核因子-κB寡脱氧核苷酸策略对胶原诱导关节炎大鼠细胞因子调节研究

目的:探讨核因子-κB(NF-KB)寡脱氧核苷酸(ODN)局部应用对Ⅱ型胶原诱导关节炎(CIA)大鼠的治疗作用及机制。方法:建立Ⅱ型CIA大鼠模型,用NF-κB圈套ODN注射到大鼠右后踝关节腔内,并设空白对照组、CIA模型组和实验组。42 d后观察各组关节炎指数、病理指标,采用酶联免疫吸附试验法检测各组大鼠血清和关节液中白细胞介素(IL)-17、IL-12和转化生长因子-β(TGF-β)的水平。结果:与空白对照组比较,CIA模型组大鼠血清和关节液中IL-17和IL-12水平均明显升高,而TGF-β水平显著降低(P<0.01),而实验组经NF-κB圈套ODN注射后,与CIA模型组比较,血清和关节液中IL-17和IL-12水平均明显降低,而TGF-β水平显著升高(P<0.01)。结论:NF-κB圈套ODN明显抑制CIA大鼠外周血和关节液中IL-17、IL-12的产生,促进TGF-β水平的增加,对CIA有较好的治疗作用。

血管内皮生长因子反义寡脱氧核苷酸联合血管生成素-1对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜血管渗漏及新生血管生成的影响

目的观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)反义寡脱氧核苷酸(ASODN)联合血管生成素-1(angiogenin-1,Ang-1)对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜血管渗漏及新生血管生成的影响。方法选取健康雄性SD大鼠60只,随机分为正常对照组(A组)5只和糖尿病组55只,糖尿病组通过链脲佐菌素腹腔注射诱导糖尿病模型成功后再饲养3个月行眼底荧光血管造影检查,确定DR大鼠模型且视网膜病变程度相仿的大鼠,随机抽取45只分为DR对照组(B组,5只)、PBS缓冲液对照组(C组,10只)、VEGFASODN干预组(D组,10只)、Ang-1干预组(E组,10只)、联合干预组(F组,10只)。C组玻璃体内注射PBS缓冲液5μL;D组玻璃体内注射浓度为100μmol·L-1VEGFASODN5μL;E组玻璃体内注射浓度为160mg·L-1Ang-15μL;F组玻璃体内注射100μmol·L-1VEGFASODN及160mg·L-1Ang-1各5μL;3d后再次行上述操作。各组大鼠行眼底荧光血管造影检查,对比观察不同组别大鼠视网膜血管渗漏情况,病理组织切片光学显微镜下突破内界膜的观察视网膜新生血管芽细胞核数。结果 A、B、C、D、E和F组视网膜新生血管渗漏面积分别为0、(20.98±1.14)mm2、(21.47±1.65)mm2、(14.60±1.55)mm2、(13.80±1.19)mm2、(10.81±1.35)mm2;D、E、F组新生血管渗漏面积低于B、C组,差异有统计学意义(F=103.99,P<0.05);F组渗漏面积低于D、E组,差异有统计学意义(F=190.94,P<0.05);B组与C组之间差异无统计学意义(t=0.22,P>0.05)。A、B、C、D、E和F组突破内界膜的新生血管芽细胞核数分别为(1.13±0.31)个、(80.31±5.21)个、(81.08±2.57)个、(37.37±3.41)个、(41.07±2.09)个、(14.41±1.23)个;D、E、F组突破内界膜的血管芽细胞核数均低于B、C组,差异有统计学意义(F=1339.41,P<0.05);F组突破内界膜的血管芽细胞核数低于D、E组,差异有统计学意义(F=714.91,P<0.05);B组与C组之间差异无统计学意义(t=0.35,P>0.05)。结论 VEGF ASODN联合Ang-1玻璃体内注射能明显抑DR大鼠视网膜新生血管的生成,减少视网膜血管渗漏。

NF-κB圈套寡脱氧核苷酸联合紫杉醇对肺癌血管生成的影响

目的探讨NF-κB圈套寡脱氧核苷酸技术(NF-κB decoy ODN)联合紫杉醇对肺癌血管生成的影响。方法培养人肺癌细胞A549:(1)用脂质体瞬时转染法介导NF-κB全硫代圈套寡核苷酸(decoy ODN)和全硫代错义圈套寡核苷酸(scramble decoy ODN)处理A549细胞;(2)分为对照组、NF-κB decoy ODN组、紫杉醇组(1 000 ng/mL)和NF-κB decoy ODN+紫杉醇组,RT-PCR法测COX-2 mRNA水平表达;(3)免疫组织化学法测VEGF蛋白表达。结果 NF-κB decoy ODN、紫杉醇干预后A549细胞的COX-2 mRNA水平表达下降,对照组、NF-κB decoy ODN组、紫杉醇组、NF-κB decoy ODN+紫杉醇组浓度依次是:(0.71±0.04)μg/μL、(0.44±0.08)μg/μL、(0.51±0.02)μg/μL、(0.34±0.05)μg/μL(P<0.05)。VEGF蛋白表达亦下降,各组细胞阳性率依次是:(85±0.50)%、(63±0.26)%、(57±1.5)%、(21±0.34)%(P<0.05)。结论 NF-κB decoy ODN联合紫杉醇可明显抑制肺癌细胞血管生成,该作用可能与COX-2、VEGF表达相关。

NF-κB圈套寡脱氧核苷酸技术的发展和应用

NF κB是一种重要的核转录因子 ,可被多种刺激因素激活 ,并转位至细胞核 ,与相应的靶基因结合 ,启动基因转录。NF κB的靶基因包括编码细胞因子、粘附分子、诱导型一氧化氮合酶等的基因 ,因此与多种炎性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的发生有关。人工合成的双链NF κB圈套寡脱氧核苷酸含有NF κB结合位点 ,可与游离的NF κB结合 ,从而圈套了NF κB ,阻止其活化。NF κB圈套寡脱氧核苷酸已成功用于多种疾病的发病机制及治疗学研究 。

早期生长反应因子-1诱骗寡脱氧核苷酸对大鼠球囊损伤后细胞黏附分子-1的影响

目的观察局部转染早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)的诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotides,decoy ODNs)对球囊损伤颈总动脉后内膜增生及细胞内细胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的影响,并初步探讨Egr-1 decoy ODNs抑制球囊损伤后内膜增生的机制。方法 96只健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯损伤组、杂码寡脱氧核苷酸(scrambled decoy ODNs,SCR)组和Egr-1 decoy ODNs组,每组24只。术后3、7、14及21 d处死动物,每组6只。应用HE染色、Real time RT-PCR和Western-blotting方法观察大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生情况、Egr-1和ICAM-1的表达及Egr-1 decoy ODNs对它们的影响。结果①内皮损伤后3 d内膜增厚不明显,7d内膜开始增厚,14 d和21 d时内膜明显增厚。②Egr-1mRNA和蛋白水平于术后3 d开始升高,21 d时达到顶峰,而ICAM-1的mRNA和蛋白水平均于术后3 d开始升高,7 d达高峰,14 d时下降。③转染Egr-1 decoyODNs治疗后,在各个时间点内膜增厚程度减轻,Egr-1和ICAM-1表达减少,与假手术组比较差异有统计学意义P<0.01)。结论 Egr-1 decoy ODNs可能是通过特异性抑制Egr-1的表达,进而抑制ICAM-1的表达,从而减轻血管损伤后内膜增生。

核因子-κB p65反义寡核苷酸对溃疡性结肠炎肠黏膜单个核细胞细胞因子表达的影响

探讨 NF- κB p6 5反义寡核苷酸对溃疡性结肠炎肠黏膜单个核细胞 NF- κB p6 5的表达以及对细胞因子释放的影响。3例溃疡性结肠炎患者 (未用过任何与溃疡性结肠炎治疗相关的药物 ,符合 1993年太原会议溃疡性结肠炎诊断标准 )的活检组织被用于固有层单个核细胞 (L PMC)的分离和培养 ,并用 NF- κB p6 5反义寡核苷酸 (A-SON:5 '- GGAACAGTTCGTCCATGG- 3')及错义寡核苷酸 (MSON:5 '- GGAACAGTTCGTCTATGG- 3')和地塞米松 (EDX)进行干预。采用 :1Western蛋白印迹分析检测 NF-κB p6 5蛋白表达情况 ;2逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)检测 IL- 1βm RNA和 IL- 8m RNA的表达 ;3酶联免疫吸附试验 (EL ISA)测定 IL- 1β,IL- 8的分泌水平。结果显示 ,NF-κB p6 5反义寡核苷酸可明显减少 L PMC的 NF-κB p6 5表达 ,阻断 L PS刺激引起的 IL - 1βm RNA和 IL -8m RNA的表达的增强以及两种细胞因子分泌水平均的增高 ,其作用明显强于地塞米松 (P<0 .0 5 )。结论认为 :NF-κB p6 5反义寡核苷酸有可能作为治疗溃疡性结肠炎的新基因药物 。

核因子-κB圈套寡核苷酸转染对小鼠成熟树突状细胞生物学特性的影响

目的探讨核因子κB圈套寡核苷酸(NF-κBdecoyODN)转染对小鼠成熟树突状细胞(DCs)生物学特性的影响。方法体外诱导Balb/c小鼠骨髓细胞生成未成熟DCs(imDCs),经抗原OVA以及LPS孵育后成为OVA冲击的骨髓来源成熟DCs(mDCs),流式细胞仪检测DCs表面分子CD11c以及MHC-Ⅱ的表达予以鉴定;将NF-κBdecoyODN体外转染小鼠骨髓来源成熟DCs,同时设立阴性对照组(转染NF-κB"变异"ODN)以及未转染组,EMSA检测转染后NF-κB的活性变化;流式细胞仪检测各组DCs表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)的表达;混合淋巴细胞反应观察各组DCs对OVA致敏的T淋巴细胞增殖的影响。结果成功培养出骨髓来源成熟DCs;NF-κBdecoyODN转染DCs的NF-κB活性明显降低(P<0.05),DCs表面CD40、CD80共刺激分子的表达与阴性对照组、未转染组比较无明显改变(P>0.05),而CD86的表达与其他各组比较明显降低(P<0.05);在混合淋巴细胞反应中,NF-κBdecoyODN转染DCs对T细胞的增殖有抑制作用(P<0.05),而阴性对照组与未转染组的DCs具有强烈的激发T细胞增殖的能力(P<0.05)。结论NF-κBdecoyODN转染DCs可能通过CD86的表达降低显著抑制抗原特异性T细胞活化,该改良的DCs有可能用于哮喘的免疫治疗。

非酒精性脂肪性肝病合并2型糖尿病患者血清同型半胱氨酸、成纤维细胞生长因子21和核因子-κB水平变化及其临床意义探讨

目的 探讨非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)合并2型糖尿病(T2DM)患者血清同型半胱氨酸(HCY)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)和核因子-κB(NF-κB)水平变化及其临床意义。方法 2020年5月~2022年3月我院诊治的192例NAFLD和106例NAFLD合并T2DM患者【单纯性脂肪肝(SFL)76例,非酒精性脂肪性肝炎(NASH)21例,肝硬化9例】,采用ELISA法检测血清HCY、FGF21和NF-κB水平,使用FibroTouch行肝脏硬度检测(LSM)发现肝纤维化S0~S1期75例,S2~S4期31例。结果 NAFLD合并T2DM组血清低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹血糖(FPG)和糖化血红蛋白(HbA1c)水平分别为(3.9±0.7)mmol/L、(8.6±1.3)mmol/L和(8.1±1.7)%,均显著高于NAFLD组【分别为(3.1±0.6)mmol/L、(5.2±1.1)mmol/L和(5.7±1.0)%,P<0.05】,而血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平为(1.0±0.2)mmol/L,显著低于NAFLD组【(1.4±0.2)mmol/L,P<0.05】;NAFLD合并T2DM组血清HCY、FGF21和NF-κB水平分别为(17.8±2.3)μmol/L、(315.2±32.5)pg/ml和(4.1±0.8)pg/mL,显著高于NAFLD组【分别为(14.1±1.9)μmol/L、(278.9±30.7)pg/ml和(2.8±0.5)pg/mL,P<0.05】;肝硬化患者血清HCY和NF-κB水平分别为(20.3±2.1)μmol/L和(5.0±1.0)pg/mL,显著高于NASH组【分别为(18.9±1.9)μmol/L和(4.5±0.7)pg/mL,P<0.05】或SFL组【分别为(16.2±1.6)μmol/L和(3.9±0.6)pg/mL,P<0.05】,而血清FGF21水平为(284.7±30.5)pg/ml,显著低于NASH组【(337.8±25.1)pg/ml,P<0.05】或SFL组【(312.5±28.3)pg/ml,P<0.05】;肝纤维化S2~S4期血清HCY和NF-κB水平分别为(20.9±1.8)μmol/L和(5.1±1.1)pg/mL,显著高于S0~S1期【(17.2±2.1)μmol/L和(3.9±0.8)pg/mL,P<0.05】,而血清FGF21水平为(291.1±26.7) pg/ml,显著低于S0~S1期【(319.8±28.3)pg/ml,P<0.05】。结论 NAFLD合并T2DM患者血清HCY、FGF21和NF-κB水平显著高于NAFLD患者,且这些指标与NAFLD临床分型和肝纤维化程度有关。

核因子-κB反义核苷酸对大鼠移植角膜存活时间的影响

目的研究核因子κB(NFκB)反义寡核苷酸对大鼠角膜移植排斥反应的影响。方法使用大鼠穿透角膜移植排斥反应动物模型,观察脂质体包裹的NFκB反义寡核苷酸对排斥反应指数(RI)及植片存活时间的影响,并测定受体鼠脾细胞混合淋巴细胞培养(MLC)和细胞毒T细胞(CTL)活性。结果反义寡核苷酸组角膜植片存活时间较对照组明显延长(P<0.01);MLC显示该组大鼠脾细胞对供体抗原刺激的增殖反应受到抑制(P<0.05),CTL活性明显减弱(P<0.05)。结论脂质体包裹的NFκB反义寡核苷酸能有效抑制受体鼠对移植物的排斥反应,使角膜植片存活时间延长。

前列腺癌组织肝激酶B1,Rab鸟嘌呤核苷酸交换因子-5 mRNA表达水平与临床病理特征和预后的相关性研究

目的研究前列腺癌患者癌组织中肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)及Rab鸟嘌呤核苷酸交换因子-5(Rab guanine nucleotide exchage factor-5,Rab EX-5)mRNA表达及临床意义。方法应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测92例前列腺癌组织和80例良性前列腺增生组织中LKB1及RabEX-5 mRNA的表达,比较LKB1,RabEX-5 mRNA表达组间差异及与临床病理特征的关系。Pearson线性相关分析LKB1与RabEX-5 mRNA表达的相关性。Kaplan-Meier生存分析LKB1,RabEX-5 mRNA表达与前列腺癌患者生存预后的关系。多因素COX回归分析影响前列腺癌患者生存预后的危险因素。结果与前列腺增生组织相比,前列腺癌组织中RabEX-5 mRNA表达明显升高(1.311±0.374 vs 0.457±0.083),差异有统计学意义(t=20.758,P=0.000),而LKB1 mRNA表达显著降低(0.373±0.052 vs 1.234±0.268),差异有统计学意义(t=30.181,P=0.000)。LKB1,RabEX-5 mRNA表达与Gleason评分、骨转移、TNM分期有关(t=2.419~9.965,均P<0.05),与年龄、前列腺特异抗原(PSA)水平无关(t=0.379~1.453,均P>0.05)。前列腺癌组织中LKB1与RabEX-5 mRNA的表达呈显著负相关(r=-0.402,P=0.000)。低LKB1表达组3年总体生存率低于高LKB1表达组(χ^(2)=55.605,P=0.000),高RabEX-5表达组3年总体生存率低于低RabEX-5表达组(χ^(2)=29.435,P=0.000)。多因素COX回归分析结果表明,Gleason评分≥7分(OR=2.671,P=0.018)、骨转移(OR=1.528,P=0.031)、TNM分期为Ⅲ期(OR=1.634,P=0.037),LKB1 mRNA低表达(OR=1.764,P=0.008)及RabEX-5 mRNA高表达(OR=2.587,P=0.000)是影响前列腺癌患者生存预后的危险因素(P<0.05)。结论前列腺癌组织中RabEX-5 mRNA表达升高,而LKB1 mRNA表达降低,二者共同参与前列腺癌的发生发展,有望成为评估前列腺癌患者预后的组织肿瘤标志物。

核因子-κBp65反义寡核苷酸对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞炎性因子的影响

目的探讨核因子-κB p65(NF-κB p65)的反义寡核苷酸(ASODN)对类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)炎性因子的影响,探讨RA的发病机制及新的治疗途径。方法活动期RA病例,常规分离PBMC,用NF-κB p65 ASODN进行干预,以NF-κB p65错义寡核苷酸(MSODN)、甲氨喋呤(MTS)作为阴性和阳性对照,并与重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα)刺激后进行对比;采用Western blot检测NF-κB p65蛋白表达,RT-PCR检测炎性因子IL-1β、IL-8、TNF-αmRNA表达,ELISA法检测炎性因子IL-1β、IL-8、TNF-α水平。结果在正常培养状态下,RA患者PBMC表达NF-κB p65蛋白,并能分泌炎性因子;rhTNFα刺激后RA患者比正常培养状态下PBMC的NF-κB p65蛋白高表达,分泌炎性因子的量明显上调(均P<0.05);NF-κB p65 ASODN干预和MTS处理后的RA患者,比非干预组及MSODN干预后PBMC的NF-κB p65蛋白低表达,分泌炎性因子的量明显下调(P<0.05)。结论 RA患者PBMC表达NF-κB p65蛋白,经NF-κB p65 ASODN干预和MTS处理后RA患者PBMC的NF-κBp65蛋白低表达,炎性因子表达减少,NF-κB p65 ASODN有望成为治疗RA的新途径。

聚酰胺—胺型树枝状高聚物纳米载体介导的组织因子反义寡脱氧核苷酸防治心肌缺血再灌注损伤机制的初步研究

目的研究聚酰胺—胺型树枝状高聚物(PAMAM-D)纳米载体介导组织因子(TF)反义寡脱氧核苷酸防治大鼠心肌缺血再灌注损伤的分子机制。方法分别设计合成针对大鼠TF的反义寡脱氧核苷酸(AS/TF)、正义寡脱氧核苷酸(S/TF)和错配寡脱氧核苷酸(Sc/TF),分别耦联于PAMAM-D纳米载体,构建ODN-PAMAM-D的聚合物。将100只雄性Lewis大鼠随机等分为假手术组、缺血再灌注组、AS/TF防治组、S/TF对照组和Sc/TF对照组。除假手术组和缺血再灌注组大鼠静脉分别注入生理盐水和PAMAM-D外,其余3组大鼠分别注入与PAMAM-D相耦联的相应寡核苷酸。各组大鼠于注射后10h开胸暴露心脏,除假手术组以外的其他4组大鼠于冠状动脉左前降支中1/2处结扎造成心肌缺血。心肌缺血90min后,解除结扎,再灌注3h。假手术组的大鼠于冠状动脉左前降支中1/2处只穿线,不结扎,持续4h 30min。分别于缺血90min和再灌注结束后取各组大鼠的血液检测肌钙蛋白T(TnT)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量。并于实验结束后取梗死区及边缘区心肌组织检测TF基因的转录、TF的促凝活性(TF:C)和TF的抗原含量(TF:Ag)以及活性氧簇(ROS)、蛋白酶激活受体-1(PAR-1)和p38有丝分裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)的表达。结果心肌缺血90min及再灌注3h后,缺血再灌注组大鼠血液中的TnT和LDH含量均显著高于假手术组,而AS/TF防治组均明显低于其他3个缺血再灌注组(P<0.05);梗死区及边缘区心肌组织中TF基因的转录和表达均强于假手术组,AS/TF防治组则较其他3个缺血再灌注组明显减弱(P<0.01)。流式细胞学检测显示,心肌缺血再灌注3h后,各缺血再灌注组大鼠心肌组织中ROS、PAR-1和p38 MAPK的表达均显著增多,AS/TF防治组则明显低于缺血再灌注组、S/TF对照组和Sc/TF对照组(P<0.05)。结论 TF不仅介导了凝血过程,而且通过激活PAR-1和p38 MAPK诱发了炎性反应,从而加重了心肌组织损伤。TF是心肌缺血再灌注损伤的"中心分子",针对TF的反义寡脱氧核苷酸耦联G10代PAMAM-D纳米载体不仅抑制了TF的转录和表达,而且减轻了心肌缺血再灌注损伤。

核因子-κB的反义及诱骗性寡核苷酸联合作用对内皮细胞间黏附分子-1表达的影响

目的探讨在人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)ECV304中,核因子(NF)-κB的反义及诱骗性寡核苷酸联合作用对肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的细胞间黏附分子-1(ICAM一1)表达的影响。方法采用反义和诱骗性寡核苷酸分别和联合干预ECV304,流式细胞仪检测寡核苷酸转染效率,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪荧光活细胞测定和免疫组织化学染色法分别从mRNA和蛋白质水平检测TNF-α诱导的ICAM-1表达。结果脂质体介导的转染法能有效地将单链、双链寡核苷酸转染至ECV304中。联合转染反义及诱骗性寡核苷酸的ECV304细胞的ICAM-1 mRNA表达较TNF-α诱导者降低42.58%(P<0.05),ICAM-1在细胞表面的表达降低85.46%(P<0.05),且下调幅度均显著大于反义寡核苷酸或诱骗性寡核苷酸的单独作用(P值均<0.01)。免疫组织化学染色也获得同样结果。结论NF-κB的反义及诱骗性寡核苷酸可显著下调NF-κB调控的与动脉粥样硬化相关的黏附分子表达,且联合作用效果强于单独作用,这可能为核苷酸干预防治动脉粥样硬化提供新的思路。

PAMAM-D纳米载体介导TF反义寡脱氧核苷酸防治心肌缺血再灌注损伤的实验研究

目的研究聚酰胺-胺型树枝状高聚物(PAMAM-D)纳米载体介导组织因子(TF)反义寡脱氧核苷酸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用。方法分别设计合成针对大鼠TF的反义寡脱氧核苷酸(AS/TF)、正义寡脱氧核苷酸(S/TF)和错配寡脱氧核苷酸(Sc/TF),将该三种寡脱氧核苷酸偶联于PAM-AM-D纳米载体,构建寡核苷酸-PAMAM-D的聚合物。将100只雄性Lewis大鼠随机等分为假手术组、缺血再灌注组、AS/TF防治组、S/TF对照组和Sc/TF对照组。结果心肌缺血90 min及再灌注3 h后,各组大鼠血液中的TnT和TAT均显著增多(与假手术组相比,P<0.05或<0.01),而AS/TF防治组大鼠血液中的TnT和TAT均明显低于其他3个缺血再灌注组(P<0.05或<0.01)。心肌缺血再灌注3 h后,缺血再灌注的各组大鼠梗死区及边缘区心肌组织中TF基因的转录和表达均强于假手术组(与假手术组相比,P<0.05或<0.01),而AS/TF防治组大鼠梗死区及边缘区心肌组织中TF基因的转录和表达则较其他3个缺血再灌注组明显减弱(P<0.01)。结论聚酰胺-胺型树枝状高聚物纳米载体介导的TF反义寡脱氧核苷酸对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用。

生长因子-1诱骗寡核苷酸对大鼠颈总动脉球囊损伤后血小板源性生长因子-BB表达的影响

目的探讨针对早期生长反应因子-1(Egr-1)的诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy ODN)对大鼠动脉损伤后内膜增生的影响和可能的机制。方法制备大鼠颈动脉球囊损伤模型,将96只Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯损伤组、杂码寡脱氧核苷酸(SCR)组和治疗组,每组24只。术后3、7、14、21 d处死动物,每组6只。应用HE染色、Real time RT-PCR和Western blot方法观察大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生情况、Egr-1和血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)的表达及Egr-1 decoy ODN对它们的影响。结果①内皮损伤后3 d内膜增厚不明显,7 d内膜开始增厚,14、21 d时内膜明显增厚。②Egr-1 mRNA和蛋白水平于术后3 d开始升高,21 d时达到顶峰,而PDGF-BB的mRNA和蛋白水平均于3 d开始升高,14 d时达到顶峰。③转染Egr-1 decoy ODN治疗后,在各个时间点内膜增厚程度减轻,与对照组比较,Egr-1和PDGF-BB表达明显减少,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论 Egr-1 decoy ODN可能是通过特异性抑制Egr-1的表达,进而抑制PDGF-BB的表达,达到减轻新生内膜厚度、从而减轻血管损伤后内膜增生的目的。

反义TNF-α寡脱氧核苷酸降低多器官功能不全综合征大鼠死亡率

目的 观察反义肿瘤坏死因子 -α(tumornecrosisfactor -alpha ,TNF -α)寡脱氧核苷酸对酵母多糖A(zymosanA)诱导的多器官功能不全综合征 (multipleorgandysfunctionsyndrome ,MODS)大鼠的影响 ,探讨MODS的发病机制 ,为采用反义技术降低MODS死亡率的早期临床试验提供实验依据。方法 采用静脉注射方法 ,使反义TNF -α寡脱氧核苷酸 (ODN)作用于zymosanA诱导的MODS大鼠 :①采用RT -PCR ,ELISA检测大鼠肝TNF -α的mRNA和蛋白质的表达水平 ;②观察大鼠在不同时期的死亡率 ;③在zymosanA诱导大鼠MODS 2 4小时后采集股动脉血进行血气分析 ,采集外周血进行血清生化检测 ,并进行统计学分析。结果 反义TNF -αODN降低了zymosanA诱导的MODS大鼠的TNF -α的释放 ,降低了MODS大鼠的死亡率 ,而正义TNF -αODN和错配TNF -αODN与对照组相比 ,对TNF -α的释放无影响 ,未能降低MODS大鼠的死亡率。结论 反义TNF -αODN以序列特异性方式抑制了zymosanA诱导的MODS大鼠的TNF -α的释放 。

茯苓酸调节PI3K/AKT/NF-κB信号通路对大鼠幽门螺旋杆菌相关性胃炎的治疗作用

目的 探讨茯苓酸(PA)对大鼠幽门螺旋杆菌(Hp)相关性胃炎的治疗效果及作用机制。方法 建立Hp相关性胃炎大鼠模型;所有大鼠分为对照组(CT组)、模型组(M组)、PA低剂量组(PA L组)和PA高剂量组(PA H组)、PA H+磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂(740 Y-P)组;评估各组大鼠胃黏膜损伤指数(UI),透射电子显微镜观察胃黏膜细胞形态学,HE染色评价胃黏膜病理学特征,ELISA检测胃组织白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平,Western blot法检测PI3K、磷酸化-PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、核因子(NF)-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达。结果 与CT组比较,M组大鼠胃黏膜糜烂,上皮水肿、充血、溃疡严重,上皮细胞固缩,炎性细胞浸润,UI、IL-6、TNF-α、iNOS以及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平升高,IL-10和SOD水平降低(P<0.05);与M组比较,PA L组、PA H组大鼠胃黏膜损伤改善,炎性细胞浸润减少,UI、IL-6、TNF-α、iNOS以及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平降低,IL-10和SOD水平升高(P<0.05);与PA H组比较,PA H+740 Y-P组大鼠胃黏膜病理损伤加重,上皮细胞固缩,UI、IL-6、TNF-α、iNOS以及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平升高,IL-10和SOD水平降低(P<0.05)。结论 PA可能通过抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路发挥对大鼠Hp相关性胃炎的治疗作用。

核因子-kappa B反义核苷酸对小鼠移植心脏存活时间的影响

目的;设计特定的反义硫代寡聚脱氧核苷酸(ODN)来特异性地抑制小鼠核因子-kappa B(NF-кB)的mRNA,并观察其对小鼠移植心脏存活时间的影响。方法;将30只小鼠随机分成NF-кB反义ODN给药组、碱基错配ODN对照组和未给药组,小鼠心脏移植血管重建后经腹腔缓释泵分别以12.5mg·kg^(-1)·d^(-1)的剂量全身给予NF-кB反义ODN和碱基错配ODN,持续给药14d,而未给药组不给药物。观察受体小鼠移植心脏存活时间;术后d7各组分别处死5只小鼠,测定受体小鼠脾细胞的混合淋巴细胞培养(MLC)和细胞毒T细胞(CTL)活性。结果:给药组小鼠的移植心脏存活时间较对照组和未给药组明显延长 (P<0.05);MLC显示给药组小鼠脾细胞对供体抗原刺激的增殖反应受到抑制(P<0.05);给药组受体小鼠的脾细胞的CTL活性也明显减弱(P<0.05)。结论:NF-кB反义ODN能有效抑制受体对小鼠移植物的细胞免疫反应,使同种异体的心脏移植存活时间延长。

Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸抑制大鼠颈总动脉损伤后MMP-2的表达

目的观察局部转染早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)的特异诱骗寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotides,decoy ODNs)对球囊损伤颈总动脉后基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达的影响及内膜增生的情况,初步探讨Egr-1,decoy ODNs抑制球囊损伤后内膜增生的机制。方法 96只健康雄性Wistar大鼠,随机分为4组,分别为假手术组、对照组、杂码组和诱骗组,每组24只。除假手术组外均应用2F球囊导管行颈总动脉球囊损伤术,术中采用转染试剂FuGENE6介导的Egr-1decoy ODNs转染至损伤后大鼠血管中,与假手术组、对照组、杂码组相比较。术后3、7、14、21d每组处死6只动物。应用HE染色和免疫组织化学方法观察大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生情况和MMP-2蛋白的表达及转染Egr-1decoy ODNs后对它们的影响。结果 (1)、内膜损伤后3d内膜增厚不明显,7d内膜开始增厚,14、21d时内膜明显增厚。(2)、在假手术组近腔面中膜可见MMP-2有少量散在阳性表达;在对照组及杂码组动脉损伤后3d,在近腔面中膜,有少量阳性表达,与假手术组相比,阳性表达指数上升。7d时在新生内膜和靠近新生内膜处中膜表达明显,14d后表达逐渐下降。(3)转染decoy ODNs治疗后,在各个时间点内膜增厚程度减轻,MMP-2蛋白表达减少,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论血管球囊损伤后,内膜7d开始增生,14d、21d增生更明显,而MMP-2在7d时表达明显,之后逐渐下降,Egr-1decoy ODNs能抑制MMP-2的表达,从而减轻血管损伤后内膜的增生。

微小RNA-155通过调控核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1/核因子κB信号通路加剧新生大鼠缺氧缺血性脑损伤

目的探讨微小RNA-155(miRNA-155)是否通过调控核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1(NOD1)/核因子κB(NF-κB)信号通路在新生大鼠缺氧、缺血性脑损伤中发挥作用。方法选择新生雄性大鼠40只,分4组,每组10只。分别是假手术组、缺氧缺血组(HI组)、阴性对照组(NC antagomir组)、miRNA-155抑制组(miRNA-155antagomir组)。大鼠经10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后取左脑测定脑组织含水量;采用HE染色,于光学显微镜下观察各组大鼠脑海马组织病理形态学改变;采用Western blotting法检测各组大鼠脑组织中NOD1、NF-κB p65、NF-κB p50、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)和p-NF-κB p50的蛋白表达水平;采用Real-time PCR法检测各组大鼠脑组织及血清中miRNA-155、NOD1、NF-κB p65和NF-κB p50的mRNA表达水平。结果与假手术组相比,HI组和NC antagomir组新生大鼠脑组织含水量显著升高,miRNA-155 antagomir组显著降低(P <0. 05);假手术组海马细胞排列整齐,细胞形态结构及层次清晰完整,无空泡,间质无水肿;HI组和NC antagomir组可见海马细胞排列紊乱,形成空泡,胶质细胞增生,细胞间隙增宽出现水肿,坏死细胞数增多;miRNA-155 antagomir组脑组织水肿明显减轻,海马细胞排列紊乱现象有所改善,坏死细胞数减少。与假手术组相比,HI组和NC antagomir组新生大鼠NOD1、p-NF-κB p65和p-NF-κB p50蛋白表达水平显著升高,而miRNA-155 antagomir组与HI组和NC antagomir组相比显著降低,差异均具有统计学意义(P <0. 05);HI组和NC antagomir组新生大鼠脑组织及血清NOD1 mRNA表达水平显著高于假手术组,miRNA-155 antagomir组NOD1 mRNA表达水平与HI组和NC antagomir组相比显著降低(P <0. 05),但各组大鼠NF-κB p65及NF-κB p50的表达水平差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论 MiRNA-155可通过调控NOD1/NF-κB信号通路促进新生大鼠缺氧、缺血性脑损伤,其作用机制可能与miRNA-155激活NOD1信号通路,促进下游NF-κB发生磷酸化,加剧缺氧、缺血新生乳大鼠脑组织炎症。