过表达核凋亡诱导因子1增强鼻咽癌细胞放射敏感性

目的探究核凋亡诱导因子1(nuclear apoptosis-inducing factor 1,NAIF1)对鼻咽癌细胞CNE-2R放射敏感性的影响。方法采用Western blot检测NAIF1在鼻咽癌细胞CNE-2和CNE-2R的表达水平。通过慢病毒感染技术将NAIF1过表达慢病毒(LV-NAIF1组)及其阴性对照慢病毒(LV-NC组)分别感染CNE-2R细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测NAIF1的mRNA和蛋白表达水平;采用CCK-8、克隆形成实验分别检测各组细胞在不同照射剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射下的增殖能力、克隆形成能力并计算相应的存活分数,采用流式细胞术实验检测各组细胞6 Gy照射前后的细胞周期分布情况。结果与CNE-2细胞相比,NAIF1在CNE-2R细胞中的蛋白表达水平显著降低(P<0.001)。与LV-NC组相比,LV-NAIF1组CNE-2R细胞中NAIF1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(均P<0.001)。经不同剂量照射后,与LV-NC组相比,过表达NAIF1可以抑制CNE-2R细胞的增殖能力(均P<0.05),降低CNE-2R细胞的克隆形成数和存活分数(P<0.05)。经6 Gy照射后,与LV-NC组相比,过表达NAIF1可使更多的CNE-2R细胞滞留在G2/M期(P<0.01)。结论NAIF1在鼻咽癌细胞CNE-2R中低表达,过表达NAIF1可能通过抑制细胞增殖并将细胞周期阻滞在G2/M期,从而增强鼻咽癌细胞CNE-2R的放射敏感性。

人重组核凋亡诱导因子1截短体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的核凋亡诱导因子1(Nuclearapoptosis-inducingfactor1,NAIF1)是本实验室首次克隆和鉴定的新凋亡基因,为了通过Polldown实验研究其结合蛋白,在大肠杆菌中表达和纯化人重组NAIF1(73-327)的截短体。方法通过PCR方法扩增出NAIF1(73-327)cDNA,并插入pGEX-KG载体,实现插入基因的融合表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Westernblot和电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS/MS)检测分析。结果DNA测序结果证实成功构建了重组融合表达质粒pGEX-KG-NAIF1(73-327),并在大肠杆菌中稳定表达,表达产物分子量约为53kD,与预期一致,表达量约占菌体总蛋白的22%,纯化蛋白经Westernblot和二级质谱(MS/MS)分析证明表达蛋白为GST-NAIF1(73-327)融合蛋白。结论获得了重组GST-NAIF1(73-327)融合蛋白的高效表达,为下阶段NAIF1的结构与功能研究打下了基础。

miR-146b-5p靶向调控NAIF1抑制胃癌细胞凋亡

目的分析miR-146b-5p对胃癌细胞MGC803增殖与凋亡的调控作用及分子机制。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同胃癌细胞系(MGC803、BGC823、MKN28、MKN45和SGC7901)中miR-146b-5p水平;应用miR-146b-5p抑制剂(inhibitor)和阴性对照(miRNA-NC)分别转染胃癌细胞MGC803,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡比例;TargetScan数据库分析miR-146b-5p的潜在靶基因,蛋白免疫印迹技术(western blot)检测核诱导凋亡因子1(NAIF1)蛋白表达水平;双荧光素酶实验验证miR-146b-5p和NAIF1之间的关系。结果不同胃癌细胞系(MGC803、BGC823、SGC7901、MKN45和MKN28)miR-146b-5p水平均高于正常人胃黏膜细胞(GES-1)(t分别=26.21、13.08、11.09、11.09、6.41,P均<0.05)。miR-146b-5p inhibitor转染胃癌细胞MGC803后miR-146b-5p水平明显降低(t=9.14,P<0.05)。抑制MGC803胃癌细胞miR-146b-5p水平后,细胞活力明显降低,细胞凋亡比例升高(t分别=3.73、9.55,P均<0.05)。miR-146b-5p mimics转染组WT-NAIF1荧光素酶活性明显低于miRNA-NC组(t=8.35,P<0.05)。Western blot结果表明,上调miR-146b-5p水平后,NAIF1蛋白表达明显降低(t=5.67,P<0.05),而下调miR-146b-5p水平后,NAIF1蛋白表达明显升高(t=4.32,P<0.05),在过表达NAIF1的基础上转染miR-146b-5p,细胞活力明显升高,细胞凋亡比例降低(t分别=6.54、4.73,P均<0.05)。结论miR-146b-5p通过靶向抑制NAIF1抑制胃癌细胞凋亡。