。结论 在死亡病人组织和培养细胞中发现的衣原体样和冠状病毒样颗粒 ,可能是广东等地暴发的非典型肺炎的主要病原。

新近发现的冠状病毒研究进展

冠状病毒是自然界中广泛存在的一大类家族,人和多种动物易感。人冠状病毒感染后,通常引起普通感冒症状,严重者能造成死亡。冠状病毒广泛的宿主性以及自身基因组的结构特征使其在进化过程中极易发生基因重组,呈现遗传多样性;新亚型及新的冠状病毒在此过程中不断出现。本文针对新近出现的冠状病毒,尤其是SARS样冠状病毒(SARS-like-CoVs)以及2012年发现的新型人冠状病毒EMC(HCoV-EMC)的基因组结构特征及冠状病毒跨种属传播机制的最新研究进展作简要论述。

含SARS冠状病毒（SCoV）S蛋白的嵌合冠状病毒样颗粒能保护小鼠抵抗SCoV攻击

为预防SARS再次在人类暴发流行，迫切需要研制有效的疫苗，病毒样颗粒（VLP）是目前研究的SARS疫苗中的一种。

鳗鱼“狂游病”病原学研究

对近两年在我国福建省等地养殖的鳗鱼暴发流行的一种不明病因的疾病（俗称“狂游病”），通过寄生虫学、细菌学、病毒学检查，以及人工感染回归试验，确认其病原为鳗冠状病毒样病毒。该病毒主要侵害鳗鱼的肝脏、肾脏和心脏，导致这些器官的实质细胞呈现变性。

基于Mpro和PLP筛选潜在抗新型冠状病毒中药研究

新型冠状病毒感染疫情发展迅速,中药在这场防治疫情的战争中发挥着积极作用,已有大量确有疗效的方剂应用于临床。然而由于中药具有多成分、多靶点、多途径协同作用的特点,传统的抗病毒中药筛选研究受限于实验室条件和实验周期,极大地限制了筛选速度。该文基于分子对接进行潜在抗新型冠状病毒中药的筛选,通过获取2019-nCoV冠状病毒3CL水解酶(3CL protease,Mpro)和冠状病毒木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLP)的晶体结构,对中药化学成分数据库(traditional Chinese medicine database,TCMD 2009)进行基于分子对接的虚拟筛选,选择打分值排名前100的成分作为潜在抗新型冠状病毒活性的中药成分,并对成分来源中药进行频数统计,挑选命中成分数目较多的中药作为潜在抗新型冠状病毒活性的中药。研究结果显示,基于Mpro靶点筛选获得潜在抗新型冠状病毒活性成分12322个,代表性活性成分有紫菀五肽A、川芎嗪、丹酚酸B等,筛选得到的中药为生姜、紫菀、三七、川芎、丹参、干姜、瞿麦、大黄、肉苁蓉等;基于PLP靶点筛选获得潜在抗新型冠状病毒活性成分11294个,代表性活性成分有姜酮酚、白果醇、阿魏酸等,筛选得到的中药为党参、羌活、生姜、白果、川芎、瓜蒌、白芍、补骨脂、苦参、三七、当归等。结合文献报道的基于分子对接筛选的血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)靶点抑制活性候选中药,该文在湖南省新型冠状病毒肺炎中医药诊疗方案的基础上,将Mpro抑制、PLP抑制和ACE2抑制候选中药针对该疫情的合理应用进行了探讨,分析结果表明,PLP抑制活性筛选获得的瓜蒌及ACE2筛选获得的贝母包含于桑贝止嗽散、小陷胸汤之中,有清化热痰之功效,主治痰热壅肺所致的痰多咳喘或燥痰犯肺、干咳少痰、咯痰不爽,可应用于病毒作用初期外邪闭肺所致的咳嗽微喘等证型;Mpro抑制活性筛选获得的中药大黄佐以PLP筛选获得的瓜蒌,清泻腑气,二者包含于麻杏石甘汤、宣白承气汤中,可应用于疾病重症期邪热壅肺、疫毒闭肺以致腑实里结等证型;ACE2抑制活性筛选获得的中药桑叶、金银花及连翘包含于桑菊饮和银翘散中,轻清宣透,可应用于疾病初期温邪犯肺及咳嗽微喘等证型。研究结果旨在为进一步开展中医药应对新型冠状病毒疫情的治疗方案提供参考。

新型冠状病毒的自述

我外形如花冠而得名冠状病毒,人们谈我色变。因为我与蝙蝠SARS样冠状病毒起源于共同的病毒因素达85%以上,人们又称我为新型冠状病毒2019-nCoV。

Genetic diversity of coronaviruses in Miniopterus fuliginosus bats

Coronaviruses, such as severe acute respiratory syndrome coronavirus and Middle East respiratory syndrome coronavirus, pose significant public health threats. Bats have been suggested to act as natural reservoirs for both these viruses, and periodic monitoring of coronaviruses in bats may thus provide important clues about emergent infectious viruses. The Eastern bent-wing bat Miniopterus fuliginosus is distributed extensively throughout China. We therefore analyzed the genetic diversity of coronaviruses in samples of M. fuliginosus collected from nine Chinese provinces during 2011–2013. The only coronavirus genus found was Alphacoronavirus. We established six complete and five partial genomic sequences of alphacoronaviruses, which revealed that they could be divided into two distinct lineages, with close relationships to coronaviruses in Miniopterus magnater and Miniopterus pusillus. Recombination was confirmed by detecting putative breakpoints of Lineage 1 coronaviruses in M. fuliginosus and M. pusillus(Wu et al., 2015), which supported the results of topological and phylogenetic analyses. The established alphacoronavirus genome sequences showed high similarity to other alphacoronaviruses found in other Miniopterus species, suggesting that their transmission in different Miniopterus species may provide opportunities for recombination with different alphacoronaviruses. The genetic information for these novel alphacoronaviruses will improve our understanding of the evolution and genetic diversity of coronaviruses, with potentially important implications for the transmission of human diseases.

国内猪流行性腹泻防治概况

前言:近来,国内以猪流行性腹泻(PED)为主的猪群腹泻性疾病日渐增多,因此造成了生猪出栏率急剧降低,并直接导致生猪价格持续偏高。本文就PED的流行史、流行现状、发病机理、疫苗免疫效果及防治方案进行概述,并结合临床实践,指出各类预防与治疗方案效果的优缺点,以期能为养殖者提供实用、可靠的PED防治策略。