核因子红细胞2相关因子2在毒死蜱毒性机制中的作用

毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)是一种广泛使用的有机磷农药,其对人类健康和生态系统的潜在风险已引起广泛关注。CPF主要通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)发挥杀虫作用,但越来越多的研究表明,CPF的毒性作用远不止于此,也与氧化应激、炎症反应、细胞死亡等多种生物学过程密切相关,因而可能导致神经退行性疾病、生殖发育障碍以及其他慢性健康问题。核因子红细胞2相关因子2(Nrf 2)作为一种关键的抗氧化应激调节因子,具有显著的保护作用。本文旨在综述Nrf 2在调节CPF诱导的氧化应激、神经毒性、细胞死亡和炎症反应中的作用机制,探讨其作为潜在治疗靶点的前景,以为开发新的CPF中毒治疗策略提供理论基础。

核转录因子红细胞2相关因子2在糖尿病心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

目的:糖尿病作为最常见的代谢性疾病,与心血管疾病密切相关,是急性心肌梗死发生的独立危险因素。核转录因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,NRF2)是细胞抗氧化反应的关键,它可通过与其他蛋白质相互作用并与抗氧化反应元件结合来增加下游抗氧化基因的转录,维持氧化还原反应的动态平衡。研究表明,NRF2参与调控糖尿病心肌缺血再灌注损伤的发生发展,但其机制尚不完全清楚,文章主要综述与糖尿病心肌缺血再灌注损伤相关的NRF2信号通路及NRF2靶向治疗的研究进展,为糖尿病心肌缺血再灌注损伤的临床治疗提供新的思路。

核因子E2相关因子2调控糖尿病肾脏疾病中细胞稳态的研究进展

糖尿病肾脏疾病(DKD)是糖尿病最严重的并发症之一。其发病机制尚不明确,目前认为DKD受氧化应激和炎症等多种病理生理因素影响。核因子E2相关因子2(Nrf2)是一种内源性转录因子,其转录激活可促进下游抗氧化基因及细胞保护性基因表达,参与调节多种细胞功能,维持细胞稳态,在DKD进展中发挥重要细胞保护作用。近期研究发现,Nrf2调节细胞自噬,拮抗细胞凋亡和铁死亡,是氧化应激相关疾病,炎症和自身免疫性疾病的潜在治疗靶点。本文将综述Nrf2对DKD病理过程的调控作用新进展,探讨Nrf2治疗DKD的新机制。

基于核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1信号通路延缓衰老防治绝经后骨质疏松症及药物干预的研究进展

骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是绝经后妇女常见疾病,是由于多种因素致全身骨密度下降,微结构破坏,脆性增加,而易于骨折的全身性骨病。2001年美国国立卫生研究院将其定义为以骨强度下降和骨折风险增加为特征的骨骼疾病。研究证明衰老是绝经后骨质疏松症(Post Menopausal Osteoporosis,PMOP)的重要危险因素之一,细胞衰老与机体衰老密切相关,相关研究证明过氧化氢和超氧化物等活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)是细胞衰老的重要诱因,并且自由基生物学领域的传统观点认为,ROS是氧化应激(Oxidative Stress,OS)的主要原因。目前临床工作中常用的治疗PMOP的药物如双膦酸盐、甲状旁腺激素等存在或多或少的不良反应,中医药作为中国传统文化的瑰宝,相比于PMOP的主流治疗方式具有众多的靶点、更多的有效成分,以及可以从整体观念来出发,宏观的调节身体机能,缓解该疾病导致的诸多疾病。相关研究表明核因子类红细胞2相关因子2(Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2,Nrf2)与血红素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)可以通过消除ROS及抗炎等相关作用来调控OS的损伤,因此,文章将中医基础理论与现代医学分子层面相结合,探究通过调控Nrf2/HO-1信号通路干预OS以延缓衰老来预防PMOP的相关机制。

核因子红细胞2相关因子2、低氧诱导因子-1α在食管鳞癌组织中的表达水平、临床意义及相关作用机制探讨

目的检测核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达水平并分析临床病理意义,初步探索Nrf2及HIF-1α在食管鳞癌发生发展过程中的作用机制。方法收集2010年6月~2020年8月湖北省肿瘤医院病理科食管鳞癌组织及对应癌旁组织切片各34例,采用免疫组化分析食管鳞癌组织及癌旁组织的Nrf2、HIF-1α、钙黏蛋白E(E-cadherin)及鼠双微体基因(mdm2)的阳性率。采用Graphpad Prism5.0软件分析Nrf2、HIF-1α不同的表达水平对患者术后无病进展生存期(PFS)的影响。结果Nrf2及HIF-1α在食管鳞癌组织中呈高表达并均与肿瘤浸润深度、T分期及有无淋巴结转移密切相关。Nrf2、HIF-1α及mdm2在食管鳞癌组织的表达阳性率均高于癌旁组织(P<0.05),Ecadherin在食管鳞癌组织的表达阳性率低于癌旁组织(P<0.05)。食管鳞癌组织中Nrf2的表达与HIF-1α、mdm2表达呈正相关,与E-cadherin表达呈负相关(P<0.05)。Nrf2和HIF-1α的不同表达水平患者术后PFS比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论Nrf2、HIF-1α在食管鳞癌中高表达,可能通过Nrf2/HIF-1α信号通路下调E-cadherin及上调mdm2促进食管鳞癌发生和发展。

脑胶质瘤干细胞与转录因子NF-E2相关因子2关系的研究进展

转录因子核因子红细胞2(NF-E2)相关因子2(Nrf2)在抑制肿瘤形成、神经保护和抗氧化应激反应等方面均起着重要作用,然而其在脑胶质瘤干细胞(GSC)中却呈高表达,可促进脑胶质瘤的发生发展,是导致脑胶质瘤产生化疗多药耐药和放疗抵抗的重要影响因子。本文作者对GSC的生物学特性及其与Nrf2及其信号通路之间的相互关系进行简要综述。

槲皮素预处理ALI大鼠肺组织损伤、炎症/氧化应激反应、铁死亡及Nrf2/HO-1信号通路激活情况观察

目的观察槲皮素灌胃预处理的LPS诱导急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织损伤、炎症反应、氧化应激反应、铁死亡及Nrf2/HO-1信号通路激活情况,以探讨槲皮素对ALI的预防作用及机制。方法24只SD大鼠分为槲皮素低、中、高剂量组和阳性对照组(地塞米松)、模型组、正常对照组。槲皮素低、中、高剂量组以25、50、100 mg/kg槲皮素灌胃,1次/天,连续7 d;槲皮素灌胃处理的第4天在大鼠气管内滴注5 mg/kg LPS;阳性对照组以地塞米松1.04 mg/kg灌胃,其余处理同槲皮素组;模型组以生理盐水灌胃,1次/天,连续7天,其余处理同槲皮素组;正常对照组以生理盐水连续灌胃7 d。末次灌注给药后,观察各组肺组织损伤(肺功能及肺组织病理改变、纤维组织阳性表达率、肺泡上皮细胞凋亡率)、炎症反应(肺泡灌洗液TNF-α、IL-6、IL-1β)、氧化应激反应(肺泡灌洗液SOD、GSH、MDA,肺组织ROS)、铁死亡(Fe^(2+)水平)及Nrf2/HO-1信号通路激活[肺组织核因子红细胞2相关因子2(Nfr2)、血红素加氧酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、过氧化氢酶(CAT)蛋白]情况。结果与正常对照组比较,模型组PaCO_(2)水平升高,PaO_(2)、SaO_(2)水平降低(P均<0.01);肺组织可见肺泡上皮细胞变性坏死,纤维组织阳性表达率高;肺泡上皮细胞凋亡率高;肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高,SOD、GSH水平降低,MDA水平升高,肺组织ROS表达水平升高,肺泡灌洗液中Fe^(2+)水平升高(P均<0.05)。与模型组相比,槲皮素中、高剂量组和阳性对照组中PaCO_(2)均降低(P均<0.05),槲皮素高剂量组PaO_(2)和SaO_(2)水平升高(P均<0.05);槲皮素高剂量组与阳性对照组肺组织炎性浸润与纤维增生明显减少,肺泡恢复正常生理结构;槲皮素低、中、高剂量组和阳性对照组肺纤维组织阳性表达率均下降(P均<0.05),其中槲皮素高剂量组肺纤维组织阳性表达率最低;槲皮素低、中、高剂量组和阳性对照组肺泡上皮细胞凋亡率均降低(P均<0.01);槲皮素低、中、高剂量组和阳性对照组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低、SOD、GSH水平升高、MDA水平降低,肺组织ROS表达水平降低(P均<0.01),肺泡灌洗液中Fe^(2+)水平降低。与正常对照组比较,模型组肺组织中CAT、HO-1、Nrf2、SOD2蛋白表达水平低(P均<0.01);与模型组比较,槲皮素中、高剂量组和阳性对照组肺组织中CAT、HO-1、Nrf2、SOD2蛋白表达水平高(P均<0.05)。结论槲皮素灌胃预处理的ALI大鼠肺组织损伤、炎症反应、氧化应激反应、铁死亡情况减轻,Nfr2/HO-1信号通路激活;槲皮素灌胃预处理可预防LPS诱导的大鼠ALI,可能通过抑制炎症反应、氧化应激反应及铁死亡而起作用;槲皮素可能通过上调Nfr2/HO-1信号通路而抑制炎症反应、氧化应激反应及铁死亡;50、100 mg/kg槲皮素均对LPS诱导的大鼠ALI起预防作用,以100 mg/kg槲皮素的作用效果更佳。

肾细胞癌患者血清Nrf2水平与肾切除术后肾功能下降及生存预后的关系

目的探讨肾细胞癌(RCC)患者血清核因子红细胞2-相关因子2(Nrf2)水平与肾切除术后肾功能下降及生存预后的关系。方法选取2015年3月至2020年12月在我院接受肾切除术治疗的128例RCC患者,采用ELISA法检测术前血清Nrf2水平;利用慢性肾脏病流行病学协作方程计算患者术前和术后估计肾小球滤过率(eGFR)。结果RCC患者的术前血清Nrf2水平与术后1个月eGFR变化值(ΔeGFR)及术后1年ΔeGFR呈正相关(P<0.05)。根据术前血清Nrf2中位值将患者分为低Nrf2组(<9.58 ng/ml)和高Nrf2组(≥9.58 ng/ml),高Nrf2组和低Nrf2组术后中位生存时间分别为38和49个月,总生存率分别为26.6%和60.9%;术前血清Nrf2水平升高与总生存时间缩短相关(Log Rankχ^(2)=15.334,P<0.001)。经Cox风险比例回归分析显示,世界卫生组织/国际泌尿病理学会(WHO/ISUP)分级、T分期、远处转移和术前血清Nrf2水平是肾切除术后预后较差的独立预测因子(P<0.05)。结论血清Nrf2水平升高与肾切除术后肾功能下降风险有关,且术前血清Nrf2水平升高是RCC患者术后预后较差的独立预测因子。

气-液界面染毒系统中不同暴露流量对汽油发动机尾气致肺细胞氧化应激相关蛋白表达的影响

目的采用气-液界面(air-liquid interface,ALI)培养和暴露系统,探索二轮摩托车来源的汽油发动机尾气(gasoline engine exhaust,GEE)对人肺细胞氧化应激相关蛋白表达的影响。方法实验分为空白对照组、洁净空气组、GEE组。除了空白对照组,其余各组采用气-液界面体外染毒技术,分别在暴露流量为10、15和25 mL/min,37℃水浴条件下,对生长在气-液界面插件多孔膜上的人支气管上皮细胞BEAS-2B和人肺癌A549细胞持续暴露60 min。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法评价细胞相对存活率。采用2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-dichloro-dihydro-fluoresceindiacetate,DCFH-DA)探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测GEE对BEAS-2B和A549细胞凋亡及坏死率的影响。蛋白质免疫印迹法检测全细胞裂解物中核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)和血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达水平。结果在10、15和25 mL/min三种暴露流量下,随着暴露流量增大,GEE暴露组的2种细胞相对存活率逐渐降低、胞内ROS生成量和细胞凋亡率逐渐升高,且与洁净空气组相比,存在统计学上的显著性差异(P<0.05)。BEAS-2B和A549细胞相对存活率、胞内活性氧水平、早期凋亡率、晚期凋亡及坏死率和总凋亡率在GEE暴露和暴露流量上存在主效应,且GEE暴露与暴露流量存在交互效应(P<0.01)。在GEE暴露组,BEAS-2B细胞Nrf2和HO-1蛋白表达下降,A549细胞Nrf2和HO-1蛋白表达水平升高。BEAS-2B细胞Nrf2蛋白表达仅在暴露流量主效应上差异有统计学意义(P<0.01)。BEAS-2B细胞HO-1蛋白表达仅在GEE主效应上差异有统计学意义(P<0.01)。A549细胞Nrf2蛋白表达在GEE主效应、暴露流量主效应和交互效应上差异均有统计学意义(P<0.05)。A549细胞HO-1蛋白表达则在GEE主效应、暴露流量主效应和交互效应上差异均无统计学意义(P>0.05)。结论GEE对肺细胞具有较强的急性毒性作用;GEE诱导的细胞存活率、胞内活性氧生成和细胞凋亡率的改变受暴露流量的显著影响。暴露流量对GEE诱导的BEAS-2B和A549细胞Nrf2蛋白表达的影响显著,而对HO-1蛋白表达影响不显著。

丹酚酸B对2型糖尿病小鼠心肌病氧化应激的作用及机制

目的探讨丹酚酸B(Sal B)对2型糖尿病小鼠心肌病(DCM)氧化应激的作用及潜在机制。方法60只C57BL/6J小鼠分为空白组(n=12,Control组,正常饲料,灌胃生理盐水)和高脂高糖(HG)组[n=48,HFG组,链脲佐菌素(STZ)联合HFG饲料构建DCM模型],造模成功的HFG组小鼠分为DCM组(灌胃生理盐水)、Sal B低剂量[1.50 mg/(kg·d)]组(Sal B.L组)、Sal B高剂量[3.00 mg/(kg·d)]组(Sal B.H组)及200 mg/(kg·d)二甲双胍治疗组(Metformin组),灌胃连续8周;麻醉各组小鼠,采用小动物超声仪检测仰卧位时各组小鼠心脏的左室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS)、左室收缩末期容积(LVESV)及左室收缩期末期内径(LVIDs);处死各组小鼠,取心脏制作切片、苏木素-伊红(HE)和Masson染色观察心肌组织形态学特征;采用试剂盒检测各组小鼠心肌组织中细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽(GSH)的水平,采用Western blot分析氧化应激蛋白Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)、核因子-E2相关因子2(Nrf2)、磷酸化Nrf2(pNrf2)、过氧化物酶1(PRDX1)、血红素加氧酶1(HO-1)及凋亡相关蛋白活化的半胱氨酸蛋白(Cleaved-caspase3)、B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl2)、Bcl2关联X(bax)蛋白的表达;SD乳鼠心脏提取分离培养原代新生大鼠心肌细胞(PNRCMs)构建DCM体外模型,将PNRCMs分为40 mmol/L甘露醇(Mannitol)组、空白(Control)组、40 mmol/L HG(HG)组、40 mmol/L HG+25μmol/L Sal B(Sal B低剂量,Sal B.L)组、40 mmol/L HG+50μmol/L Sal B(Sal B高剂量,Sal B.H)组、40 mmol/L HG+0.25 mmol/L二甲双胍(Metformin)组,检测各组细胞的活性氧(ROS)、MDA、SOD及GSH水平,采用Western blot检测氧化应激蛋白Keap1、Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、bax、Bcl2蛋白的表达;采用实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测氧化应激相关基因Keap1、Nrf2、PRDX1及HO-1信使RNA(mRNA)的表达;采用Nrf2抑制剂(ML385)和激动剂(甲基巴多索隆)进一步分析氧化应激蛋白Keap1、Nrf2、pNrf2、PRDX1及HO-1的表达。结果与Control组比较,DCM组小鼠的LVEF、FS降低(P<0.01),LVESV、LVIDs升高(P<0.01),心肌组织排列紊乱、间质细胞增多并伴有炎性细胞浸润及胶原沉积,心肌组织中MDA含量增加、SOD和GSH减少(P<0.01),心肌组织中Keap1、Cleaved-caspase3及bax蛋白表达上调,Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及Bcl2蛋白表达下调(P<0.01);与Control组比较,HG组心肌细胞中ROS表达增加,SOD表达下降(P<0.05),MDA含量增加、GSH表达下降(P<0.01),心肌细胞中的Keap1、Cleaved-caspase3及bax蛋白表达增加(P<0.01),Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及Bcl2蛋白表达下降(P<0.01),心肌细胞中的Keap1 mRNA表达升高(P<0.05),Nrf2、PRDX1及HO-1 mRNA表达降低(P<0.05);与DCM组比,Sal B.L和Sal B.H组小鼠的LVEF、FS增加(P<0.01)、LVESV、LVIDs降低(P<0.01),心肌组织排列整齐、炎性细胞浸润减少、心肌胶原沉积减少,心肌组织中MDA含量减少、SOD和GSH含量增加(P<0.01),心肌组织中Keap1、Cleaved-caspase3及bax表达下调,Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及Bcl2蛋白表达上调(P<0.05);与HG组相比,Sal B.L和Sal B.H量组心肌细胞中ROS表达、MDA含量减少,SOD和GSH含量增加(P<0.05),心肌细胞中的Keap1、Cleaved-caspase3及bax蛋白表达减少(P<0.05),Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及Bcl2表达增加(P<0.05);心肌细胞中的Keap1 mRNA表达降低(P<0.05),Nrf2、PRDX1和HO-1 mRNA表达升高(P<0.05);进一步采用Nrf2抑制剂ML385和激动剂甲基巴多索隆干预,与HG组相比,Sal B.H组心肌细胞中的Nrf2、pNrf2、PRDX1及HO-1表达增加(P<0.05);与Sal B.H组相比,ML385和Sal B联用组心肌细胞中的Nrf2、pNrf2、PRDX1及HO-1的表达减少(P<0.05)。结论Sal B可降低2型糖尿病小鼠DCM的氧化应激作用,其机制与Keap1/Nrf2信号通路蛋白的表达有关。

紫草素调节Nrf2/HO-1信号通路对实验性大鼠肉芽肿性小叶性乳腺炎的治疗作用研究

目的探究紫草素(Shikonin,SHI)通过调节核因子-红细胞2型相关因子2/血红素加氧酶(Nrf2/HO-1)信号通路对肉芽肿性小叶性乳腺炎模型大鼠的影响及作用机制。方法建立肉芽肿性小叶性乳腺炎(GLM)大鼠模型,将大鼠分为对照组(Control组)、模型组(GLM组)、紫草素低剂量组(SHI-L组,17.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)SHI)、紫草素中剂量组(SHI-M组,35 mg·kg^(-1)·d^(-1)SHI)、紫草素高剂量组(SHI-H组,70mg·kg^(-1)·d^(-1)SHI)和紫草素高剂量+Nrf2抑制剂ML385组(SHI-H+ML385组,70 mg·kg^(-1)·d^(-1)SHI+14 mg·kg^(-1)·d^(-1)ML385)。HE染色观察乳腺组织病理变化情况;ELISA检测乳腺组织中IL-1β、TNF-α、IL-8、T-AOC、SOD、GSH、MPO、NAGase和ROS水平;免疫荧光检测NLRP3表达;Western blotting检测Nrf2和HO-1蛋白表达。结果与Control组相比,GLM组大鼠乳腺小叶完全被破坏、大片结节样慢性肉芽肿炎性病灶生成,乳腺小叶组织边界不清,腺叶内出现空泡,伴有大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润;IL-8、IL-1β、TNF-α、ROS、MPO和NAGase水平、NLRP3阳性表达率显著增加(P<0.05),T-AOC、SOD和GSH水平、Nrf2和HO-1蛋白表达显著降低(P<0.05)。与GLM组相比,SHI-L组、SHI-M组和SHI-H组乳腺组织病变逐渐减轻;IL-8、IL-1β、TNF-α、ROS、MPO和NAGase水平、NLRP3阳性表达率依次降低(P<0.05),T-AOC、SOD和GSH水平、Nrf2和HO-1蛋白表达依次升高(P<0.05)。与SHI-H组相比,SHI-H+ML385组乳腺组织病变加重;IL-8、IL-1β、TNF-α、ROS、MPO和NAGase水平、NLRP3阳性表达率显著增加(P<0.05),T-AOC、SOD和GSH水平、Nrf2和HO-1蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论紫草素发挥抗炎抗氧化作用改善大鼠肉芽肿性小叶性乳腺炎,其机制可能与激活Nrf2信号通路,上调HO-1表达有关。

电针激活Nrf2/γ-GCS通路改善大鼠脑出血急性期脑损伤的研究

研究电针对大鼠脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)急性期的保护作用,及其与核因子红细胞相关因子2/γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Nrf2/γ-GCS)信号通路活性的相关性。方法:50只SD大鼠随机分为5组(n=10):假手术组、3 d模型组、3 d电针组、7 d模型组和7 d电针组。除假手术组外均采用脑内注射自体血建立大鼠ICH模型,电针组分别电针连续治疗3 d、7 d,采用Zea-longa评分、改良神经严重程度评分(mNSS)和旷场试验(OFT)评价各组大鼠神经功能。流式细胞术检测组织活性氧(ROS)水平。通过酶联免疫吸附测定分析组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。Western blot检测组织Nrf2、γ-GCS蛋白表达。采用免疫组织化学方法观察小胶质细胞的激活水平。结果:与假手术组比较,3 d和7 d模型组Zea-longa和mNSS评分、静止时间、ROS水平、TNF-a水平、Nrf2和γ-GCS蛋白表达、小胶质细胞激活水平均增加,总路程和运动速度均减少(P<0.05)。与3 d模型组对比,7 d模型组的Zea-longa评分、mNSS、ROS水平、TNF-a水平、Nrf2和γ-GCS蛋白表达、小胶质细胞激活水平均增加(P<0.05),提示ICH急性期进展;3 d电针组组织Nrf2和γ-GCS蛋白表达水平高于3 d模型组,ROS水平、TNF-a水平和小胶质细胞激活水平低于3 d模型组(P<0.05)。与7 d模型组对比,7 d电针组的Zea-longa和mNSS评分、静止时间、ROS水平、TNF-a水平、小胶质细胞激活水平均下降,Nrf2和γ-GCS蛋白表达、总路程和运动速度均增加(P<0.05)。结论:电针可能通过激活Nrf2/γ-GCS信号通路,抑制小胶质细胞激活发挥抗氧化应激作用,进而改善大鼠ICH急性期脑损伤。

毛蕊花糖苷抑制Erastin诱导的多巴胺能神经细胞系MN9D细胞铁死亡

背景:近年越来越多的研究证实多巴胺能神经元细胞铁死亡参与了帕金森病的发病,毛蕊花糖苷目前被证实具有抗氧化、抗炎和神经保护作用。目的:探讨毛蕊花糖苷对Erastin诱导的MN9D细胞铁死亡的保护效果及作用机制。方法:以MN9D细胞为研究对象,分为对照组、模型组(20μmol/L Erastin组)、Erastin+1μg/mL毛蕊花糖苷组、Erastin+5μg/mL毛蕊花糖苷组、Erastin+10μg/mL毛蕊花糖苷组。MN9D细胞在CO_(2)恒温培养箱中培养24 h,然后用不同质量浓度毛蕊花糖苷预处理8 h,再加入20μmol/L Erastin诱导24 h后,采用ELISA法检测还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、总铁离子、丙二醛水平,免疫组织化学法检测酪氨酸羟化酶的表达,Western blot法检测酪氨酸羟化酶、核因子红细胞-2相关因子2、血红素加氧酶1、谷胱甘肽过氧化物酶4蛋白表达。结果与结论:(1)与对照组相比,模型组还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶水平明显减少(P<0.05),丙二醛和总铁离子水平明显增加(P<0.05);与模型组相比,毛蕊花糖苷1,5,10μg/mL组还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶水平明显增加(P<0.05),丙二醛和总铁离子水平明减少(P<0.05);(2)与对照组相比,模型组酪氨酸羟化酶阳性细胞面积明显减少(P<0.05);与模型组相比,毛蕊花糖苷1,5,10μg/mL组酪氨酸羟化酶阳性细胞面积明显增加(P<0.05);(3)与对照组相比,模型组酪氨酸羟化酶、核因子红细胞-2相关因子2、血红素加氧酶1、谷胱甘肽过氧化物酶4的蛋白表达明显减少(P<0.05);与模型组相比,毛蕊花糖苷1,5,10μg/mL组酪氨酸羟化酶、核因子红细胞-2相关因子2、血红素加氧酶1、谷胱甘肽过氧化物酶4的蛋白表达明显增加(P<0.05)。结果提示:毛蕊花糖苷对Erastin诱导的MN9D细胞铁死亡具有明显的抑制作用,其机制可能通过作用于核因子红细胞-2相关因子2/血红素加氧酶1/谷胱甘肽过氧化物酶4通路实现的。

Nrf2基因编辑小鼠模型的构建

目的:构建核因子-红细胞2相关因子2(Nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)全身性敲除(Nrf2-KO)、心肌细胞特异性敲除(Nrf2-Flox)和心肌细胞过表达(Nrf2-CTG)3种基因编辑小鼠,为探究Nrf2在心血管代谢性疾病中的具体作用机制提供研究工具。方法:利用CRISPR/Cas9技术构建Nrf2-KO小鼠和Nrf2-Flox小鼠,利用转基因技术构建Nrf2-CTG小鼠。基因编辑小鼠7~10日龄时剪脚趾组织提取DNA,用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因型判定并测序。结果:⑴Nrf2-KO F0代、F1代和F2代小鼠基因组扩展样本在目的条带处(约750 bp)均有清晰单一的阳性条带,野生型小鼠在目的条带处(约2931 bp)有阳性条带;采用Nrf2-wt-F1/Nrf2-wt-R1引物对F2代小鼠基因组野生型小鼠在目的条带处(约495 bp)有阳性条带,Nrf2-KO鼠无该目的条带。F0代小鼠基因组缺失碱基为Founder小鼠敲除的碱基;⑵Nrf2-Flox F0代、F1代小鼠基因组扩展样本在目的条带处(约150 bp)均有清晰单一的阳性条带。野生型小鼠无该目的条带;⑶Nrf2-CTG F0代、F1代鼠基因组扩展样本在目的条带处(约251 bp)均有清晰单一的阳性条带,野生型小鼠无该目的条带。结论:利用CRISPR/Cas9技术和转基因技术成功构建Nrf2-KO小鼠模型、Nrf2-Flox小鼠模型及Nrf2-CTG小鼠模型。

茯苓酸调节Nrf2/Keap1/ARE信号通路改善脂多糖诱导肺泡上皮细胞氧化应激损伤研究

目的:研究茯苓酸(PA)对脂多糖(LPS)诱导的人肺泡上皮细胞氧化应激损伤的影响,以及核因子红细胞2相关因子2/Kelch样ECH关联蛋白1/抗氧化反应元件(Nrf2/Keap1/ARE)信号通路在此过程中的作用。方法:培养人肺泡上皮细胞HPAEpiC,使用CCK-8法筛选适合的PA处理浓度。将HPAEpiC细胞分为Control组、LPS组、LPS+PA组、LPS+PA+sh-NC组和LPS+PA+sh-Nrf2组。TUNEL染色法检测各组HPAEpiC细胞凋亡情况;检测各组HPAEpiC细胞中活性氧(ROS)的产生、丙二醛(MDA)水平以及总超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;Western blot检测各组HPAEpiC细胞中p53、B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白(Bax)、Nrf2、Keap1和血红素氧化酶1(HO-1)蛋白表达情况。结果:根据CCK-8结果选用4μmol·L^(-1)的PA用于后续研究。LPS诱导后HPAEpiC细胞中TUNEL阳性细胞率与p53和Bax蛋白水平均升高;ROS的产生、MDA水平均增高,SOD和GSH-Px活性降低;Nrf2、HO-1蛋白质水平减少,Keap1蛋白质水平增加(P<0.05)。使用PA处理可以减轻LPS诱导对以上指标的影响(P<0.05)。敲低Nrf2可部分逆转PA处理对LPS诱导的HPAEpiC细胞的影响(P<0.05)。结论:PA可抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞氧化应激损伤和凋亡反应,其机制可能与激活Nrf2/Keap1/ARE信号通路有关。

益肾通癃汤对前列腺癌裸鼠模型Nrf-2、SOD1的影响

目的:探讨益肾通癃汤对前列腺癌(prostate cancer,PCa)裸鼠模型核因子红细胞2相关因子2(Nrf-2)和超氧化物歧化酶1(SOD1)的影响。方法:SPF级雄性裸鼠接种PC-3细胞悬液,造模成功后随机分为模型组,益肾通癃汤低、中、高剂量组。模型组灌胃生理盐水[1 mL/(100 g·d)],益肾通癃汤各剂量组分别采用0.72、1.44、2.88 g/mL的益肾通癃汤灌胃[1 mL/(100 g·d)],灌胃21 d后处死裸鼠,称取瘤体质量计算抑瘤率,镜下观察病理改变,ELISA检测Nrf-2、SOD1表达量,WB(Western blot)、RTPCR检测Nrf-2、SOD1蛋白及mRNA表达。结果:与模型组比较,益肾通癃汤各剂量组抑瘤率升高(P <0.05,P <0.01),镜下观察细胞核裂解明显,可下调Nrf-2、SOD1蛋白及mRNA的表达(P <0.05,P <0.01);上述结果均呈浓度依赖性。结论:益肾通癃汤可能是通过抑制Nrf-2、SOD1的表达,诱导癌细胞氧化应激反应,达到对PCa的治疗作用。

耐药肝癌细胞p62表达与顺铂敏感性的关系

目的观察顺铂耐药的肝癌细胞中p62的表达情况,及p62基因沉默后耐药肝癌细胞对顺铂敏感性的变化。方法培养肝癌亲本细胞Hep G2、Huh7,通过浓度梯度法建立顺铂耐药细胞模型,采用Western blotting法检测亲本Hep G2、Huh7细胞和耐药Hep G2、Huh7细胞中的p62蛋白。将耐药Hep G2、Huh7细胞分为沉默组和耐药组,分别转染p62 siRNA和siRNA Negative Control。在转染48 h后的0、1、2、3、4、5 d测算沉默组和耐药组细胞存活率。转染后48 h进行Hochest 33258染色观察沉默组和耐药组细胞凋亡核形态、计数凋亡细胞,采用Annexin VFITC/PI流式细胞术测算细胞凋亡率。转染后48 h采用Western blotting法检测沉默组与耐药组细胞中的核因子红细胞前体2相关因子2(Nrf2),RT-PCR法检测Nrf2蛋白下游的谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCL)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、NADP(H)醌氧化还原酶(NQO1)、血红素氧化酶1(HO-1)、多药耐药蛋白(Mrp)基因。结果耐药的Hep G2、Huh7细胞中p62蛋白相对表达量分别高于亲本Hep G2、Huh7细胞(P均<0.05)。转染48 h后的0、1、2、3、4、5 d沉默组Hep G2、Huh7细胞存活率低于耐药组(P均<0.05)。沉默组凋亡细胞数及凋亡率均高于耐药组(P均<0.05)。沉默组细胞中Nrf2蛋白及NQO1、GCL、GST、HO-1、Mrp mRNA相对表达量均低于耐药组(P均<0.05)。结论顺铂耐药的肝癌细胞中p62蛋白表达上调;p62基因沉默后耐药肝癌细胞对顺铂的敏感性增强,其机制可能与Nrf2及其下游基因表达下调有关。

血清Nrf2和TIMP3水平在川崎病早期诊断及预后中的意义

目的探讨血清核因子红细胞2相关因子(Nrf2)和组织抑制剂金属蛋白酶3(TIMP3)表达在川崎病(KD)早期诊断及预后中的意义。方法选取2019年9月至2021年9月我院收治的KD患儿84例为研究对象(KD组),另选取同期我院体检中心进行体检的健康儿童84例作为对照组,其中KD组根据患儿预后情况又分为冠状动脉病变(CAL)组(18例)及无CAL组(66例),收集基本资料及实验室指标。酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清Nrf2和TIMP3水平;相关性分析采用Pearson法;绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清Nrf2和TIMP3水平预测KD及CAL的价值。结果KD组血清Nrf2和TIMP3水平显著低于对照组,血小板计数(PLT)、白细胞介素-6(IL-6)、血沉(ESR)及氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)水平均显著高于对照组(P<0.05);KD患儿血清Nrf2与IL-6、NT-proBNP均呈负相关(r=-0.512、-0.530,P<0.05),血清TIMP3与IL-6、NT-proBNP均呈负相关(r=-0.465、-0.482,P<0.05);ROC曲线显示,Nrf2诊断KD的AUC为0.769,截断值为789.85 U/L,其敏感度、特异度分别为79.76%、67.86%,TIMP3诊断KD的AUC为0.790,截断值为147.76 pg/ml,其敏感度、特异度分别为65.48%、79.76%,二者联合诊断KD的AUC为0.857,明显高于二者单独诊断(Z_(联合vs.Nrf2)=2.951、P=0.003,Z_(联合vs.TIMP3)=2.658、P=0.008)。CAL组血清Nrf2和TIMP3显著低于无CAL组,IL-6、ESR及NT-proBNP水平均显著高于无CAL组(P<0.05);ROC曲线显示,Nrf2预测CAL的AUC为0.812,截断值为634.12 U/L,其敏感度、特异度分别为94.44%、62.12%,TIMP3预测CAL的AUC为0.736,截断值为127.71 pg/ml,其敏感度、特异度分别为94.44%、48.48%,二者联合预测CAL的AUC为0.889,明显高于二者单独预测(Z_(联合vs.Nrf2)=2.254、P=0.024,Z_(联合vs.TIMP3)=2.724、P=0.006)。结论KD患儿血清Nrf2、TIMP3低表达,二者联合用于KD诊断及预后均有一定价值。

基于Nrf2/CYP2E1通路探讨刺梨多糖对酒精性肝损伤小鼠的保护机制

目的探讨刺梨多糖(Rosa roxburghii polysaccharide,RP)对食用酒精诱导的酒精中毒小鼠肝脏的影响及保护机制。方法采用热水浸提法制得纯度为64%的RP。将60只健康KM雄性小鼠分为空白组、模型组、阳性组、RP低、中、高剂量组,连续给药15 d,于末次给药4 h后,除空白组外,其余各组一次性灌胃16 mL/kg 50%的食用酒精建立酒精性肝损伤(alcoholic liver injury,ALI)小鼠模型;解剖后记录脏器质量,测定血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)含量,测定肝脏氧化应激指标含量、核因子-红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信号通路相关蛋白表达量及细胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)蛋白表达量,并进行肝脏病理和肝细胞凋亡观察。结果与模型组相比,RP各剂量组均能降低肝脏指数、血清中ALT、AST、血脂指标TC、TG含量、肝脏丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量,提高谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量,上调Nrf2、血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase-1,SOD-1)蛋白表达量,下调CYP2E1蛋白表达量,并改善肝脏病变和肝细胞凋亡情况。结论RP对ALI小鼠起到良好的护肝效果,这可能与调控Nrf2信号通路起到抗氧化作用及调节脂质代谢有关。

泽泻提取物改善游离脂肪酸诱导的HepG2脂肪变性细胞模型的脂质代谢及氧化应激异常

目的研究泽泻提取物(Alisma orientale extract,AE)及其3种主要单体成分对游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)诱导的HepG2脂肪变性细胞模型的脂质代谢及氧化应激异常的改善作用及机制。方法利用FFA(油酸-棕榈酸2∶1)建立稳定的HepG2脂肪变性细胞模型,CCK-8法测定AE、泽泻醇A、泽泻醇A-23-乙酸酯及泽泻醇A-24-乙酸酯对HepG2细胞的安全剂量;在FFA诱导同时给予AE(25.00、12.50、6.25 mg/L)、泽泻醇A(50.0、25.0、12.5μmol/L)、泽泻醇A-23-乙酸酯(25.00、12.50、6.25μmol/L)、泽泻醇A-24-乙酸酯(50.0、25.0、12.5μmol/L)处理24 h,检测细胞内脂滴的形成情况,利用生化试剂盒测定各组细胞内三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)水平,DCFH-DA检测药物对细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的影响,采用试剂盒检测细胞内氧化应激关键指标丙二醛(malondialdehyde,MDA)、总谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;采用Western blotting检测过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)、PPAR共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α)、下游脂肪酸氧化和胆固醇代谢相关蛋白及核因子红细胞2相关因子2/血红素加氧酶-1(nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2/hemeoxygenase-1,Nrf2/HO1)通路蛋白表达。结果与对照组比较,HepG2脂肪变性细胞模型细胞内TC、TG、ROS及MDA水平显著升高(P<0.001),SOD活性及GSH水平降低(P<0.01、0.001);同时,细胞中PPARα、PGC-1α、肉碱棕榈酰转移酶1A(carnitine palmitoyl transferase 1A,CPT1A)、酰基辅酶A氧化酶1(acyl coenzyme A oxidase 1,ACOX1)、Nrf2及HO-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05、0.01、0.001)。与模型组比较,AE、泽泻醇A及泽泻醇A-23-乙酸酯给药组细胞内脂滴、TG和TC水平显著下降(P<0.05、0.01、0.001),AE、泽泻醇A及泽泻醇A-24-乙酸酯给药组细胞内ROS及MDA水平均显著降低(P<0.05、0.001),SOD活性和GSH水平显著升高(P<0.05、0.01);各给药组细胞中PPARα、PGC-1α、CPT1A、ACOX1、细胞色素P450酶7A1(cytochrome P450 enzyme 7A1,CYP7A1)、Nrf2及HO-1蛋白表达水平显著上调(P<0.05、0.01)。结论AE、泽泻醇A、泽泻醇A-23-乙酸酯及泽泻醇A-24-乙酸酯可以改善FFA诱导的HepG2脂肪变性细胞模型的脂质代谢及氧化应激异常,其机制可能是通过调控PPARα和Nrf2/HO-1通路,进而促进脂肪酸氧化及胆固醇代谢,抑制氧化应激。