大鼠体内Pig-a基因突变试验影响因素研究

目的为进一步完善和推广应用Pig-a基因突变试验,本研究拟在本实验室建立的试验方法基础上,对影响试验结果稳定性的3种主要影响因素进行探讨。方法15只雄性SD大鼠按照体重随机分为3组:溶媒对照组(PBS,pH=6.0)、N-乙基-N-亚硝基脲(N-Ethyl-N-nitrosourea,ENU)20和80 mg/kg·bw剂量组。连续经口灌胃3 d,于暴露后28 d取血。按照本实验室已建立的流式细胞术Pig-a基因突变试验双染(CD59-APC/SYTO 13)或三染(CD59-APC/CD61-PE/SYTO 13)方案,针对网织红细胞突变频率(RET^CD59-)、成熟红细胞突变频率(RBC^CD59-)和网织红细胞比例3项指标,分别进行多项影响因素检测:样本贮存液和贮存时间[肝素钠抗凝剂和血液保存液-1(枸橼酸-磷酸-葡萄糖-腺嘌呤,citrate phosphate dextrose adenine-1,CPDA-1),0~6 d]、样本染色前贮存时间(0~24 h)和样本染色后固定和贮存时间(1%多聚甲醛,0~24 h)。结果使用双染方案时,4℃避光保存条件下,CPDA-1保存6 d内RBC^CD59-、RET^CD59-和RET比例指标均未见明显影响(P>0.05);而肝素钠溶液第3天即可观察到RETCD59-明显升高,与第0天相比差异具有统计学意义(P<0.05)。肝素钠溶液4℃避光保存24 h时使用三染方案检测,3项指标与第0 h相比差异无统计学意义(P>0.05);而6 h时使用双染方案检测可观察到与第0 h相比,RET^CD59-差异具有统计学意义(P<0.05)。双染方案染色后,未固定样本高剂量组在第12 h与第0 h相比,RET^CD59-差异具有统计学意义(P<0.05),RET比例在第6 h明显降低(P<0.05),但经1%多聚甲醛固定后导致RET^CD59-和RET比例降低幅度更为明显(P<0.05)。结论使用CPDA-1保存血液样本时(避光4℃),可使样本保存时间延长至6 d(双染方案)。使用肝素钠溶液保存血液样本时(避光4℃),双染方案检测时间需在6 h内,而三染方案检测时间可延长至24 h。1%多聚甲醛固定可能不适用于Pig-a基因突变试验。