应用ROC曲线评价P53抗体及核内小核糖体蛋白U1-A抗体对非小细胞肺癌的诊断价值

目的评价P53抗体和U1AsnRNP（核内小核糖体蛋白U1-A）抗体检测对非小细胞肺癌的诊断价值和临床意义。方法采用酶联免疫吸附法检测了46例非小细胞肺癌患者血清中的P53抗体及U1-AsnRNP抗体，并以43名健康人血清作对照。结果非小细胞肺癌组血清P53抗体浓度的中位数（四分位数间距）E25．38μg／L（65．69pg／L）]明显高于对照组血清P53抗体浓度的中位数（四分位数间距）[10．45fig／L（10．44μg／L）]，两组间比较差异有统计学意义（P=0．000）；非小细胞肺癌组血清U1-AsnRNP抗体浓度的中位数（四分位数间距）和对照组血清U1-AsnRNP抗体浓度的中位数（四分位数间距）分别为165．57U／L（104．51U／L）、170．05U／L（74．12U／L），两组间比较差异无统计学意义（P=0．715）；应用ROC曲线对P53抗体和U1-AsnRNP抗体对非小细胞肺癌的诊断价值进行了评价，ROC曲线下面积分别0．717、0．478，P53抗体诊断非小细胞肺癌的敏感性和特异性分别为62．2％、79．1％。结论P53抗体对tP4,细胞肺癌的诊断有较好的敏感性和特异性，血清P53抗体检测对非小细胞肺癌诊断有一定的临床意义；U1-AsnRNP抗体对非小细胞肺癌的诊断价值欠佳。

核糖体蛋白S9在多发性骨髓瘤中的表达及对其细胞生物学功能的影响

目的明确核糖体蛋白S9(RPS9)在多发性骨髓瘤中的表达情况,并明确其对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及相应机制。方法 选取10例健康志愿者骨髓单个核细胞(CON组)与30例多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞(CD138+组),实时荧光定量PCR检测RPS9在mRNA水平的表达,并选取3例CON与11例CD138+细胞,Westernblot检测RPS9在蛋白水平的变化,同时选取GSE19784数据集,检测RPS9的表达与患者总体生存率、核因子-κB(NF-κB)、类泛素蛋白修饰分子(SUMO)、泛素通路之间的关系。随后构建RPS9-短发夹RNA(shRNA)敲低载体,使用流式细胞仪检测感染效率、实时荧光定量PCR与Westernblot检测敲低效率后。RPMI8226分为CON与RPS9-shRNA组,使用膜联蛋白V别藻青蛋白/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡的变化、CCK8法检测细胞增殖的变化、PI染色法检测细胞周期的变化。并构建类泛素蛋白修饰分子特异蛋白酶1(SENP1)过表达载体,Westernblot确定过表达效率后,检测RPS9抑制后SENP1表达的变化,并在RPS9-shRNA中转染SENP1过表达载体,Westernblot检测CON、RPS9-shRNA、RPS9-shRNA-SENP1细胞中NF-κB通路P65、抑制因子κBα(IκBα)磷酸化水平的变化,膜联蛋白V/PI双染法检测细胞凋亡的变化。结果 RPS9在10例健康志愿者骨髓单个核细胞(CON)以及30例多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞中相对表达量分别为1.00±0.12和5.45±0.71(t=4.291,P=0.0036),Westernblot中大多数骨髓瘤CD138+细胞中RPS9呈现高表达,RPS9的高表达同时与患者髓外浸润相关,并在GSE19784数据集中与患者总体生存率相关。RPMI8226在感染CON与RPS9-shRNA慢病毒48h后,流式细胞仪证实两组细胞感染效率均在90%以上,实时荧光定量PCR与Westernblot证实RPS9在mRNA与蛋白水平的表达均受到抑制。RPMI8226CON与RPS9-shRNA感染病毒48h后,CON与RPS9-shRNA组细胞膜联蛋白V阳性细胞比例分别为3.47±0.37和18.60±1.64,RPS9-shRNA组显著高于CON组(t=9.015,P=0.0008)。在增殖中,CON组与RPS9-shRNA组在72h时增殖指数差异有统计学意义(t=6.846,P=0.0024)。而在细胞周期中,CON与RPS9-shRNA组在感染病毒48h时,G2期细胞比例分别为(29.28±3.42)%和(10.43±1.43)%,CON组显著高于RPS9-shRNA组,差异有统计学意义(t=9.329,P=0.0007)。RPS9的表达在GSE19784数据集中与SENP1正相关,并与IκBα编码基因NFKBIA呈负相关,Westernblot进一步证实RPS9的敲低能够抑制SENP1的表达,并抑制NF-κB亚基P65、抑制因子IKBα的磷酸化,促进IKBα的表达,而SENP1的过表达不仅能够阻碍这一效应,也能够使RPS9诱导的凋亡减少。结论 RPS9在多发性骨髓瘤CD138+细胞中高表达,且与患者总体生存率、髓外浸润相关。RPS9的抑制能够促进骨髓瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞并抑制增殖。RPS9能够通过SENP1影响NF-κB通路的活化,并影响细胞的凋亡,提示SENP1可能为RPS9生物学效应的关键因素。

LncRNA CBR3-AS1调节miR-409-3p/hnRNPA2B1轴对肝细胞癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨长链RNA CBR3-AS1(LncRNA CBR3-AS1)靶向微小RNA-409-3p(miR-409-3p)/核不均一核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)轴对肝细胞癌(HCC)细胞恶性生物学行为的影响。方法qRT-PCR法分析肝癌组织中LncRNA CBR3-AS1和miR-409-3p表达水平。双荧光素酶检测LncRNA CBR3-AS1和miR-409-3p及hnRNPA2B1和miR-409-3p的靶向关系。将Hep G2细胞分为si-NC组、si-CBR3-AS1组、si-CBR3-AS1+anti-miR-NC组、si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p组、miR-NC组、miR-409-3p mimics组、miR-409-3p mimics+pcDNA组、miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1组。平板克隆检测细胞增殖;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡;划痕实验检测细胞迁移;Transwell实验检测细胞侵袭;Western blot分析法检测细胞核增殖抗原标记物(Ki67)、细胞周期负调控因子(P21)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9蛋白的表达变化。小鼠移植瘤实验检测LncRNA CBR3-AS1对肝癌肿瘤生长及miR-409-3p/hnRNPA2B1的影响。结果与癌旁组织比较,癌组织中LncRNA CBR3-AS1表达显著升高,miR-409-3p表达显著降低(P<0.05)。StarBase预测显示LncRNA CBR3-AS1与miR-409-3p有靶向结合位点。双荧光素酶实验显示,miR-409-3p mimics与LncRNA CBR3-AS1-WT共转染Hep G2细胞相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CBR3-AS1组LncRNA CBR3-AS1表达明显下降,miR-409-3p表达明显上升(P<0.05);与si-CBR3-AS1+anti-miR-NC组比较,si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p组miR-409-3p表达明显下降(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CBR3-AS1组Hep G2细胞集落形成数、划痕愈合率、侵袭数量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低,细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与si-CBR3-AS1+anti-miR-NC组比较,si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p组Hep G2细胞集落形成数、划痕愈合率、侵袭数量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达水平显著升高,细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。生物信息学分析显示miR-409-3p与hnRNPA2B1有靶向结合位点。双荧光素酶实验显示,miR-409-3p mimics与hnRNPA2B1-WT共转染Hep G2细胞相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-409-3p mimics组miR-409-3p表达明显上升,hnRNPA2B1表达明显下降(P<0.05);与miR-409-3p mimics+pcDNA组比较,miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1组hnRNPA2B1表达明显上升(P<0.05),与miR-NC组比较,miR-409-3p mimics组细胞集落形成、划痕愈合率、侵袭数量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低,细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与miR-409-3p mimics+pcDNA组比较,miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1组细胞集落形成、划痕愈合率、侵袭数量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达水平显著升高,细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与si-NC组比较,小鼠注射转染si-CBR3-AS1的细胞后,移植瘤体积生长缓慢。与si-NC组比较,si-CBR3-AS1组移植瘤中LncRNA CBR3-AS1表达水平下降,miR-409-3p表达水平升高(P<0.005)。免疫组化检测结果显示,si-CBR3-AS1组移植瘤中,hnRNPA2B1蛋白表达水平显著降低(P<0.005)。结论LncRNA CBR3-AS1在肝癌中表达升高,下调LncRNA CBR3-AS1的表达,可上调miR-409-3p表达,从而下调hnRNPA2B1表达,抑制肝癌细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞凋亡。

hnRNPU过表达抑制PIM1诱导的细胞衰老的机制研究

目的:探讨人前病毒整合位点1(PIM1)诱导细胞衰老的分子机制。方法:构建过表达PIM1的2BS细胞系,通过Western印迹法和衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验测定过表达PIM1是否诱导细胞衰老。免疫沉淀联合质谱分析测定PIM1是否能有效免疫沉淀核异质核糖核蛋白U(hnRNPU)蛋白。运用Real-time PCR和Western印迹法测定PIM1是否影响hnRNPU mRNA和蛋白表达水平。构建同时过表达PIM1和hnRNPU的2BS细胞系,运用Western印迹法和衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验检测hnNRPU过表达对PIM1诱导的细胞衰老的影响。结果:与空载对照组相比,过表达PIM1组中衰老信号通路关键基因p53、p21和p16的表达显著增加(p53,t=4.36,P<0.05;p21,t=3.814,P<0.05;p16,t=4.72,P<0.01),衰老细胞的比例增加(t=6.831,P<0.01)。免疫沉淀联合质谱分析结果显示PIM1能有效免疫沉淀hnRNPU蛋白。PIM1过表达对hnRNPU的mRNA表达水平没有影响(t=0.295,P=0.783),但是能抑制hnRNPU蛋白的表达(t=33.85,P<0.001)。与只过表达PIM1细胞相比,同时过表达PIM1和hnRNPU细胞,衰老信号通路关键基因p53、p21和p16的表达下降(p53,t=15.317,P<0.001;p21,t=8.012,P<0.01;p16,t=14.08,P<0.001),衰老细胞的比例降低(t=10.38,P<0.01)。结论:hnRNPU过表达抑制PIM1诱导的细胞衰老。

MAGE-A1和MAGE-A3在脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义

目的:探讨黑色素瘤抗原基因-A1(MAGE-A1)和MAGE-A3在脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法:选取2006年1月至2010年1月河北医科大学第四医院神经外科手术切除的78例脑胶质瘤组织标本和15例车祸死亡捐献者的正常脑组织标本。用RT-PCR法检测胶质瘤组织中MAGE-A1和MAGE-A3的表达,分析其表达水平与患者预后的关系;用MSP-PCR术检测MAGE-A1和MAGE-A3基因启动子区的甲基化状态,分析两者表达与甲基化之间的关系;用RT-PCR法检测胶质瘤U251和U87细胞中MAGE-A1和MAGE-A3表达以及经DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)联合作用后两者的表达水平。结果:78例胶质瘤组织中MAGE-A1和MAGE-A3 mRNA阳性表达率分别为65.34%和38.46%,而在15例正常脑组织中未发现2种m RNA表达。MAGE-A1阳性组患者5年生存率较阴性组低(P<0.05)。MAGE-A1和MAGE-A3基因启动子区去甲基化水平与其在mRNA水平上的表达均有显著的相关性(均P<0.01)。未经5-Aza-CdR和TSA处理的U87细胞未见MAGE-A1和MAGE-A3 mRNA的表达,U251细胞则有少量表达。单独给予TSA不能引起MAGE-A1和MAGE-A3基因的表达激活,单独给予5-Aza-CdR或与TSA合用可以引起该2个基因的表达激活,且两者合用的作用优于单独给药。结论:脑胶质瘤组织中有不同程度的MAGE-A1和MAGE-A3基因表达,MAGE-A1基因表达与患者的预后不良相关。DNA启动子区甲基化和组蛋白乙酰化是MAGE-A1和MAGE-A3基因表达激活的重要机制。

抗核小体抗体与系统性红斑狼疮的致病相关性

目的分析抗核小体抗体(anti-nucleosome antibody,AnuA)与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的临床表现和其他自身抗体的关系,并了解其与SLE活动性的关系,探讨AnuA在SLE发病中的意义。方法回顾性分析2014年3月至2016年1月天津医科大学总医院165例SLE住院病人病历资料,其中AnuA阳性者96例,分析其主要的实验室指标与临床特征,并与69例同期住院的AnuA阴性病人比较。结果 AnuA阳性病人抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗Sm抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗U1核糖核蛋白抗体阳性率高,更易出现C3及C4下降,发热、皮疹、口腔溃疡、关节炎、肾损害、浆膜炎、光敏感、血小板减少阳性率较高,均差异有统计学意义(χ2值分别为4. 187、5. 667、4. 708、6. 660、5. 686、12. 062、6. 793、7. 323、4. 850、12. 617、5. 251、6. 178、4. 850、4. 521、7. 446、4. 377,均P <0. 05),两组SLEDAI积分比较差异有统计学意义(t=2. 19,P <0. 05),两组病人在抗核糖体P蛋白、抗心磷脂抗体、雷诺现象、心包炎、胸膜炎、脱发、神经系统损害、白细胞减少、淋巴细胞减少均差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论 AnuA与抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗Sm抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗U1核糖核蛋白抗体高阳性率、C3下降、C4下降、发热、皮疹、口腔溃疡、关节炎、肾损害、浆膜炎、光敏感、血小板减少相关,AnuA与SLE活动性相关,AnuA在SLE的发病中有重要意义。

微米复方黄连制剂对高脂饮食喂养家兔核因子-κB及炎症因子表达的影响

目的:研究微米复方黄连制剂对高脂饮食喂养家兔炎症因子表达的影响及其可能的机制。方法:ELISA法检测血清C反应蛋白(CRP)、白介素-1(IL-1)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α);RT-PCR法检测胸主动脉核因子-κB(NF-κB)mRNA的表达,电泳流动漂移法(EMSA)测定NF-κB的活性。结果:高脂饮食喂养16周后可明显增加血清CRP,IL-1及TNF-α的水平,并明显增加胸主动脉NF-κB mRNA的表达,同时升高NF-κB与DNA的结合活性;微米复方黄连制剂可明显逆转高脂饮食对上述指标的影响。结论:微米复方黄连制剂可明显抑制高脂饮食喂养家兔的炎症因子的表达,其机制可能是抑制NF-κB的表达及其活性所致。

长链非编码RNA特异性核基质结合区结合蛋白1-AS1在前列腺癌中的表达及其临床意义

目的:观察长链非编码RNA(lncRNA)特异性核基质结合区结合蛋白1(SATB1)-AS1在前列腺癌中的表达,并分析lncRNA SATB1-AS1与SATB1的相关性。方法:采用荧光原位杂交(FISH)方法检测前列腺癌及其癌旁组织中SATB1-AS1表达。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测4株前列腺癌细胞株(PC3、DU145、22RV1、LNCAP)和人正常前列腺上皮细胞株(RWPE1)中SATB1-AS1表达。应用TCGA数据库及整合基因组浏览器(IGV)软件比对SATB1与SATB1-AS1的相关性。结果:荧光杂交结果显示,SATB1-AS1在定位在细胞核、细胞质。RT-qPCR结果显示在前列腺癌细胞22RV1、LNCAP中SATB1-AS1表达水平明显高于DU145、PC3(4.20±1.25、42.58±8.30和0.50±0.02、1.58±0.33,F=22.512,P<0.05)。TCGA数据库分析SATB1-AS1与SATB1呈正相关(r=0.670,P<0.001);IGV软件比对美国国立生物技术信息中心(NCBI)内发现SATB1启动子序列与SATB1-AS1部分序列完全重合。结论:SATB1-AS1在前列腺中表达,且可能通过与SATB1基因启动子结合进而调控SATB1基因表达。

NDV感染促进hnRNPA1进入细胞质帮助病毒增殖

新城疫病毒(NDV)属于单股负链病毒目(Mononegavirales)副粘病毒科(Paramyxoviridae)禽副粘病毒属(Avulavirus)。核不均一核糖体蛋白A1(hnRNPA1)在细胞核结合并影响前体mRNA的剪切和成熟mRNA的转运。为研究hnRNPA1是否调控NDV感染,本研究通过间接免疫荧光实验检测了hnRNAP1在病毒感染过程中的亚细胞定位。结果显示,NDV感染促进hnRNPA1蛋白出核,并与病毒核衣壳蛋白NP共定位;免疫共沉淀实验证实,hnRNPA1分别与病毒核衣壳蛋白NP和病毒膜蛋白M相互作用;以siRNA干扰hnRNPA1的表达,NDV增殖受到抑制,过表达hnRNPA1则促进NDV增殖。上述结果表明,NDV感染促进部分hnRNPA1进入细胞质,与病毒NP蛋白相互作用并促进病毒增殖。该研究结果为hnRNPA1参与副粘病毒复制的研究奠定了理论基础。

沉默长链非编码RNA特异性核基质结合区结合蛋白1-AS1对前列腺癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响

目的观察沉默长链非编码RNA(lncRNA)特异性核基质结合区结合蛋白1(SATB1)-AS1对前列腺癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响,探究其机制。方法采用小干扰RNA(siRNA)沉默前列腺癌细胞株(22RV1、LNCAP)内SATB1-AS1表达。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测细胞的体外增殖能力;平板克隆实验检测单细胞克隆形成能力;TransWell实验检测细胞体外迁移侵袭能力;通过蛋白质印迹法(Western blot),检测细胞经不同处理后上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白表达情况。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)检验。结果成功沉默22RV1与LNCAP细胞内SATB1-AS1的表达。CCK-8结果显示,敲低组细胞增殖能力低于相应对照组(0.875±0.021、1.288±0.009和1.237±0.036、1.496±0.041,F=18.657,P<0.05)。平板克隆结果显示,敲低组细胞的单个细胞克隆形成能力低于相应对照组细胞(45.00±5.21、50.00±3.67和87.00±5.78、108.00±10.61,F=41.933,P<0.05)。Transwell实验结果显示,相应对照组细胞的迁移、侵袭能力高于敲低组细胞(249.00±33.20、156.00±22.31和138.00±28.15、98.00±10.52,F=75.720,P<0.05)。结论沉默SATB1-AS1抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭迁移及克隆能力。

U_1和U_2特异性snRNP蛋白的核交换

snRNP颗粒属于核糖核蛋白颗粒家族,包括一个snRNA和6～10种蛋白质,在核中,snRNP颗粒的功能是对RNA的加工。在加工过程中snRNP与底物结合成复合物。snRNP颗粒有7种共同的蛋白质,另外还有几种特异的snRNP蛋白。在啮齿类细胞中,snRNP共同的核心蛋白是B、D、D′、E、F和G,化学计量关系为B_2D_2′D_2EFG。

肺癌病人血清中U1-AsnRNP自身抗体的发现与鉴定

许多研究表明,肺癌病人存在自身免疫现象.为了寻找肺癌病人血清中具有潜在诊断价值的自身抗体,采用免疫荧光染色,免疫印迹和蛋白质芯片技术对10例肺癌病人和10例正常人血清进行了检测.筛选中发现1例来自64岁男性肺鳞癌(Ⅲb期)病人的血清呈现特异性的细胞核染色,并在31kD处有一个明显的细胞核蛋白免疫印迹条带.进而采用该病人的血清进行免疫沉淀,对所捕获的蛋白组分进行质谱分析和数据库查询后确认31kD条带为核内小核糖体蛋白U1-A(smallnuclearribonucleoproteinU1-A,U1-AsnRNP).进一步对36例鳞癌、26例腺癌、31例小细胞肺癌和20例健康对照血清样本进行了免疫荧光染色和免疫印迹验证,结果显示50%的鳞癌、26.9%的腺癌、54.8%的小细胞肺癌病人血清中有抗U1-AsnRNP抗体.上述结果报道了在肺癌病人血清中出现Anti-U1-AsnRNP自身抗体.

急性髓系白血病基因危险度分层的临床研究

目的检测急性髓系白血病(AML)患者Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、核磷蛋白1(NPM1)、Ⅲ型酪氨酸激酶(C-KIT)及髓系转录因子CCAAT增强子结合蛋白-a(CEBPA)基因表达情况,探讨基因突变者临床特征。方法选取2015年4月～2017年4月我院的80例AML患者,检测骨髓染色体核型及基因突变情况,比较各基因突变患者的临床特征及预后相关指标。结果 80例AML患者中,染色体核型正常占比43.75%,异常占比56.25%;FLT3-ITD、NPM1、C-KIT-D861V、CEBPA基因突变阳性检出率分别为15.00%、17.50%、7.50%、8.75%,对应正常核型中检出率分别为25.71%、28.57%、0.00%、20.00%;FLT3-ITD基因突变阳性组骨髓原始细胞比例显著高于FLT3-ITD基因突变阴性组(P<0.05),而血红蛋白(Hb)浓度、免疫表型CD117及人类白细胞抗原DR(HLA-DR)表达阳性差异无统计学意义(P>0.05);NPM1基因突变、C-KIT-D861V基因突变阳性组与阴性组的骨髓原始细胞比例、Hb浓度、免疫表型CD117及HLA-DR表达阳性率差异均无统计学意义(P>0.05);CEBPA基因双突变的Hb浓度显著高于阴性组(P<0.05),而骨髓原始细胞比例、免疫表型CD117及HLA-DR表达阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05);FLT3-ITD突变阳性组的完全缓解(CR)率、1年无病生存(DFS)率及1年内总生存(OS)率均显著低于阴性组(P<0.05),NPM1突变、C-KIT-D861V突变、CEBPA双突变阳性组与阴性组在CR率、DFS率比较差异无统计学意义(P>0.05),但NPM1突变、CEBPA双突变阳性组的OS率显著高于阴性组(P<0.05),C-KIT-D861V突变阳性组的OS率显著低于阴性组(P<0.05)。结论 AML患者FLT3、NPM1、C-KIT、CEBPA不同基因突变者显示出一定程度不同临床特征,FLT3、C-KIT基因突变者预后不良,NPM1、CEBPA基因突变者预后良好。