核不均一核糖核蛋白E1表达与人乳头瘤病毒18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发的相关性

目的检测核不均一核糖核蛋白E1(hnRNP E1)在人乳头瘤病毒(HPV)18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织中表达情况,探讨其与术后复发的关系。方法选取2016年6月至2019年2月北京核工业医院收治的80例HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者的癌组织标本和80例子宫良性疾病患者的正常宫颈组织标本作为研究对象,采用免疫组织化学染色法检测宫颈癌和正常宫颈组织中hnRNP E1蛋白的表达。根据宫颈癌患者术后3年内复发情况将患者分为复发组(n=15)和未复发组(n=65),分析hnRNP E1蛋白表达与HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发的关系及影响HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发的危险因素。结果HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织中hnRNP E1蛋白表达阳性率显著低于正常宫颈组织(P<0.05);复发组宫颈癌组织中hnRNP E1蛋白表达阳性率显著低于未复发组(P<0.05);肌层浸润深度、淋巴结转移、病理类型、脉管浸润、宫旁浸润、hnRNP E1蛋白表达与HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发有关(P<0.05);有脉管浸润、有宫旁浸润、hnRNP E1蛋白阴性表达是HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发的独立危险因素(P<0.05)。结论hnRNP E1蛋白在HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织中阳性表达率降低,且与宫颈癌患者术后复发有关,可作为HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者潜在的预后标志物。

原发性肝细胞肝癌中核不均一核糖核蛋白A_1的定位及临床意义

目的:观察核不均一核糖核蛋白A_1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A_1,hnRNP A_1)在原发性肝细胞肝癌(肝癌)中的定位,初步分析该蛋白定位与肝癌患者临床病理特征之间的相关性及其预测患者术后复发转移的临床价值。方法:由323例肝癌患者肝癌组织构成组织芯片集,采用免疫组织化学染色技术,观察肝组织中hnRNP A_1的定位,分析hnRNP A_1定位与临床病理特征及患者预后的相关性。结果:hnRNP A_1蛋白在正常肝细胞核中表达呈弱阳性,在肝癌组织的细胞核和细胞质中均有不同程度的阳性表达。hnRNP A_1在肝癌细胞质中定位的肝癌患者的术后预后最差。结论:hnRNP A_1蛋白是较好的独立预后指标,其能准确预测肝癌患者术后的预后。

人源核不均一核糖核蛋白E1真核表达载体在神经细胞中的表达

背景:人源核不均一核糖核蛋白E1功能广泛,可参与神经系统骨架蛋白的表达。目的:为深入研究其在神经细胞中的作用,构建其真核表达载体,观察其在神经细胞中的表达。方法:利用真核表达载体pcDNATM4/His C,通过亚克隆构建核不均一核糖核蛋白E1-pcDNATM4/His C重组质粒,经酶切、测序鉴定,通过转染神经细胞SH-SY5Y,采用western-blot,RT-PCR鉴定核不均一核糖核蛋白E1重组质粒的表达,并观察转染细胞的生长现象。结果与结论:成功构建了核不均一核糖核蛋白E1的真核表达载体,mRNA和蛋白水平上均证实了该质粒可在神经细胞SH-SY5Y中正确表达。SH-SY5Y细胞在转染核不均一核糖核蛋白E1后表现为加速生长。提示该蛋白对神经细胞的生长发育具有重要的作用。该载体为进一步研究核不均一核糖核蛋白E1在神经系统中的功能提供了前提条件。

痰中检测核不均一核糖核蛋白A2/B1早期诊断肺癌的意义

目的:探讨检测痰中核不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1)在肺癌早期诊断中的意义。方法:收集63例疑诊肺癌患者的痰标本,分别采用痰涂片、痰细胞块切片细胞学检查(镜检找到癌细胞即诊断为肺癌)及痰细胞块切片免疫组织化学检测hnRNP A2/B1(表达阳性即诊断为肺癌)进行诊断,比较2种诊断方法的结果。结果:痰涂片及痰细胞块切片细胞学检查诊断肺癌的敏感度为31.8%,特异度为100%。痰细胞块检测hnRNP A2/B1诊断肺癌的敏感度为80%,特异度为68.4%。检测痰hnRNP A2/B1的敏感度显著高于痰细胞学检查(P<0.01)。结论:痰细胞块结合免疫组织化学法检测hnRNP A2/B1有助于发现早期肺癌。

检测核不均一核糖核蛋白A2/B1在胸水细胞学鉴别诊断中的意义

目的:观察核不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)在胸水转移性肺腺癌细胞和间皮细胞中的表达,评价其用于两者鉴别诊断的价值。方法:采用细胞块技术对100例胸水进行免疫组织化学检测,观察hnRNPA2/B1在肺腺癌细胞和间皮细胞中的表达。结果:hnRNPA2/B1标记肺腺癌细胞的敏感度为100%,特异度为70%。结论:检测hnRNPA2/B1对鉴别胸水肺腺癌细胞和间皮细胞很有帮助。

用生物信息学方法克隆大鼠核不均一核蛋白A2/B1基因

采用外显子预测、序列匹配、序列拼接等生物信息学方法电子克隆了一个在大鼠心肌缺血预适应中表达上调的表达序列标签所代表的核不均一核蛋白A2/B1基因,用逆转录聚合酶链反应证实了该基因的开放阅读框。它的开放阅读框为1026 bp,由10个外显子构成,推测编码341个氨基酸。它的编码区与人和小鼠的核不均一核蛋白A2/B1基因分别有92％和95％的一致性,蛋白质序列的一致性几乎为100％。这些结果表明核不均一核蛋白A2/B1基因在不同物种间高度保守,它在大鼠心肌缺血预适应中表达上调,可能在缺血预适应的内源性保护机制中发挥了重要的作用。

核糖体蛋白S9在多发性骨髓瘤中的表达及对其细胞生物学功能的影响

目的明确核糖体蛋白S9(RPS9)在多发性骨髓瘤中的表达情况,并明确其对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及相应机制。方法 选取10例健康志愿者骨髓单个核细胞(CON组)与30例多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞(CD138+组),实时荧光定量PCR检测RPS9在mRNA水平的表达,并选取3例CON与11例CD138+细胞,Westernblot检测RPS9在蛋白水平的变化,同时选取GSE19784数据集,检测RPS9的表达与患者总体生存率、核因子-κB(NF-κB)、类泛素蛋白修饰分子(SUMO)、泛素通路之间的关系。随后构建RPS9-短发夹RNA(shRNA)敲低载体,使用流式细胞仪检测感染效率、实时荧光定量PCR与Westernblot检测敲低效率后。RPMI8226分为CON与RPS9-shRNA组,使用膜联蛋白V别藻青蛋白/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡的变化、CCK8法检测细胞增殖的变化、PI染色法检测细胞周期的变化。并构建类泛素蛋白修饰分子特异蛋白酶1(SENP1)过表达载体,Westernblot确定过表达效率后,检测RPS9抑制后SENP1表达的变化,并在RPS9-shRNA中转染SENP1过表达载体,Westernblot检测CON、RPS9-shRNA、RPS9-shRNA-SENP1细胞中NF-κB通路P65、抑制因子κBα(IκBα)磷酸化水平的变化,膜联蛋白V/PI双染法检测细胞凋亡的变化。结果 RPS9在10例健康志愿者骨髓单个核细胞(CON)以及30例多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞中相对表达量分别为1.00±0.12和5.45±0.71(t=4.291,P=0.0036),Westernblot中大多数骨髓瘤CD138+细胞中RPS9呈现高表达,RPS9的高表达同时与患者髓外浸润相关,并在GSE19784数据集中与患者总体生存率相关。RPMI8226在感染CON与RPS9-shRNA慢病毒48h后,流式细胞仪证实两组细胞感染效率均在90%以上,实时荧光定量PCR与Westernblot证实RPS9在mRNA与蛋白水平的表达均受到抑制。RPMI8226CON与RPS9-shRNA感染病毒48h后,CON与RPS9-shRNA组细胞膜联蛋白V阳性细胞比例分别为3.47±0.37和18.60±1.64,RPS9-shRNA组显著高于CON组(t=9.015,P=0.0008)。在增殖中,CON组与RPS9-shRNA组在72h时增殖指数差异有统计学意义(t=6.846,P=0.0024)。而在细胞周期中,CON与RPS9-shRNA组在感染病毒48h时,G2期细胞比例分别为(29.28±3.42)%和(10.43±1.43)%,CON组显著高于RPS9-shRNA组,差异有统计学意义(t=9.329,P=0.0007)。RPS9的表达在GSE19784数据集中与SENP1正相关,并与IκBα编码基因NFKBIA呈负相关,Westernblot进一步证实RPS9的敲低能够抑制SENP1的表达,并抑制NF-κB亚基P65、抑制因子IKBα的磷酸化,促进IKBα的表达,而SENP1的过表达不仅能够阻碍这一效应,也能够使RPS9诱导的凋亡减少。结论 RPS9在多发性骨髓瘤CD138+细胞中高表达,且与患者总体生存率、髓外浸润相关。RPS9的抑制能够促进骨髓瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞并抑制增殖。RPS9能够通过SENP1影响NF-κB通路的活化,并影响细胞的凋亡,提示SENP1可能为RPS9生物学效应的关键因素。

核不均一核糖核蛋白K对塞内卡病毒IRES依赖性翻译及病毒复制影响的研究

基于前期塞内卡病毒(SVA)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的互作组学数据,本研究首先利用生物素标记RNA亲和捕捉技术和RNA免疫共沉淀试验,证实核不均一核糖核蛋白K(hnRNP K)与SVA基因组互作,且利用MTS试验证实敲降或过表达hnRNP K对细胞活性影响不显著。为深入探究hnRNP K在SVA复制过程中的功能,本研究利用Western-blot和TCID50试验检测hnRNP K蛋白对SVA病毒蛋白表达和病毒滴度的影响,结果显示,敲降hnRNP K显著降低病毒蛋白VP2的表达量及病毒滴度,而过表达hnRNP K则显著增加VP2表达量及病毒滴度。利用间接免疫荧光和核质分离试验观察病毒感染对hnRNP K亚细胞定位的影响,发现SVA感染可诱导hnRNP K由细胞核向细胞质移位。通过双荧光素酶报告基因试验检测hnRNP K对帽依赖性翻译和SVA IRES依赖性翻译活性的影响,结果表明,敲降和过表达hnRNP K蛋白均对帽依赖性翻译活性无显著影响,敲降hnRNP K显著降低SVA IRES依赖性翻译活性,而过表达hnRNP K则显著增强IRES翻译活性。综上所述,本研究证实hnRNP K是SVA的关键反式作用因子,正调控病毒IRES依赖性翻译及病毒复制,为深入了解小RNA病毒蛋白翻译和复制的分子机制提供了新的见解。

N^(6)甲基腺嘌呤(m6A)识别蛋白hnRNPA2B1在多种肿瘤高表达并调控肿瘤免疫微环境

目的探究N^(6)甲基腺嘌呤(m^(6)A)识别蛋白核不均一核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)在多种肿瘤中的表达水平及其与预后、免疫浸润的关系。方法探究hnRNPA2B1在不同肿瘤中的表达水平,并在胃癌组织芯片进行免疫组织化学验证;应用单因素COX回归和Kaplan-Meier生存分析探究hnRNPA2B1在泛癌中的预后价值;探究hnRNPA2B1表达与免疫细胞浸润、免疫检查点相关基因、肿瘤突变负荷(TMB)及微卫星不稳定性(MSI)的相关性。结果与正常组织相比,hnRNPA2B1在多种肿瘤组织中高表达,在胃癌组织芯片中,hnRNPA2B1在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。hnRNPA2B1与7种肿瘤的预后显著相关,且hnRNPA2B1高表达患者预后较差。hnRNPA2B1表达水平与多种肿瘤的免疫细胞浸润呈正相关。hnRNPA2B1表达水平与免疫检查点相关基因、TMB、MSI存在显著相关性。结论m^(6)A识别蛋白hnRNPA2B1在泛癌中普遍高表达,并且与较差的预后相关。hnRNPA2B1与多种肿瘤的免疫微环境相关。

核不均一核糖核蛋白A2／B1在非小细胞肺癌发病机制中作用的探讨

目的观察核不均一核糖核蛋白A2／B1（hnRNPA2／B1）住非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其与DNA修复酶O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）、8-羟基吗嘌呤DNA糖甘酶（OGGI）、氧化还原因子1（Ref-1）、DNA依赖性蛋白激酶复合物DNA—PKcs和Ku mRNA之间的相互作用，并进一步探讨其在NSCLC发病机制中的作用。方法采刚免疫绀化、Western blot及荧光实时定量PCR方法，检测NSCLC患者癌组织及正常肺组织hnRNPA2／B1的表达。采用免疫共沉淀结合逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法，研究人肺鳞癌细胞株中hnRNPA2／B1蛋向是否与上述5种DNA修复酶的mRNA直接结合，然后采用免疫组化及荧光实时定量PCR方法，榆测NSCLC患者痛绀织及正常肺组织MGMT的表达情况。结果免疫组化染色显示，hnRNPA2／B1定位于细胞核，hnRNPA2／B1在NSCLC癌组织中的表达阳性率（100％）和蛋白表达评分[（5．3±0．9）分]均显著高于正常肺组织[32％和（2．2±0．7）分，P〈0．01]，在Ⅲ～Ⅳ期NSCLC组织中的表达略高于J～Ⅱ期（P〈0．05），而与年龄、性别、组织学类型及吸烟状况无关（均P〉0．05）。通过tiT—PCR方法可以从人肺鳞癌细胞株免疫共沉淀产物中扩增出MGMT mRNA，提示hnRNP A2／B1与MGMT mRNA相结合。进一步的免疫组化染色结果显示，在NSCLC组织中，MGMT的表达阳性率为32．0％，明娃低于止常肺组织（78．0％），蛋白表达评分[（2．2±0．8）分]也显著低于正常肺组织[（4．1±1．2）分，P〈0．01]。荧光实时定量PCR结果显示，NSCLC组织中MGMTmRNA的表达量为1．8（0．6～3．1），明显低于正常肺组织[9．8（6．8～18．3），P〈0．01]。结论HnRNPA2／BI蛋白及mRNA在NSCI．C组织中的表达均升高，hnRNPA2／B1与MGMTmRNA相结合，可能通过对MGMTmRNA的转录后调控参与NSCLC的发牛。

应用ROC曲线评价P53抗体及核内小核糖体蛋白U1-A抗体对非小细胞肺癌的诊断价值

目的评价P53抗体和U1AsnRNP（核内小核糖体蛋白U1-A）抗体检测对非小细胞肺癌的诊断价值和临床意义。方法采用酶联免疫吸附法检测了46例非小细胞肺癌患者血清中的P53抗体及U1-AsnRNP抗体，并以43名健康人血清作对照。结果非小细胞肺癌组血清P53抗体浓度的中位数（四分位数间距）E25．38μg／L（65．69pg／L）]明显高于对照组血清P53抗体浓度的中位数（四分位数间距）[10．45fig／L（10．44μg／L）]，两组间比较差异有统计学意义（P=0．000）；非小细胞肺癌组血清U1-AsnRNP抗体浓度的中位数（四分位数间距）和对照组血清U1-AsnRNP抗体浓度的中位数（四分位数间距）分别为165．57U／L（104．51U／L）、170．05U／L（74．12U／L），两组间比较差异无统计学意义（P=0．715）；应用ROC曲线对P53抗体和U1-AsnRNP抗体对非小细胞肺癌的诊断价值进行了评价，ROC曲线下面积分别0．717、0．478，P53抗体诊断非小细胞肺癌的敏感性和特异性分别为62．2％、79．1％。结论P53抗体对tP4,细胞肺癌的诊断有较好的敏感性和特异性，血清P53抗体检测对非小细胞肺癌诊断有一定的临床意义；U1-AsnRNP抗体对非小细胞肺癌的诊断价值欠佳。

LncRNA CBR3-AS1调节miR-409-3p/hnRNPA2B1轴对肝细胞癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨长链RNA CBR3-AS1(LncRNA CBR3-AS1)靶向微小RNA-409-3p(miR-409-3p)/核不均一核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)轴对肝细胞癌(HCC)细胞恶性生物学行为的影响。方法qRT-PCR法分析肝癌组织中LncRNA CBR3-AS1和miR-409-3p表达水平。双荧光素酶检测LncRNA CBR3-AS1和miR-409-3p及hnRNPA2B1和miR-409-3p的靶向关系。将Hep G2细胞分为si-NC组、si-CBR3-AS1组、si-CBR3-AS1+anti-miR-NC组、si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p组、miR-NC组、miR-409-3p mimics组、miR-409-3p mimics+pcDNA组、miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1组。平板克隆检测细胞增殖;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡;划痕实验检测细胞迁移;Transwell实验检测细胞侵袭;Western blot分析法检测细胞核增殖抗原标记物(Ki67)、细胞周期负调控因子(P21)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9蛋白的表达变化。小鼠移植瘤实验检测LncRNA CBR3-AS1对肝癌肿瘤生长及miR-409-3p/hnRNPA2B1的影响。结果与癌旁组织比较,癌组织中LncRNA CBR3-AS1表达显著升高,miR-409-3p表达显著降低(P<0.05)。StarBase预测显示LncRNA CBR3-AS1与miR-409-3p有靶向结合位点。双荧光素酶实验显示,miR-409-3p mimics与LncRNA CBR3-AS1-WT共转染Hep G2细胞相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CBR3-AS1组LncRNA CBR3-AS1表达明显下降,miR-409-3p表达明显上升(P<0.05);与si-CBR3-AS1+anti-miR-NC组比较,si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p组miR-409-3p表达明显下降(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CBR3-AS1组Hep G2细胞集落形成数、划痕愈合率、侵袭数量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低,细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与si-CBR3-AS1+anti-miR-NC组比较,si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p组Hep G2细胞集落形成数、划痕愈合率、侵袭数量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达水平显著升高,细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。生物信息学分析显示miR-409-3p与hnRNPA2B1有靶向结合位点。双荧光素酶实验显示,miR-409-3p mimics与hnRNPA2B1-WT共转染Hep G2细胞相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-409-3p mimics组miR-409-3p表达明显上升,hnRNPA2B1表达明显下降(P<0.05);与miR-409-3p mimics+pcDNA组比较,miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1组hnRNPA2B1表达明显上升(P<0.05),与miR-NC组比较,miR-409-3p mimics组细胞集落形成、划痕愈合率、侵袭数量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低,细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与miR-409-3p mimics+pcDNA组比较,miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1组细胞集落形成、划痕愈合率、侵袭数量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达水平显著升高,细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与si-NC组比较,小鼠注射转染si-CBR3-AS1的细胞后,移植瘤体积生长缓慢。与si-NC组比较,si-CBR3-AS1组移植瘤中LncRNA CBR3-AS1表达水平下降,miR-409-3p表达水平升高(P<0.005)。免疫组化检测结果显示,si-CBR3-AS1组移植瘤中,hnRNPA2B1蛋白表达水平显著降低(P<0.005)。结论LncRNA CBR3-AS1在肝癌中表达升高,下调LncRNA CBR3-AS1的表达,可上调miR-409-3p表达,从而下调hnRNPA2B1表达,抑制肝癌细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞凋亡。

核不均一性核糖核蛋白A2/B1在脑缺血再灌注大鼠脑皮质分布的变化

目的研究大鼠脑缺血再灌注损伤后核不均一性核糖核蛋白(hnRNP)A2/B1在大鼠脑皮质表达位置变异与再灌注损伤时间的关系。方法随机选取30只雄性SD大鼠,分为假手术组、缺血2h再灌注3h、6h、12h、24h、48h6组,每组各5只。线栓法制作稳定的大鼠右侧大脑中动脉栓塞?再灌注实验模型,采用免疫组织化学和Nissl染色法测定再灌注损伤后3h、6h、12h、24h、48h缺血侧扣带回、纹状皮质、颞叶皮质、梨状皮质区域大脑皮质hnRNPA2/B1表达分布位置的改变,并与假手术组进行比较。同时观察缺血再灌注损伤大鼠脑皮质病理学改变。结果 1.假手术组中hnRNPA2/B1蛋白主要定位于神经元细胞核中,缺血再灌注各组与假手术组相比,缺血再灌注后3h、6h、12h、24h、48h,hnRNPA2/B1出现核突易位的变异,并呈现先上升后下降的趋势。脑缺血再灌注3h后,hnRNPA2/B1表达区神经元出现核突易位(P<0.01),12h后hnRNPA2/B1易位神经元数目持续增加(P<0.01),24h达高峰(P<0.01);再灌注48h后,hnRNPA2/B1表达区神经元核浆、核突易位降至0。2.与假手术组比较,缺血再灌注各组脑皮质损伤严重,尤其缺血再灌注24h组神经细胞变性坏死显著。结论 hnRNPA2/B1可能在基因转录后水平参与调控缺血再灌注脑损伤。

核内不均一性核糖核蛋白A2/B1在胰腺癌中的表达及其对B细胞淋巴瘤/白血病-X选择性剪切的调控机制

目的 探讨核内不均一性核糖核蛋白（hnRNP） A2/B1作为下游靶蛋白参与Fyn诱导的胰腺癌细胞B细胞淋巴瘤/白血病-X（bcl-X）选择性剪切调控的作用及其机制.方法 通过免疫组织化学方法观察28例胰腺癌标本hnRNP A2/B1的表达,并探讨其与胰腺癌临床病理参数之间的关系.通过RNA-免疫共沉淀技术,探讨受Fyn活性调控的hnRNP A2/B1的下游靶基因.通过改变hnRNP A2/B1的表达,观察对bcl-X选择性剪切的影响.结果 28例胰腺癌组织标本中有23例出现hnRNP A2/B1的表达,表达水平与胰腺癌TNM分期（R =0.854,P＜0.05）、是否发生远处转移（R =0.698,P＜0.05）相关等因素有关.RNA-免疫共沉淀证实,hnRNP A2/B1能够与BxPC3细胞中bcl-X基因的Pre-mRNA结合.hnRNP A2/B1表达水平的改变参与BxPC3胰腺癌细胞中bcl-X两种剪切体比例的调控.结论 hnRNP A2/B1的表达水平与胰腺癌组织侵袭转移能力密切相关;hnRNPA2/B1可以与胰腺癌细胞中bcl-X基因结合,从而影响bcl-X选择性剪切.

核不均一核糖核蛋白AB与互作蛋白KRAB相关蛋白1在原发性肝细胞肝癌中的表达谱及其临床意义

目的研究核不均一核糖核蛋白AB（hnRNPAB）在人肝癌细胞系中的互作蛋白谱，探讨hnRNPAB／KRAB相关蛋白1（Kap1）的共表达谱与肝癌患者临床病理特征之间的相关性及其在预测患者术后复发转移的临床价值。方法质谱分析与多肽比对确定与hnRNPAB蛋白结合的Kapl蛋白肽段，免疫共沉淀验证两者的蛋白相互作用；免疫组织化学染色方法检测，hnRNPAB和互作蛋白Kapl在组织芯片中的表达谱，分析其与临床病理特征及预后的关联性。计数资料比较采用χ2或Fisher精确概率法；计量资料比较用两组间比较的t检验或wilcoxon符号秩检验；生存率的判定使用Kapian—Meier方法，差异性使用Log—rank检验评估。结果免疫共沉淀联合质谱技术鉴定出Kap1是hnRNPAB蛋白在人肝癌细胞中的结合蛋白之一，两者之间存在蛋白相互作用。生存分析结果显示Kap1高表达组肝癌患者术后5年总体生存率为36%，显著低于Kapl低表达组患者的59％，差异有统计学意义（HR=1．67，P〈0．001）；其累计复发率为72％，显著高于Kap1低表达组患者的54%（IqR=1．66，P=0．001）。单因素统计分析结果显示单独的hnRNPAB、Kap1以及两者联合均是肝癌患者术后生存和复发的独立预后影响因素，差异均有统计学意义（HR分别为1．35和1．28，P值均〈0．05）；联合hnRNPAB和Kap1对术后生存和复发的预测价值高于单个指标，差异均有统计学意义（HR分别为1．24和1．27，P值均〈0．05）。结论在人肝癌细胞中hnRNPAB与Kap1形成蛋白复合体；HnRNPAB联合Kap1是非常好的独立预后指标，能准确预测肝癌患者术后的预后不良。

核不均一核糖核蛋白A1的表达与肝癌肝移植患者肿瘤发生与转移的关系

目的探讨肝癌组织中核不均一核糖核蛋白A1（HnRNPA1）的表达与肝癌行肝移植治疗后肿瘤复发与转移的关系。方法应用蛋白印迹法检测切除的肝癌组织、癌旁组织和肝正常组织中HnRNPA1的表达（n=16），用免疫组化方法分析其表达与移植后（n=141）肝癌复发及转移的关系和意义。结果肝癌组织的HnRNPA1蛋白阳性率为75．0％（12／16），癌旁组织为18．8％（3／16），两者差异有统计学意义（P〈0．01）。肝癌组织的HnRNPA1蛋白表达水平（0．680±0.149）明显高于癌旁组织（0．420±0．060）和正常肝组织（0．270±0．046，P〈0．01）。HnRNPA1表达与肝癌直径、TNM分期、血管侵犯、肿瘤包膜等相关（P〈0．01），与肝癌其他临床病理学参数无关（P〉0．05）。HnRNPA1高表达组患者肿瘤复发率明显高于HnRNPA1低表达组（χ^2=15．577，P〈0．01）；生存率明显低于HnRNPA1低表达组（χ^2=6．309，P〈0．05）。结论HnRNPA1蛋白水平在肝癌组织中表达上调，且与肝癌肝移植术后肿瘤复发转移有关，影响肝癌肝移植患者预后。

核不均一核糖核蛋白A1和白细胞分化抗原44在结直肠癌中表达及临床意义

目的探讨核不均一核糖核蛋白A1(hnRNPA1)和白细胞分化抗原44(CD44)在结直肠癌(CRC)组织中的表达及临床意义。方法利用基因表达谱数据动态分析(GEPIA)数据库检索hnRNPA1和CD44 mRNA在CRC组织中的表达, 收集2015年1月至2017年1月咸宁市中心医院联合遵义医科大学附属医院经病理确诊的155例CRC癌组织及50例癌旁组织, 采用免疫组织化学方法检测当中组织hnRNPA1和CD44蛋白表达, χ^(2)检验分析两者与患者临床病理特征、生存情况的关系。结果 GEPIA数据库分析结果表明hnRNPA1与CD44 mRNA在CRC癌组织中高表达。免疫组织化学结果显示hnRNPA1、CD44蛋白在CRC癌组织中的表达明显高于其癌旁组织(hnRNPA1:χ^(2)=31.230, P<0.01;CD44:χ^(2)=21.150, P<0.01)。hnRNPA1蛋白的表达与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及癌胚抗原(CEA)相关(χ^(2)=9.913、7.958、11.932、22.627、25.981、22.670, P<0.05);与患者性别及年龄无关(χ^(2)=0.284、0.164, P>0.05)。CD44蛋白的表达与分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及CEA相关(χ^(2)=4.645、4.626、6.095、6.371、13.821, P<0.05), 与性别、年龄、肿瘤大小无关(χ^(2)=0.251、0.103、2.524, P>0.05)。Spearman相关分析提示hnRNPA1与CD44在CRC中的表达呈正相关(r=0.272, P<0.01)。Kaplan-Meier生存分析发现hnRNPA1、CD44高表达组5年总生存率均低于其低表达组(hnRNPA1:χ^(2)=23.92, P<0.01;CD44:χ^(2)=15.15, P<0.01)。Cox分析hnRNPA1[风险比(HR)=2.714, 95%可信区间(CI)=1.305~5.646, P< 0.01]、CEA(HR=2.538, 95%CI=1.599~4.030, P<0.01)及TNM分期(HR=3.978, 95%CI=1.253~12.629, P<0.05)作为影响结直肠癌手术后总生存率的独立预后因子。结论 hnRNPA1可能协同CD44参与CRC发生发展过程, 并作为CRC潜在预后标志物。

NDV感染促进hnRNPA1进入细胞质帮助病毒增殖

新城疫病毒(NDV)属于单股负链病毒目(Mononegavirales)副粘病毒科(Paramyxoviridae)禽副粘病毒属(Avulavirus)。核不均一核糖体蛋白A1(hnRNPA1)在细胞核结合并影响前体mRNA的剪切和成熟mRNA的转运。为研究hnRNPA1是否调控NDV感染,本研究通过间接免疫荧光实验检测了hnRNAP1在病毒感染过程中的亚细胞定位。结果显示,NDV感染促进hnRNPA1蛋白出核,并与病毒核衣壳蛋白NP共定位;免疫共沉淀实验证实,hnRNPA1分别与病毒核衣壳蛋白NP和病毒膜蛋白M相互作用;以siRNA干扰hnRNPA1的表达,NDV增殖受到抑制,过表达hnRNPA1则促进NDV增殖。上述结果表明,NDV感染促进部分hnRNPA1进入细胞质,与病毒NP蛋白相互作用并促进病毒增殖。该研究结果为hnRNPA1参与副粘病毒复制的研究奠定了理论基础。

hnRNP A1的增强型绿色荧光标记及细胞应激定位分析

目的构建包含有核不均一核糖核蛋白(hnRNP)A1蛋白编码区序列的真核表达质粒pEGFP-C1-hnRNP A1,并对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的hnRNP A1蛋白进行细胞应激共定位分析。方法提取HeLa细胞总RNA,以针对hnRNPA1-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物,反转录出包含hnRNP A1编码区序列的cDNA,并以其为模板,降落PCR法扩增出带EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的目的基因,利用双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pEGFP-C1,在T4-DNA连接酶的催化下将两者连接构建成pEGFP-C1-hnRNP A1重组质粒,然后将重组质粒转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦荧光显微镜观察EGFP-hnRNP A1的荧光表达情况,Western印迹法检测EGFP与hnRNP A1的融合表达情况,最后进行细胞原位杂交及细胞免疫荧光检测在氧化应激状态下EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA(应激颗粒的标记成分)及DPC1a(加工体的标记蛋白)的应激共定位。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,激光共聚焦荧光显微镜观察和Western印迹结果检测到绿色荧光融合蛋白的表达;EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA呈现共定位,但与DPC1a无共定位关系。结论重组pEGFP-C1-hnRNPA1质粒成功构建并表达,应激状态下EGFP标记的hnRNPA1参与应激颗粒的构成。

细胞hnRNP M蛋白与病毒基因组相互作用对塞内卡病毒复制影响的研究

为研究核不均一核糖核蛋白M(hnRNP M)在塞内卡病毒(SVA)复制过程中的作用,本研究构建了重组质粒pCAGGS-HA-hnRNP M,将该重组质粒转染至BHK-21细胞后经western blot检测,结果显示其可在细胞中正确表达hnRNP M蛋白。通过在BHK-21细胞中转染pCAGGS-HA-hnRNP M过表达或转染shRNA-hnRNP M敲低hnRNP M表达后感染SVA,利用western blot检测SVA结构蛋白VP2和病毒TCID50,分析hnRNP M对SVA复制的影响,结果显示,与对照组比较,过表达hnRNP M蛋白可极显著抑制SVA在BHK-21细胞中的复制(P<0.01),而敲低hnRNP M蛋白能极显著促进SVA在BHK-21细胞中的复制(P<0.01)。进一步利用RNA免疫共沉试验在SVA感染的BHK-21细胞中获得免疫沉淀复合物,提取其RNA后利用SVA基因组特异性引物进行PCR检测,结果显示宿主细胞hnRNP M蛋白和SVA基因组RNA存在相互作用。通过激光共聚焦试验检测SVA基因组和hnRNP M的定位情况,结果显示SVA感染宿主细胞后hnRNP M从细胞核转移至细胞质中,并与SVA基因组RNA在细胞质中共定位。通过双荧光素酶报告基因试验分别在过表达hnRNP M和敲低hnRNP M的细胞中检测SVA内部核糖体进入位点(IRES)的活性,结果显示过表达hnRNP M蛋白能够抑制SVA IRES介导的翻译活性,而下调hnRNP M蛋白的表达则能够促进IRES的活性。上述研究结果首次证实了宿主细胞蛋白hnRNP M与SVA基因组存在相互作用,其可通过抑制IRES的翻译活性进一步抑制SVA复制。本研究为深入研究SVA复制的分子调控机制奠定了基础。