核受体亚家族2E组成员1与代谢相关脂肪性肝病患者慢性炎症状态相关性的研究

目的 探讨核受体亚家族2E组成员1(NR2E1)与代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)患者慢性炎症状态的相关性。方法 选取2021年10月至2022年10月于中南大学湘雅医学院附属海口医院内分泌科治疗的MAFLD患者32例(MAFLD组),另选取37名同期体检健康者为正常对照(NC)组。检测两组血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)、FPG、FIns、HbA1c、TNF-α、IL-6及IL-1β,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果 MAFLD组BMI、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT、HbA1c、FIns、FPG、HOMA-IR高于NC组(P<0.05或P<0.01),MAFLD组NR2E1mRNA及蛋白表达高于NC组(P<0.05或P<0.01),MAFLD组TNF-α、IL-6、IL-1β高于NC组(P<0.01)。Pearson相关分析显示,NR2E1与ALT、FIns、HOMA-IR、TNF-α、IL-6、IL-1β呈正相关(P<0.05)。多元线性回归分析显示,IL-1β是NR2E1的影响因素。结论 MAFLD患者NR2E1升高与IR及慢性炎症状态相关。

核受体NR6A1通过上调RIPK3基因表达诱导血管平滑肌细胞凋亡

目的:探讨核受体亚家族6A1(NR6A1)对血管平滑肌细胞凋亡的影响及可能的分子机制。方法:将腺病毒Ad-NR6A1感染大鼠血管平滑肌细胞,分别在感染后0 h、24 h和48 h时进行MTT实验,以时间为横坐标,A570为纵坐标绘制细胞生长曲线,观察NR6A1对细胞生长的影响;进行DAPI染色、TUNEL染色及caspase活性检测,观察细胞凋亡情况;进一步通过基因芯片技术,寻找NR6A1的靶基因;采用siRNA介导的基因沉默技术,观察受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)基因沉默对NR6A1诱导的血管平滑肌细胞凋亡的影响。结果:腺病毒Ad-NR6A1感染细胞48 h时,NR6A1过表达组细胞数量较对照组(重组腺病毒载体Ad-Lac Z)明显减少;DAPI染色显示NR6A1过表达诱导血管平滑肌细胞出现核浓缩和核碎裂的凋亡表型,TUNEL染色显示NR6A1过表达引起细胞凋亡,caspase活性检测结果显示NR6A1过表达细胞内caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均较对照组高;基因芯片技术检测发现,NR6A1过表达上调血管平滑肌细胞中RIPK3基因表达;RIPK3基因沉默可以显著抑制NR6A1诱导的平滑肌细胞凋亡。结论:NR6A1通过上调RIPK3基因表达诱导血管平滑肌细胞凋亡。

结直肠癌组织中NR2F1的表达及其与预后的相关性

目的检测结直肠癌中核受体亚家族2组F成员1(NR2F1)的蛋白表达水平,并探讨其与患者预后的关系。方法选择2012年8月至2013年9月在苏州市立医院进行根治性切除术的56例结直肠癌患者作为研究对象,采集患者的结直肠癌组织标本及对应的癌旁组织标本。采用EnVision法测定结直肠癌组织和癌旁组织的NR2F1的蛋白表达水平,比较不同NR2F1蛋白表达水平结直肠癌患者的临床病理特征。采用Kaplan-Meier法绘制结直肠癌患者的生存曲线,分析NR2F1蛋白表达水平与结直肠癌的预后的相关性。结果结直肠癌组织的NR2F1高表达率为48.21%,明显高于癌旁组织的7.14%,差异有统计学意义(P<0.05);NR2F1高表达者的无脉管侵犯率为85.19%,明显高于NR2F1低表达者的58.62%,差异有统计学意义(P<0.05);NR2F1高表达患者突破浆膜层的占比为48.15%,明显低于NR2F1低表达者的65.52%,且随着浸润深度从固有肌层到突破浆膜层,NR2F1低表达增加,差异均具有统计学意义(P<0.05);NR2F1高表达和低表达患者在性别、年龄、肿块大小、分化程度、淋巴结转移方面比较,差异均无统计学意义(P>0.05);经Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,结直肠癌的NR2F1高表达患者的10年总生存率为26.79%,明显高于NR2F1低表达患者的17.86%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论结直肠癌的NR2F1表达升高,NR2F1可能参与了结直肠癌的发生、侵袭,对患者的预后造成一定的影响。

核受体NR6A1与NDRG1互作促进肝癌进展

核受体在细胞稳态的维持以及疾病的发生发展等方面发挥着重要的作用。为了探究核受体亚家族6A组成员1(nuclear receptor subfamily 6 group A member 1,NR6A1)在肝癌中的作用及机制,首先,分析了癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)等数据库信息,发现NR6A1在肝癌中异常高表达且与患者预后不良有关;然后,通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)、划痕实验发现,干扰NR6A1使肝癌细胞的增殖明显受到抑制但不影响细胞的迁移;其次,通过免疫共沉淀、免疫荧光、RNA干扰和过表达等实验,鉴定出N-myc下游调控基因1(N-myc downstream-regulated gene 1,NDRG1)是NR6A1在肝癌中的互作蛋白质,二者在肝癌中的表达呈正相关,且NR6A1正调控NDRG1的表达;最后,利用功能拯救实验证实,干扰NDRG1可以抑制NR6A1过表达造成的肝癌细胞增殖增强的现象。综上可知,NR6A1通过与NDRG1相互结合且上调NDRG1的表达来发挥促癌作用。

核受体NR2E1与肥胖人群慢性炎症状态的相关性研究

目的:探讨核受体亚家族2,E组,成员1(nuclear receptor subfamily 2,group E,member 1,NR2E1)与肥胖人群慢性炎症状态的相关性。方法:选取42例肥胖患者作为肥胖组,53例健康体检者为对照组。检测两组身高、体质量、腰围(waist circumference,WC)、血浆三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、空腹胰岛素(fasting insulin,FIN)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)等指标。采用胰岛素抵抗稳态模型(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)评估胰岛素抵抗指数。分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),Western Blot检测NR2E1蛋白水平;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测上清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)浓度。结果:肥胖组体质量指数、WC、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FIN、HOMA-IR均较对照组明显升高(均P<0.01);且肥胖组NR2E1、TNF-α及IL-6表达水平均较对照组明显增加(均P<0.01);NR2E1表达水平与TC、LDL-C、TNF-α、IL-6均呈正相关(r=0.478、0.439、0.609、0.696,均P<0.01);NR2E1的变化与IL-6呈正相关关系(R2=0.524,B=0.019,β=0.488,t=2.275,P=0.029)。结论:NR2E1在肥胖患者中表达增加可能跟肥胖相关慢性炎症状态有关。

结肠癌患者组织中NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107表达及其与预后的关系

目的探究结肠癌患者组织中染色体凝缩蛋白复合物I的亚基D2(NCAPD2)、Lnc RNA核受体亚家族2F组成员1-反义RNA1(Lnc RNA NR2F1-AS1)、核孔蛋白107(Nup107)的表达及其与患者预后的关系。方法选择2017年6月至2019年6月在广州中医药大学第一附属医院及暨南大学附属广州市红十字会医院进行根治性切除术的60例结肠癌患者作为研究对象,术中采集患者的结肠癌组织标本和距离结肠癌组织>2 cm的癌旁正常组织标本。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法测定结肠癌组织和癌旁组织的Lnc RNA NR2F1-AS1表达水平,采用免疫组化SP法测定结肠癌组织和癌旁组织的NCAPD2和Nup107表达情况。比较结肠癌组织和癌旁组织的Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达情况,同时比较Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107不同表达患者的临床资料。采用COX回归模型分析Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达对结肠癌患者预后的影响,采用Kaplan-Meier法绘制结肠癌患者的生存曲线,分析Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达情况与结肠癌患者预后的相关性。结果结肠癌组织的Lnc RNA NR2F1-AS1相对表达量为1.09±0.28,明显低于癌旁组织的0.69±0.09,结肠癌组织的Lnc RNA NR2F1-AS1高表达率、NCAPD2阳性率和Nup107高表达率分别为55.00%、61.67%和70.00%,明显高于癌旁组织的26.67%、30.00%和31.67%,差异均有统计学意义(P<0.05);Lnc RNA NR2F1-AS1高表达和低表达患者、NCAPD2阳性患者和阴性患者、Nup107高表达患者和低表达患者在肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转移和远端转移方面比较,差异均有统计学意义(P<0.05);COX回归分析结果显示,Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2和Nup107表达均是结肠癌患者预后的影响因素(P<0.05);Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,Lnc RNA NR2F1-AS1高表达、NCAPD2阳性和Nup107高表达患者的中位生存期分别低于Lnc RNA NR2F1-AS1低表达、NCAPD2阴性和Nup107低表达患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107的表达与结肠癌患者的肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转移和远端转移等临床病理特征有关,三者可能共同参与了结肠癌的发生、发展,对患者的预后造成一定影响。

小鼠NR1D1基因过表达载体的构建及其生物信息学分析

目的:构建小鼠核受体亚家族1组D成员1(NR1D1)基因的过表达载体,分析小鼠NR1D1蛋白的基本特征。方法:从小鼠肝脏组织中提取总RNA,反转录后获得cDNA,采用PCR技术扩增得到小鼠NR1D1基因的编码区片段,经同源重组与pcDNA3.1载体相连接,将酶切鉴定和测序正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-NR1D1。将pcDNA3.1空质粒和pcDNA3.1-NR1D1重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为对照组和pcDNA3.1-NR1D1转染组,48 h后提取总RNA和总蛋白样品,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Westernblotting法检测2组细胞中NR1D1 mRNA和蛋白表达水平。使用DNAStar和MEGA7软件对小鼠与其他物种的NR1D1基因编码区序列(CDS)进行相似性分析,并构建系统进化树;利用ExPASy、ProtScale、SingalP5.0、TMHMM-2.0、PhosphoSitePlus®、SOPMA和SWISS-MODEL等在线工具分析NR1D1蛋白的氨基酸组成、亲/疏水性、跨膜区域、信号肽、二级结构和三级结构。结果:酶切鉴定和测序结果均表明过表达载体pcDNA3.1-NR1D1构建成功。与对照组比较,pcDNA3.1-NR1D1转染组细胞中NR1D1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。生物信息学分析,小鼠NR1D1 CDS区与人、大鼠、中国仓鼠、黑猩猩、兔、犬、猪、马、牛、绵羊、山羊、家猫和斑马鱼的相似性分别为90.0%、94.8%、86.5%、90.0%、89.6%、88.3%、89.7%、89.8%、88.8%、89.1%、89.1%、89.7%和65.1%。系统进化树分析,小鼠NR1D1基因与中国仓鼠和大鼠的遗传距离最近,与斑马鱼的遗传距离最远。小鼠NR1D1蛋白是一种疏水性碱性蛋白质,不属于分泌蛋白和跨膜蛋白,含有12个磷酸化位点和10个泛素化位点;二级结构中无规则卷曲占54.63%,α-螺旋占26.50%,延伸链占12.68%,β-转角占6.18%;三级结构预测,小鼠与人的NR1D1蛋白相似度大,差异较小。结论:成功构建了小鼠NR1D1基因过表达载体pcDNA3.1-NR1D1,验证了其在HEK293T细胞中的过表达效果,为进一步研究NR1D1基因及其蛋白的功能提供了依据。

LncRNA NR2F2-AS1靶向抑制miR-129-5p调控子宫内膜癌细胞增殖和凋亡研究

目的:探讨长链非编码RNA(LncRNA)核受体亚家族2组F成员2反义RNA1(NR2F2-AS1)靶向抑制微小RNA-129-5p(miR-129-5p)调控子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的情况。方法:选取2020年4月—2020年12月经病理检查确诊为子宫内膜癌的50例患者。采用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)对子宫内膜癌组织与细胞中miR-129-5p和LncRNA NR2F2-AS1的表达水平进行检测;用流式细胞术与MTT比色法(MTT法)对子宫内膜癌细胞(Ishikawa)凋亡与增殖水平进行检测;用蛋白质印迹法(Western blot)对细胞中B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、兔抗人单克隆抗体(Bax)、p21基因(p21)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表达水平进行检测;采用双荧光素酶报告系统对miR-129-5p与LncNR2F2-AS1的调控关系进行验证。结果:子宫内膜癌组织中LncRNA NR2F2-AS1的含量明显高于正常子宫内膜组织(P<0.05)。干扰LncNR2F2-AS1表达、过表达miR-129-5p可抑制子宫内膜癌细胞增殖,加速细胞凋亡,细胞中的Bcl-2和CyclinD1含量大幅降低(P<0.05),而p21含量明显升高(P<0.05)。结论:干扰LncRNA NR2F2-AS1可以靶向促进miR-129-5p的表达,从而抑制子宫内膜癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。

LncRNA NR2F1-AS1在结肠癌组织中的表达及其与预后的相关性

目的:探讨长链非编码RNA(LncRNA)核受体亚家族2F组成员1-反义RNA 1(NR2F1-AS1)在结肠癌患者中的表达水平及其与预后的相关性。方法:选取本院2015年07月至2017年02月诊治的93例结肠癌患者的癌组织及对应癌旁正常组织进行研究。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测结肠癌组织及对应癌旁正常组织LncRNA NR2F1-AS1表达水平;分析癌组织LncRNA NR2F1-AS1表达水平与结肠癌患者临床病理特征的相关性;采用Kaplan-Meier曲线法分析结肠癌患者癌组织中LncRNA NR2F1-AS1表达水平与结肠癌患者预后的相关性;采用COX回归分析结肠癌预后的影响因素。结果:结肠癌组织LncRNA NR2F1-AS1表达水平明显低于癌旁正常组织(P<0.05);结肠癌患者癌组织LncRNA NR2F1-AS1表达水平与结肠癌患者TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、分化程度相关(P<0.05),而与结肠癌患者性别、年龄、肿瘤大小、位置无关(P>0.05);结肠癌患者LncRNA NR2F1-AS1低表达组术后36个月总生存率(OS)、无病生存率(DFS)明显低于LncRNA NR2F1-AS1高表达组OS、DFS(P<0.05);COX回归分析显示,TNM分期、淋巴结转移是影响结肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05),LncRNA NR2F1-AS1是影响结肠癌患者预后的独立保护因素(P<0.05)。结论:LncRNA NR2F1-AS1在结肠癌患者癌组织中表达水平明显降低,且低水平LncRNA NR2F1-AS1与结肠癌患者不良预后密切相关,有利于判定结肠癌患者预后情况。

乳化异氟醚对低氧性肺动脉内皮细胞损伤及NR4A1表达的影响

目的:探讨乳化异氟醚(EI)对低氧性肺动脉内皮细胞(HPAECs)损伤及孤儿核受体亚家族4A1(NR4A1)表达的影响。方法:将HPAECs分为正常对照组、模型组和实验组;正常对照组置于常氧下培养,模型组和实验组细胞置于氧浓度约为3%的低氧箱(95%N2+5%CO2)中处理2 h。实验组加入终浓度为1 mmol/L EI,正常对照组和模型组加入30%Intralipid■;于干预0、1、2、4、8、12 h后MTT法检测细胞增殖情况,Hoechst 33258核染色法检测细胞凋亡,Griess法检测细胞上清NO生成量,蛋白免疫印迹法(WB)及实时荧光定量PCR(q-RT-PCR)检测细胞中NR4A1蛋白及mRNA表达量。结果:干预0~12 h,模型组和实验组细胞活力呈逐渐降低趋势,但干预后2~12 h实验组细胞活力均高于模型组(P<0.05);干预0~12 h,模型组和实验组细胞凋亡率呈逐渐升高趋势,但干预后2~12 h实验组细胞凋亡率均低于模型组(P<0.05);干预0~12 h,模型组和实验组细胞上清中NO浓度呈逐渐降低趋势,但干预后2~12 h实验组细胞NO均高于模型组(P<0.05);干预0~12 h,模型组和实验组细胞NR4A1蛋白及mRNA相对表达量呈逐渐升高趋势,但干预后2~12 h实验组细胞NR4A1 mRNA相对表达量均低于模型组(P<0.05)。结论:EI可促进低氧性HPAECs增殖,抑制凋亡,并增加NO的生成,NR4A1可能参与了低氧后内皮细胞损伤的内源性保护机制。

miR-7977、NR4A1在狼疮性肾炎肾组织中的表达及意义

目的探究miR-7977、核受体亚家族4A组成员1(NR4A1)在狼疮性肾炎(LN)肾组织中的表达及临床意义。方法选取2016年3月—2019年4月收治的126例系统性红斑狼疮为研究对象,根据肾组织病理检查分为LN组58例与非LN组68例。比较两组肾组织miR-7977表达量及NR4A1表达评分差异,应用受试者工作特征(ROC)曲线评估二者对LN的诊断价值;比较不同病理分型LN患者肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分,并采用Spearman秩相关分析二者与病理分型的相关性。结果LN组肾小管萎缩、间质纤维化发生率均高于非LN组(P<0.01);LN组肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分均高于非LN组(P<0.01)。肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分对LN均有较高诊断价值(曲线下面积分别为0.888、0.897)。不同病理分型LN患者肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。肾组织miR-7977表达量和NR4A1表达评分与LN患者病理分型无明显相关性(P>0.05)。结论肾组织miR-7977表达量、NR4A1表达评分能辅助诊断LN,在LN诊疗中具有重要作用。

长链非编码RNA NR2F1-AS1靶向微小RNA-145-5p调控结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)核受体亚族2F组成员1反义RNA(NR2F1-AS1)对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法收集2015年3月至2017年5月青海省第五人民医院外科手术切除并经病理证实为原发性结肠腺癌组织25例,另留取距肿瘤边缘3 cm的癌旁组织(正常结肠组织)。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测结肠癌组织和癌旁组织中NR2F1-AS1和微小RNA-145-5p(miR-145-5p)表达水平。以结肠癌细胞HCT116为研究对象,双荧光素酶报告基因实验验证NR2F1-AS1和miR-145-5p调控关系。转染NR2F1-AS1小干扰RNA或miR-145-5p模拟物至HCT116细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)和Transwell分别检测干扰NR2F1-AS1表达或过表达miR-145-5p对HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果与癌旁组织比较,结肠癌组织中NR2F1-AS1表达升高[(3.39±0.33)比(1.01±0.11),P<0.05],miR-145-5p表达降低[(0.55±0.05)比(1.00±0.08),P<0.05]。与共转染WT-NR2F1-AS1的miR-NC组比较,miR-145-5p组细胞荧光素酶活性降低P<0.05)。过表达NR2F1-AS1后细胞中miR-145-5p表达水平降低(P<0.05),干扰sNR2F1-AS1表达后细胞miR-145-5p表达水平升高(P<0.05)。干扰NR2F1-AS1表达或过表达miR-145-5p后,HCT116细胞光密度(OD)值、迁移和侵袭数降低(P<0.05)。干扰miR-145-5p表达逆转了干扰NR2F1-AS1表达对HCT116细胞OD值、迁移和侵袭数的影响。结论NR2F1-AS1在结肠癌组织中呈高表达,干扰NR2F1-AS1表达可能通过上调miR-145-5p表达来抑制结肠癌细胞恶性行为,是结肠癌治疗的潜在靶点。

孤儿核受体Nur77在衣霉素诱导小鼠海马神经元损伤中的作用:与内质网应激的关系

目的评价孤儿核受体Nur77在衣霉素(TM)诱导小鼠海马神经元损伤中的作用及其与内质网应激的关系。方法小鼠HT22细胞,采用随机数字表法分为4组(n=10):对照组(C组)、Nur77特异性激动剂Csn-B组(Csn-B组)、内质网应激诱导剂TM组(TM组)和TM+Csn-B组。C组细胞正常培养24 h;Csn-B组培养基中加入Csn-B(终浓度为10μg/ml)培养细胞24 h;TM组培养基中加入TM(终浓度为200 ng/ml)培养24 h诱导细胞内质网应激损伤;TM+Csn-B组培养基中加入Csn-B(终浓度为10μg/ml)预处理细胞15 min后,给予TM(终浓度为200 ng/ml)共同培养24 h。各组细胞处理结束后采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,Western blot法检测内质网应激相关蛋白CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和活化的caspase-3(cleaved-caspase-3)的表达。结果与C组比较,TM组细胞活力下降,CHOP、GRP78、Bax和cleaved-caspase-3表达上调,Bcl-2和caspase-3表达下调(P<0.05或0.01);与TM组比较,TM+Csn-B组细胞活力升高,CHOP、GRP78、Bax和cleaved-caspase-3表达下调,Bcl-2和caspase-3表达上调(P<0.05或0.01)。结论孤儿核受体Nur77参与了TM诱导小鼠海马神经元损伤的过程,与激活内质网应激有关。

小鼠念珠菌性阴道炎中维A酸相关孤儿受体、白细胞介素17表达

目的探讨Th17／白细胞介素（IL）17轴在小鼠念珠菌性阴道炎发病中作用。方法120只雌性BALB／c小鼠随机分为雌激素感染组（Ei）、雌激素非感染组（En）、对照感染组（Ci）和对照非感染组（Cn）。Ei、En组在阴道接种前3d于后腿皮下注射雌二醇0．05mg，而Ci、Cn组皮下注射灭菌大豆油0．1ml，以后隔日注射1次直至实验结束；Ei、Ci组在接种日在阴道内接种白念珠菌悬液10μL（5×10^4个孢子），而En、Cn组阴道内注入10μl无菌磷酸盐缓冲液。接种后3、7、14d，每组于各时间点分别随机取10只小鼠处死，完整切取阴道组织作液氮冷冻或石蜡包埋，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹和免疫荧光染色分别检测阴道组织中维A酸相关孤儿受体（ROR）γt、RORα、IL-17mRNA、蛋白表达及免疫荧光强度。结果激光共聚焦显微镜显示，En、Cn组中RORγt、RORα和IL—17主要表达于阴道固有膜及血管中炎症细胞，Ci组中主要表达于黏膜上皮及其表面附着的菌丝、固有膜及血管中炎症细胞，Ei组中则广泛分布于黏膜上皮、固有膜及血管中炎症细胞、阴道腔和黏膜上皮中内吞菌丝。qRT-PCR和免疫荧光检查显示，En、Ci和Ei组中RORγt、RORα、IL-17mRNA表达及其免疫荧光强度在相同时间点均显著高于Cn组（均P〈0．05），且Ei组显著高于En、ci组（P〈0．05）；除Cn组外，其余各组中RORγt、RORα、IL-17mRNA表达及其免疫荧光强度均随时间延长有增加的趋势，其中RORγt、RORαmRNA和免疫荧光强度及IL-17mRNA一般在14d时最高，而IL-17免疫荧光强度在7d时最高（P〈0．05）。Western印迹显示，Ci、Ei组中RORγt和IL-17蛋白表达在相同时间点均明显高于Cn、En组（RORγt：F组别=45．685，P〈0．001；IL-17：F组别=29．655，P〈0．01），其中H组表达水平最高（P〈0.05），而Cn、En组表达差异无统计学意义（P〉0．05）；Ci、Ei组中二者表达均在感染后7d明显上调，14d无显著增加（RORγt：Fs时间=13．137，P〈0．001；IL-17：F时间=11．182，P〈0．001）。结论阴道念珠菌感染可上调RORγt、RORα、IL-17表达，提示Th17／IL-17轴可能参与BALB／c小鼠念珠菌性阴道炎发生。

NR4A1通过上调NRF2表达抑制顺铂诱导的近端肾小管上皮细胞铁死亡

目的探究核受体亚家族4 A组成员1(nuclear receptor subfamily 4 group A member 1,NR4A1)在缓解顺铂对近端肾小管上皮细胞毒性的作用及其分子机制。方法通过"Tabula-muris"单细胞转录组测序数据库分析肾脏组织各细胞亚群NR4A1基因的表达。在近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系及原代细胞中,通过慢病毒感染以过表达NR4A1基因。采用细胞增殖与毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测顺铂的细胞毒性。细胞用碘化丙啶(propidium iodide,PI)单染后通过流式细胞仪检测细胞的死亡比例。通过实时荧光定量PCR和Western印迹法检测细胞中NR4A1和核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)基因的表达。通过检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)以及脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量分析细胞铁死亡程度。结果单细胞转录组数据分析的结果表明NR4A1基因表达在肾脏组织的近端肾小管上皮细胞亚群中最低。50μmol/L和100μmol/L顺铂能够显著诱导近端肾小管上皮细胞MDA、GSSG和脂质ROS含量的上升(均P<0.01),且顺铂浓度越高诱导MDA、GSSG和脂质ROS增加越多。相比对照HK-2细胞,过表达NR4A1的HK-2细胞脂质ROS含量及铁离子含量显著较低(均P<0.01),过表达NR4A1抑制了顺铂对近端肾小管上皮细胞的毒性及其诱导的铁死亡。分子机制研究发现,在近端肾小管上皮细胞中,过表达NR4A1上调了抗铁死亡基因NRF2的表达(P<0.01)。进一步单细胞转录组数据分析的结果表明,与NR4A1在肾脏组织细胞亚群的表达状态相似,NRF2表达在近端肾小管上皮细胞中也最低。结论顺铂能够诱导近端肾小管上皮细胞发生铁死亡,且浓度越高越明显。NR4A1通过上调近端肾小管上皮细胞NRF2的表达抑制顺铂诱导的细胞铁死亡,从而缓解顺铂对细胞的毒性。

Rev-erbα在血管内皮损伤后内膜增生中的作用

目的探讨Rev-erbα在血管内皮损伤后内膜增生中的作用。方法将雄性野生型C57BL/6J小鼠80只随机分为假手术1组和2组、激动剂1组、抑制剂1组、损伤1组和2组、激动剂2组和抑制剂2组,每组10只,前4组仅行假手术,后4组用机械损伤颈动脉内皮法构建模型,造模后,按分组分别腹腔注射激动剂SR9011或抑制剂SR8278各100 mg/kg,1次/d,4周。用100 nmol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)干预小鼠主动脉平滑肌细胞系(MOVAS)24 h诱导体外增殖,特异性小分子干扰(siRNA)转染技术敲低细胞中核苷酸结合寡聚化域样受体蛋白3(Nlrp3)水平。将细胞分为对照1组、2组和3组,AngⅡ1组、2组和3组,SR9011组,SR8278组,AngⅡ+SR8278组,siRNA对照组,si-Nlrp3组,SR8278+si-Nlrp3组,后9组用AngⅡ干预24 h,SR9011组和SR8278组先用5μmol/L的SR9011或SR8278干预12 h;后3组用siRNA敲低Nlrp3水平。分别用qRT-PCR和Western blot测Rev-erbα、Nlrp3 mRNA和蛋白表达,苏木精-伊红染色观察颈动脉内膜增生,分别用CCK-8法和Ki-67免疫荧光术测细胞增殖率。结果与假手术1组比较,内皮损伤1组Rev-erbαmRNA及蛋白表达下降(P<0.01)。与假手术2组比较,内皮损伤2组内膜增生更明显(P<0.01)。与内皮损伤2组比较,激动剂2组内膜/中膜面积比值下降(P<0.01);抑制剂2组内膜/中膜面积比值升高(P<0.01)。与对照1组比较,AngⅡ1组Rev-erbαmRNA和蛋白表达下降(P<0.01)。与AngⅡ2组比较,SR9011组吸光度和阳性细胞率减少,SR8278组吸光度和阳性细胞率明显增加(P<0.05)。与对照2组比较,AngⅡ2组Nlrp3 mRNA和蛋白表达增加(P<0.01);与AngⅡ2组比较,SR9011组Nlrp3 mRNA和蛋白表达降低,SR8278组Nlrp3 mRNA和蛋白表达增加(P<0.05)。si-Nlrp3组较siRNA对照组阳性细胞减少[(0.133±0.012)%vs(0.337±0.023)%,P<0.05];SR8278+si-Nlrp3组较AngⅡ+SR8278组阳性细胞减少[(0.138±0.011)%vs(0.498±0.023)%,P<0.05]。结论Rev-erbα可能通过抑制Nlrp3表达,抑制细胞增殖,抑制血管内皮损伤后内膜增生的进展。

NR5A1基因p.L289R突变导致46,XY DSD病例1例

目的 报道NR5A1基因p.L289R突变导致46,XY DSD,扩充46,XY DSD产前诊断基因位点。方法 对先征者进行家系调查、全外显子组检测CNV分析,对检测到的目标基因进行致病性分析。结果 先征者、先证者姐姐和母亲均携带NR5A1基因c.866T>G(p.L289R)突变,先征者父亲未携带该基因突变位点。结论 NR5A1基因c.866T>G(p.L289R)突变导致先征者46,XY DSD的发生。

NR4A1及其翻译后修饰在炎症性相关肺实质疾病中调控作用的研究进展

核受体亚家族4A组成员1(nuclear receptor subfamily 4 group A member 1,NR4A1)是由多种应激源诱导的早期转录因子,参与细胞生理活动与病理进程,尤其是在炎症相关的肺部疾病中发挥关键的调节作用,且其活性表达受转录后修饰的调节。文章探讨了NR4A1在哮喘、急性肺损伤(acute lung injury,ALI)、肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)中的调控作用,并对其小泛素相关修饰物(small ubiquitin‑like modifier,SUMO)修饰、磷酸化、乙酰化转录后修饰调节机制进行综述,为进一步明确NR4A1在肺实质性疾病中转录后修饰的调控机制及寻找临床肺实质相关疾病的防治靶点提供理论依据。

Rev-erbα/Bmal1信号通路在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及其与自噬的关系

目的评价Nr1D1核受体亚家族1,组D,成员1(Rev-erbα)/芳香烃受体核转位蛋白样1受体(Bmal1)信号通路在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及其与自噬的关系。方法SPF级成年雄性SD大鼠,6~8周龄,体重200~220 g,腹腔注射链脲佐菌霉素60 mg/kg建立1型糖尿病模型,糖尿病造模成功后继续饲养8周。取糖尿病大鼠30只,采用随机数字表法分为3组:糖尿病假手术组(DS组,n=6)、糖尿病心肌缺血再灌注组(DI/R组,n=12)和糖尿病心肌缺血再灌注+Rev-erbα拮抗剂SR-8278组(DI/R+SR组,n=12)。另取非糖尿病大鼠18只,采用随机数字表法分为2组:非糖尿病假手术组(NS组,n=6)和非糖尿病心肌缺血再灌注组(NI/R组,n=12)。采用结扎左冠状动脉前降支30 min再灌注120 min的方法建立心肌缺血再灌注损伤模型。DI/R+SR组于缺血前1 h时经股静脉注射SR-82782 mg/kg。再灌注结束即刻采集颈动脉血标本,采用ELISA法检测血清cTnI、CK-MB和LDH水平;然后处死大鼠,取心肌组织,采用TTC法测定心肌梗死面积百分比,透射电镜下计数自噬小体,采用RT-PCR检测Rev-erbα和Bmal1的mRNA表达水平,Western blot法检测Rev-erbα、Bmal1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ和LC3Ⅰ的表达水平,并计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。结果与NS组比较,NI/R组心肌梗死体积百分比、血清cTnI、CK-MB和LDH水平和自噬小体计数升高,心肌组织Rev-erbα及其mRNA表达上调,Bmal1及其mRNA表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,DS组血清cTnI、CK-MB和LDH水平升高,自噬小体计数降低,心肌组织Rev-erbα及其mRNA表达上调,Bmal1及其mRNA表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05);与NI/R组比较,DI/R组心肌梗死体积百分比、血清cTnI、CK-MB和LDH水平升高,自噬小体计数降低,心肌组织Rev-erbα及其mRNA表达上调,Bmal1及其mRNA表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05);与DS组比较,DI/R组心肌梗死体积百分、血清cTnI、CK-MB和LDH水平和自噬小体计数升高,心肌组织Rev-erbα及其mRNA表达上调,Bmal1及其mRNA表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05);与DI/R组比较,DI/R+SR组心肌梗死体积百分比、血清cTnI、CK-MB和LDH水平降低,自噬小体计数降低,心肌组织Rev-erbα及其mRNA表达下调,Bmal1及其mRNA表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05)。结论Rev-erbα/BMAL1信号通路可通过调节细胞自噬水平,参与糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的过程。

糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时Rev-erbα与NLRP3炎症小体的关系

目的评价糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时Nr1D1核受体亚家族1,组D,成员1(Rev-erbα)与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体的关系。方法SPF级健康成年雄性SD大鼠,体重210~240 g,采用腹腔注射1%链脲佐菌素60 mg/kg制备1型糖尿病模型。取非糖尿病大鼠18只,采用随机数字表法分为2组:非糖尿病假手术组(NS组,n=6)和非糖尿病心肌缺血再灌注组(NIR组,n=12)。取糖尿病大鼠30只,采用随机数字表法分为3组:糖尿病假手术组(DS组,n=6)、糖尿病心肌缺血再灌注组(DIR组,n=12)和糖尿病心肌缺血再灌注+Rev-erbα抑制剂SR8278组(DIR+SR组,n=12)。采用结扎左冠脉前降支30 min后再灌注120 min的方法建立心肌缺血再灌注损伤模型。DIR+SR组于缺血前1 h时经股静脉注射SR82782 mg/kg。再灌注结束时经采用ELISA法检测血清CK-MB、LDH和cTnI浓度,TTC法测心肌梗死面积百分比,HE染色法观察心肌组织病理学结果,Western blot法检测心肌组织Rev-erbα、NLRP3和IL-1β的表达水平。结果与假手术大鼠比较,心肌缺血再灌注大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI浓度升高,心肌组织Rev-erbα、NLRP3和IL-1β表达上调(P<0.05),心肌组织病理学损伤明显;与NIR组比较,DIR组心肌梗死面积百分比、血清CK-MB、LDH和cTnI浓度升高,心肌组织Rev-erbα、NLRP3和IL-1β表达上调(P<0.05),心肌组织病理学损伤加重;与DIR组比较,DIR+SR组心肌梗死面积百分比、血清CK-MB、LDH和cTnI水平降低,心肌组织Rev-erbα、NLRP3和IL-1β表达下调(P<0.05),心肌组织病理学损伤减轻。结论Rev-erbα可促进NLRP3炎症小体活化,参与糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的病理生理机制。