雄激素受体与核受体辅助抑制因子的关系

目的 :探讨雄激素受体 (AR)与核受体辅助抑制因子 (SMRT)是否能相互作用及其作用部位。方法 :重组构建AR ,SMRT基因或其基因片段的质粒 ,体外转录 ,合成3 5S标记融合蛋白 ,采用转染试验及哺乳动物细胞双杂交实验 (transienttransfection ,mammaliantwo hybridtest) ,GST沉淀试验 (GSTpull downassay) ,间接免疫荧光观察(indirectimmunofluorescencestaining)的方法 ,观察AR与SMRT的关系。结果 :AR具有内在的转录抑制活性 ,可与SMRT直接作用 ,其作用部位 :在AR分子上位于配体结合区 (LBD) ,而DNA结合区能增强这种作用 ;在SMRT分子上则位于羧基端核受体作用区 (IDs) ,在这个区域的LXXXIXXXI/L功能基团突变后将会影响AR与SMRT的结合。结论

核受体辅助抑制因子在急性非淋巴细胞白血病细胞株中的表达

目的:明确核受体辅助抑制因子(N-CoR)在急性非淋巴细胞白血病细胞株及细胞分化过程中表达的变化,探讨其在急性白血病中的意义。方法:RT-PCR半定量检测16种急性非淋巴细胞白血病细胞株中N-CoR的基因表达及急性早幼粒细胞白血病细胞株在维A酸作用过程中的变化。结果:N-CoR在所有细胞株中都有表达,在急性早幼粒细胞白血病细胞株中随着细胞的分化表达增加。结论:N-CoR对维持白血病细胞的增殖起重要作用,其表达量的变化和细胞的分化状态相关。

核受体辅助抑制因子中ETO结合结构域的确定

目的 为消除急性髓系白血病标志基因AML1/ETO的活性 ,确定核受体辅助抑制因子(nuclearreceptorco repressor,N CoR)与ETO基因相互作用的活性部位。方法 用PCR扩增不同区段的N CoR(N CoRY) ,克隆入酵母表达质粒pGADGL中 ,构建获得pGADGL/N CoRY。应用酵母双杂交技术及X gal染色确定pGADGL/N CoRY 10个区段的N CoR是否与ETO结合。结果 N CoR的 988～ 112 6氨基酸残基与 15 5 1～ 180 1氨基酸残基共存时 ,才能与ETO发生结合作用 ,是与ETO相互作用的结构域。结论 N CoR两个结构域能与ETO的两个锌指结构作用 ,保持两种蛋白之间的稳定结合。

壮骨健膝方对兔膝骨关节炎滑膜炎症肝X受体/核因子κB通路的影响

目的:基于肝X受体/核因子κB信号通路观察壮骨健膝方对兔膝骨关节炎滑膜炎症模型的影响,探讨其对滑膜炎症的作用及机制。方法:将24只新西兰大白兔随机分为正常组6只和造模组18只。造模组行膝关节腔内注射木瓜蛋白酶建立兔膝骨关节炎滑膜炎症模型。造模成功后将模型兔随机分为模型组、扶他林组和壮骨健膝方组,每组6只。扶他林组和壮骨健膝方组分别给予扶他林混悬液、壮骨健膝方药液灌胃,模型组和正常组给予等量生理盐水灌胃。观察干预前后各组兔膝关节皮温、周径、Lequesne MG评分;膝关节液中IL-1β、TNF-α、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、MMP-13含量;滑膜组织评分;滑膜组织中LXRα、N-CoR、P50、P65 mRNA的表达情况。结果:与正常组比较,模型组兔一般情况差,膝关节皮温、周径、Lequesne MG评分、膝关节液中IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量、滑膜组织评分、P50和P65 mRNA表达均升高(均P<0.05),滑膜组织中LXRα和N-CoR mRNA表达降低(均P<0.05)。与模型组比较,壮骨健膝方组及扶他林组膝关节皮温、周径、Lequesne MG评分、膝关节液中IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量、滑膜组织评分、P50和P65 mRNA表达均较低(均P<0.05),壮骨健膝方组LXRα与N-CoR mRNA表达升高(均P<0.05),扶他林组LXRα与N-CoR mRNA表达差异无统计学意义(均P>0.05)。与扶他林组比较,壮骨健膝方组LXRα、N-CoR mRNA表达升高(均P<0.05),关节周径较小(P<0.05),其余指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:壮骨健膝方可能通过调控肝X受体/核因子κB信号通路的转导,减少下游炎症介质分泌,达到抑制膝骨关节炎滑膜炎症反应的作用。

miR-762通过靶向调控NCOR1表达对人舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-762与核受体辅助抑制因子1(NCOR1)的靶向关系及其对人舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞增殖和凋亡的影响,为TSCC临床诊断和治疗提供新的分子标志物和靶点。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测48例TSCC患者癌组织及其癌旁正常组织中miR-762和NCOR1 mRNA表达水平,并通过Pearson相关分析法分析两者表达的相关性。采用RT-qPCR法和Westernblotting法检测人正常舌上皮细胞Hacat及人TSCC细胞(Tca-8113、CAL-27、SCC-15和SCC-9)中miR-762和NCOR1 mRNA及蛋白表达水平。将miR-762 inhibitor或si-NCOR1分别或同时转染至CAL-27细胞中,实验分为空白对照组、inhibitor-NC组、miR-762 inhibitor组、si-NC组、si-NCOR1组和miR-762 inhibitor+si-NCOR1组,采用RT-qPCR法检测CAL-27细胞中miR-762和NCOR1 mRNA表达水平,MTT法检测各组细胞增殖活性,EdU法检测各组EdU染色阳性细胞率,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Westernblotting法检测各组细胞中NCOR1、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase-3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平,荧光素酶报告实验验证miR-762与NCOR1的靶向调控关系。结果:与癌旁正常组织和正常上皮细胞Hacat比较,TSCC组织和TSCC细胞中miR-762表达水平明显升高(P<0.01),而NCOR1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01),且在TSCC组织中miR-762与NCOR1 mRNA表达水平呈负相关关系(r=-0.711,P=0.003)。荧光素酶报告实验证实NCOR1是miR-762的靶基因。与空白对照组和inhibitor-NC组比较,miR-762 inhibitor组细胞增殖活性、EdU阳性细胞率和细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01),细胞凋亡率和细胞中cleaved-Caspase-3及Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与miR-762 inhibitor组比较,miR-762 inhibitor+si-NCOR1组细胞增殖活性、EdU阳性细胞率和细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.01),细胞凋亡率和细胞中cleaved-Caspase-3及Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:抑制miR-762表达能通过靶向上调NCOR1表达抑制TSCC细胞的增殖,并促进细胞凋亡。

催乳素在Jurkat细胞中信号传导分子的蛋白质组分析

目的:利用蛋白质组学分析催乳素(PRL)在人T淋巴白血病细胞株JurkatD1.1细胞中所激活的信号传导分子。方法:应用重组人催乳素(rhPRL)刺激JurkatD1.1细胞。利用磷酸化金属亲和层析法(PMAC)和免疫沉淀法(IP)富集磷酸化蛋白,单向凝胶电泳(1 DE)或者双向凝胶电泳(2 DE)分离磷酸化蛋白。分析不同组的凝胶,获取有差异的蛋白质条带和斑点。质谱分析并与蛋白质数据库进行匹配鉴定。结果:PMAC法获取的磷酸化蛋白用1 DE分离,胶扫描分析发现对照组和rhPRL刺激组之间存在五条明显差别的条带,其中三条条带在rhPRL刺激组,两条在对照组。质谱分析并与数据库匹配,成功鉴定刺激组中一条条带的蛋白质,为热休克蛋白90(Hsp90)。IP法获取的磷酸化蛋白,经过2 DE分离,胶扫描分析后,挖取rhPRL刺激组凝胶的九个蛋白质点。质谱分析并与数据库匹配,成功鉴定三个斑点的蛋白质分别是核内受体辅助抑制因子2变异体、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和锌指蛋白ZIM3。结论:催乳素上调磷酸化热休克蛋白90(Hsp90),Hsp90可能参与催乳素的信号传导。催乳素信号分子调节目的基因的表达可能有核内受体辅助抑制因子2变异体和锌指蛋白ZIM3的参与。