重组新城疫病毒rL-RVG抑制Nrf2-GCLC-GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡

目的探讨重组新城疫病毒(recombinant Newcastle disease virus,rL-RVG)是否通过Nrf2-GCLC-GPX4通路引发胃癌细胞铁死亡。方法培养人胃癌HGC-27细胞,分别用rL-RVG、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、PBS溶液(对照组)处理HGC-27细胞后,用CCK-8、Transwell侵袭、细胞划痕实验检测胃癌HGC-27细胞的增殖、侵袭、迁移能力。加入铁死亡促进剂(erastin)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)促进剂(TBHQ)及抑制剂(ML385)作为干预组,脂质氧化试剂盒检测各组丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;DCFH-DA荧光探针及流式细胞仪检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;Western blot、免疫荧光法检测Nrf2-GCLC-GPX4通路相关蛋白表达情况。结果与对照组比较,rL-RVG和NDV处理后,细胞的存活率均下降,呈剂量、时间依赖性,且rL-RVG处理组较为显著(P<0.05);NDV和rL-RVG处理组胃癌HGC-27细胞迁移、侵袭能力均受到抑制,后者较前者抑制更明显(P<0.05);与对照组比较,病毒组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量上升(P<0.05),rL-RVG组上升或下降的趋势较NDV组明显,且erastin组SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P<0.05);与对照组比较,TBHQ组、ML385组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达分别上升、下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P<0.05);与rL-RVG组比较,rL-RVG+TBHQ组、rL-RVG+ML385组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达分别上升、下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P<0.05)。结论重组新城疫病毒(rL-RVG)可通过Nrf2-GCLC-GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡的发生,抑制肿瘤细胞的生长。

双路通脑方调节SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的影响

目的探讨双路通脑方对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的作用以及对沉默信息调节因子2同源物1(SIRT1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)信号通路的调节机制。方法采用随机数字表法选取20只大鼠作为假手术组,剩余70只大鼠均利用大脑中动脉闭塞法制备缺血性脑卒中大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、双路通脑方组、双路通脑方+SIRT1抑制剂组(双路通脑方+EX527组),每组20只。14 d后,对大鼠进行神经功能损伤评分;TTC染色检测大鼠脑梗死面积;HE染色检测大鼠脑组织病理变化;尼氏染色检测大鼠脑组织神经元数量;试剂盒检测大鼠脑组织中铁离子(Fe^(2+))、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的水平;免疫组化检测大鼠脑组织中酰基-辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)、转铁蛋白受体(TFR)、铁蛋白重链多肽1(FTH1)蛋白的阳性表达;Western blotting法检测大鼠脑组织中SIRT1、Nrf2、GPx4及胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(SLC7A11)蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型对照组大鼠的神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达升高(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均降低(P<0.05);与模型对照组比较,双路通脑方组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达降低(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均升高(P<0.05);采用SIRT1抑制剂进行回补实验,结果显示SIRT1抑制剂逆转了双路通脑方对神经元铁死亡的抑制作用,同时也抑制了Nrf2和GPx4的表达(P<0.05)。结论双路通脑方可能通过激活SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路来抑制缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡。

基于Nrf2/Gpx4通路研究右美托咪定对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠铁死亡及神经功能的影响

目的基于核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)信号通路,研究右美托咪定(DEX)对缺血缺氧性脑损伤(HIBD)新生大鼠铁死亡及神经功能的影响。方法构建HIBD新生大鼠模型,随机分为模型组、DEX(100μg/kg)组、DEX(100μg/kg)+抑制剂(Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇2 mg/kg)组,每组12只,另取12只新生大鼠作为对照组。对照组和模型组腹腔注射相同体积的0.9%氯化钠溶液。大鼠神经功能缺损程度评分(NDS)评价大鼠神经功能;氨基酸自动分析仪检测海马组织中谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)水平;尼氏(Nissl)染色检测海马区神经元形态;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测海马组织中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量;试剂盒检测海马组织丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、铁含量;蛋白免疫印迹检测海马组织中Nrf2、HO-1、Gpx4、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(xCT)表达情况。结果与对照组比较,模型组海马区神经元形态异常,腹侧神经元轴突长短不一且排布不整齐,部分神经元呈背侧脱离趋势,NDS评分、海马组织中Glu、IL-6、TNF-α、NSE、MDA、铁含量升高(P<0.05),GABA、GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4、xCT蛋白水平降低(P<0.05);与模型组比较,DEX组海马区神经元形态相对饱满,腹侧神经元轴突较整齐,NDS评分、海马组织中Glu、IL-6、TNF-α、NSE、MDA、铁含量降低(P<0.05),GABA、GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4、xCT蛋白水平升高(P<0.05);Nrf2抑制剂可减轻DEX对HIBD新生大鼠神经损伤的改善作用(P<0.05)。结论DEX能够激活Nrf2/Gpx4通路,抑制铁死亡,改善HIBD新生大鼠神经损伤。

茯苓酸通过调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制氧糖剥夺/复氧诱导的心肌细胞铁死亡

目的:探究茯苓酸通过调节核因子E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体家族7成员11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路抑制氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的心肌细胞铁死亡的机制。方法:体外培养大鼠心肌细胞H9c2,诱导建立细胞OGD/R模型后以0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L茯苓酸处理24 h,通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各处理组细胞活力后筛选出合适的茯苓酸作用浓度。将H9c2细胞随机分为对照组、模型组、茯苓酸组、ML385组(Nrf2抑制剂组)、茯苓酸+ML385组,除对照组外其余各组建立细胞OGD/R模型后以茯苓酸、ML385分组处理,采用CCK-8法与流式细胞实验分别检测各组H9c2细胞活力、凋亡率;采用试剂盒检测各组H9c2细胞培养基上清中乳酸脱氢酶(LDH)、促炎因子[前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]、抗炎因子白细胞介素(IL)-10水平及细胞抗氧化因子[过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)]、铁死亡相关指标[铁含量、丙二醛(MDA)]水平;采用免疫印迹实验检测各组H9c2细胞凋亡及Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路相关蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组细胞凋亡率、LDH释放量、细胞培养基上清中PGE2及TNF-α水平、细胞铁含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表达均升高(P<0.05),细胞活力、细胞培养基上清中IL-10水平、细胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组比较,茯苓酸组细胞凋亡率、LDH释放量、细胞培养基上清中PGE2及TNF-α水平、细胞铁含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表达均降低(P<0.05),细胞活力、细胞培养基上清中IL-10水平、细胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达升高(P<0.05);ML385组细胞凋亡率、LDH释放量、细胞培养基上清中PGE2及TNF-α水平、细胞铁含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表达均升高(P<0.05),细胞活力、细胞培养基上清中IL-10水平、细胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达降低(P<0.05)。与茯苓酸组比较,茯苓酸+ML385组细胞凋亡率、LDH释放量、细胞培养基上清中PGE2及TNF-α水平、细胞铁含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表达均升高(P<0.05),细胞活力、细胞培养基上清中IL-10水平、细胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达降低(P<0.05)。结论:茯苓酸可通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号而抑制OGD/R诱导的心肌细胞炎症、脂质过氧化与铁死亡,增强其抗氧化活性及细胞活力,最终减轻其细胞凋亡损伤。

基于Nrf2-GPX4铁死亡途径探讨芒果苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制

目的:探讨芒果苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护机制。方法:60只无特定病原体(SPF)级健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、MIRI组、芒果苷低剂量组、芒果苷高剂量组、芒果苷+核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)组,每组12只。除假手术组外,其余组大鼠通过结扎左冠状动脉前降支建立MIRI模型。再灌注4 h后,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清肌钙蛋白I(cTnI)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察心肌组织病理学变化;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)分析心肌细胞凋亡情况;二氢乙锭(DHE)荧光法检测心肌组织活性氧(ROS)水平;比色法检测心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和亚铁离子(Fe^(2+))含量;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌组织Nrf2、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁蛋白重链1(FTH1)、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)的基因和蛋白表达。结果:与假手术组比较,MIRI组大鼠血清cTnI、CK和LDH水平,心肌细胞凋亡率,ROS、MDA、Fe^(2+)含量,ACSL4 mRNA和蛋白水平升高;SOD活性和GSH含量,Nrf2、GPX4、FTH1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05);心肌细胞肿胀,心肌纤维排列紊乱,大量炎性细胞浸润。与MIRI组比较,芒果苷低剂量组、芒果苷高剂量组血清cTnI、CK和LDH水平,心肌细胞凋亡率,ROS、MDA和Fe^(2+)含量,ACSL4 mRNA和蛋白水平降低;SOD活性和GSH含量,Nrf2、GPX4、FTH1 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05);心肌细胞水肿减轻,少量心肌纤维断裂和炎性细胞浸润。使用Nrf2抑制剂ML385抑制Nrf2的核易位可明显阻断芒果苷对心肌铁死亡的抑制作用(P<0.05)。结论:芒果苷可通过激活Nrf2-GPX4轴抑制铁死亡对MIRI发挥保护作用。

鸢尾素通过Nrf2/GPX4信号通路减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤的作用机制

目的探讨Nrf2/GPX4信号通路在鸢尾素减轻脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤中的作用。方法将72只健康雄性SD大鼠随机分为对照组(C组)、急性肺损伤组(ALI组)、鸢尾素组(Ir组)、鸢尾素+Nrf2抑制剂组(Ir+ML385组)。各组于模型制备后24 h收集支气管肺泡灌洗液(BALF),测定BALF中蛋白浓度,采用ELISA法检测BALF中IL-6、TNF-α含量;HE染色观察肺组织病理学结果并评分,计算肺组织湿/干重比;比色法检测肺组织中Fe^(2+)、MDA、GSH含量;Western blot测定肺组织中GPX4、ACSL4及胞核Nrf2的表达。结果与C组比较,ALI组中BALF蛋白浓度、IL-6、TNF-α含量、肺组织病理损伤评分、湿/干重比、Fe^(2+)、MDA含量均增加,GSH含量降低,GPX4表达降低,ACSL4、胞核Nrf2表达增加(P<0.05);与ALI组比较,Ir组中BALF蛋白浓度、IL-6、TNF-α含量、肺组织病理损伤评分、湿/干重比、Fe^(2+)、MDA含量均降低,GSH含量增加,GPX4、胞核Nrf2表达增加,ACSL4表达降低(P<0.05);与Ir组比较,Ir+ML385组中BALF蛋白、IL-6、TNF-α含量、肺组织病理损伤评分、湿/干重比、Fe^(2+)、MDA含量均增加,GSH含量降低,GPX4、胞核Nrf2表达降低,ACSL4表达增加(P<0.05)。结论Nrf2/GPX4信号通路参与了鸢尾素减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤的过程,其与抑制铁死亡有关。

鸦胆子苦醇调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对皮肤鳞癌细胞铁死亡的影响

目的:探讨鸦胆子苦醇调节核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)信号通路对皮肤鳞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)细胞铁死亡的影响。方法:CCK-8法检测0、100、250、500、700、900 nmol/L鸦胆子苦醇处理后人cSCC细胞系A431细胞增殖率,筛选出合适的鸦胆子苦醇作用浓度。体外培养的A431细胞随机分为对照组、鸦胆子苦醇低剂量组、鸦胆子苦醇高剂量组、特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ;Nrf2激活剂)组、鸦胆子苦醇高剂量+TBHQ组,以鸦胆子苦醇和TBHQ分组处理后,采用CCK-8法、Hoechst 33342染色法检测各组A431细胞增殖与凋亡;采用试剂盒检测各组A431细胞抗氧化因子[谷胱甘肽(glutathione,GSH)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)]水平及铁死亡指标[铁含量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)]水平;采用免疫印迹实验检测各组A431细胞增殖、凋亡及Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,鸦胆子苦醇低、高剂量组细胞增殖率、GSH及CAT、SOD水平,以及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及Bcl-2、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达均降低(P<0.05),凋亡率、铁含量、ROS及MDA水平和Bax蛋白表达均升高(P<0.05);鸦胆子苦醇高剂量组细胞增殖率、GSH及CAT、SOD水平,以及PCNA及Bcl-2、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达相比鸦胆子苦醇低剂量组进一步降低(P<0.05),凋亡率、铁含量、ROS及MDA水平和Bax蛋白表达进一步升高(P<0.05);TBHQ组细胞增殖率、GSH及CAT、SOD水平,以及PCNA及Bcl-2、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达升高(P<0.05),凋亡率、铁含量、ROS及MDA水平和Bax蛋白表达降低(P<0.05)。与鸦胆子苦醇高剂量组相比,鸦胆子苦醇高剂量+TBHQ组细胞增殖率、GSH及CAT、SOD水平,以及PCNA及Bcl-2、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达升高(P<0.05),凋亡率、铁含量、ROS及MDA水平和Bax蛋白表达降低(P<0.05)。结论:鸦胆子苦醇通过下调Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路而促进铁死亡,诱导cSCC细胞凋亡,并抑制其增殖。

促凋亡蛋白Bax和Bak通过Nrf2/GPX4信号通路调控铁死亡

为探究促凋亡蛋白Bak/Bax对erastin诱导铁死亡的调控机制,以野生型(WT)、Bak/Bax双敲除(Bak/Bax-DKO)、Bax敲除(Bax-KO)和Bak敲除(Bak-KO)的小鼠成纤维细胞(MEFs)为实验对象,利用CCK-8和流式细胞术检测细胞存活率和活性氧(ROS)的生成量,利用试剂盒测定GSH/GSSG水平,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测相关基因和蛋白的表达水平。结果显示:与野生型细胞相比,敲除Bak和Bax显著抑制erastin诱导的铁死亡,RT-qPCR和Western Blot检测发现,相比WT细胞,Bak/Bax-DKO细胞中核因子NF-E2相关因子2(Nrf2)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白、GPX4 mRNA表达水平明显升高。进一步研究发现:与Bak/Bax双敲除类似,敲除Bax也显著抑制erastin诱导的铁死亡,促进GPX4的蛋白表达水平;而敲除Bak对erastin诱导的铁死亡及GPX4的蛋白表达水平无明显影响。结果表明,促凋亡蛋白Bax和Bak通过Nrf2/GPX4信号通路抑制erastin诱导的铁死亡,且Bax在其中起主导作用。

银杏素通过抑制Nrf2/HO-1/GPX4信号通路诱导神经胶质瘤细胞铁死亡

目的:探讨银杏素抑制核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路,对神经胶质瘤细胞铁死亡的影响。方法:以人神经胶质瘤细胞U251为研究对象,分为对照组、银杏素低(银杏素-L,2.5μmol/L)、中(银杏素-M,5μmol/L)、高(银杏素-H,10μmol/L)浓度组、Nrf2激活剂-SFN(莱菔硫烷,20μmol SFN)组、银杏素-H+SFN(10μmol/L银杏素+20μmol SFN)组;流式细胞仪、CCK-8、DCFH-DA、Western blot分别检测U251细胞的细胞凋亡率、增殖水平、活性氧(ROS)含量以及Nrf2/HO-1/GPX4通路蛋白表达水平;铁离子检测试剂检测细胞内铁含量;透射电镜观察细胞超微结构。结果:与对照组相比,银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组线粒体膜厚度及嵴改变,增殖率、Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达均显著下降,凋亡率、ROS及铁含量显著增加(P<0.05);与银杏素-H组相比,银杏素-H+SFN组增殖率、Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达均显著增加,凋亡率、ROS及铁含量显著下降(P<0.05);与SFN组相比,银杏素-H+SFN组增殖率、Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达均显著下降,凋亡率、ROS及铁含量显著增加(P<0.05)。结论:银杏素通过抑制Nrf2/HO-1/GPX4信号通路,可以诱导神经胶质瘤细胞铁死亡,进而发挥抗肿瘤的作用。

蛇床子素通过Nrf2-Gpx4铁死亡途径对肺炎支原体肺炎大鼠肺损伤的改善作用

目的探讨蛇床子素对肺炎支原体肺炎大鼠肺损伤的影响及其机制。方法大鼠随机分为正常组、模型组、蛇床子素低剂量组(20 mg/kg)、蛇床子素高剂量组(40 mg/kg)、蛇床子素+ML385组(蛇床子素40 mg/kg+Nrf2抑制剂ML38530 mg/kg),每组12只。除正常组外,其余大鼠采用经鼻反复感染肺炎支原体构建肺炎模型,给予相应药物干预后,ELISA法检测血清MP-IgM、IL-6、TNF-α水平,HE染色观察肺组织病理学变化,检测肺组织MDA、GSH、Fe^(2+)水平和SOD活性,TUNEL法检测肺组织细胞凋亡率,RT-qPCR和Western blot法检测肺组织Nrf2、SLC7A11、Gpx4 mRNA和蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血清MP-IgM、IL-6、TNF-α水平和肺组织炎症浸润评分、MDA、Fe^(2+)水平、细胞凋亡率均升高(P<0.05),肺组织GSH水平、SOD活性、Nrf2、SLC7A11、Gpx4 mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05);与模型组比较,蛇床子素各剂量组大鼠血清MP-IgM、IL-6、TNF-α水平和肺组织炎症浸润评分、MDA、Fe^(2+)水平、细胞凋亡率均降低(P<0.05),肺组织GSH水平、SOD活性、Nrf2、SLC7A11、Gpx4 mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05);ML385可减弱蛇床子素对肺炎支原体肺炎大鼠肺损伤的保护作用(P<0.05)。结论蛇床子素可改善肺炎支原体肺炎大鼠肺损伤,其作用机制可能与激活Nrf2-Gpx4信号通路,抑制铁死亡有关。

Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4信号通路阻断癫痫大鼠海马神经元铁死亡机制及草果知母汤的干预效应

目的 探讨Kelch-样ECH相关蛋白1(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路阻断癫痫海马神经元铁死亡机制及草果知母汤的干预效应。方法 将60只大鼠随机分成正常对照组、模型组、草果知母汤低、中、高剂量组和西药对照组,每组10只。采用腹腔注射戊四氮(PTZ)法建立癫痫大鼠模型,草果知母汤低、中、高剂量组分别给予草果知母汤1.25 g/kg、2.50 g/kg、5.00 g/kg,西药对照组腹腔注射丙戊酸钠(200 mg/kg),连续给药5周,对大鼠进行Racine评分,使用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒测定海马组织谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)及铁含量,苏木精-伊红(HE)及尼氏(Nissl)染色法观察海马组织病理学变化并计算海马神经元细胞数,免疫组化检测海马组织CA1区GPX4、Nrf2蛋白表达积分光密度(IOD),实时荧光定量聚合酶链式反应(RTq-PCR)及免疫印迹法(Western Blot)检测海马组织Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果 与正常对照组比较,模型组大鼠Racine评分、海马组织铁含量及ROS水平、海马组织Keap1 mRNA及蛋白水平均升高(P<0.05),海马组织GSH水平、海马神经元细胞数、海马组织GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白表达水平、海马CA1区GPX4、Nrf2蛋白免疫组化积分光密度降低(P<0.05)。与模型组比较,草果知母汤低、中、高各剂量及西药对照组大鼠Racine评分、海马组织铁含量及ROS水平、海马组织Keap1 mRNA及蛋白水平降低(P<0.05),海马组织GSH水平、海马神经元细胞数、海马组织GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平及蛋白表达水平、海马CA1区GPX4、Nrf2蛋白表达积分光密度升高(P<0.05)。结论 草果知母汤能够修复癫痫大鼠海马组织神经元氧化损伤,其机制可能与调节Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4通路进而阻断海马神经元铁死亡有关。

淫羊藿苷调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响

目的:探讨淫羊藿苷调节核转录E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体蛋白7家族成员11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响。方法:将小胶质细胞(BV2)分为对照组(5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖)、高糖组(35 mmol·L^(-1)葡萄糖)、淫羊藿苷低(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+0.37μmol·L^(-1)淫羊藿苷)、高(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+1.48μmol·L^(-1)淫羊藿苷)剂量组、抑制剂组(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+1.48μmol·L^(-1)淫羊藿苷+1μmol·L^(-1)的Nrf2抑制剂ML385)。采用CCK-8法检测细胞增殖,进行细胞形态学观察,用超氧化物阴离子荧光探针(DHE)、氟硼二吡咯(BODIPYTM)检测细胞内活性氧(ROS)、脂质过氧化(LPO)水平,特异性荧光探针检测细胞内活性铁含量,Western Blot检测细胞Nrf2、SLC7A11、GPX4、血红素加氧酶1(HO-1)、环氧合酶2(COX2)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)蛋白的表达。结果:与对照组比较,高糖组的BV2细胞形态不规则,出现细胞碎片,细胞光密度(OD450)值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达明显降低(P<0.05),ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达显著升高(P<0.05);与高糖组比较,低、高剂量淫羊藿苷组的BV2细胞损伤减少,细胞OD450值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达升高(P<0.05),ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达降低(P<0.05);与高剂量淫羊藿苷组比较,抑制剂组减弱了淫羊藿苷对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的抑制作用。结论:淫羊藿苷通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路从而抑制高糖诱导的小胶质细胞铁死亡。

木犀草素调控Nrf2-Gpx4介导铁死亡途径抑制Ang Ⅱ诱导心肌细胞肥大

目的:探究木犀草素对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导下心肌细胞肥大的影响及分子机制。方法:体外培养大鼠心肌细胞H9c2,MTT法检测木犀草素对AngⅡ诱导下心肌细胞活力的影响,以筛选木犀草素的实验浓度。将H9c2细胞分为6组:正常对照组、模型组、木犀草素25μmol/L组、木犀草素50μmol/L组、Nrf2抑制剂brusatol(100 nmol/L)组、木犀草素50μmol/L+brusatol组,根据分组给予相应的药物预处理,再用AngⅡ诱导建立心肌细胞肥大模型。AngⅡ处理48 h后,Texas Red^(TM)-X鬼笔环肽免疫荧光染色检测各组细胞表面积;RT-qPCR检测各组细胞中肥大相关基因(ANP、BNP、NFATc1)的mRNA表达;试剂盒检测各组细胞中MDA、GSH、SOD、Fe^(2+)水平,DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞中ROS含量;Western Blot检测各组细胞核Nrf2、HO-1、Gpx4、xCT蛋白表达。结果:木犀草素50μmol/L对AngⅡ处理的细胞活力无明显影响,经100μmol/L木犀草素处理的细胞活力显著降低(P<0.05),故采用25、50μmol/L木犀草素研究其抗心肌细胞肥大作用。与正常对照组比较,模型组心肌细胞表面积、ROS荧光强度、MDA、Fe^(2+)水平及ANP、BNP、NFATc1 mRNA表达显著升高,细胞中SOD、GSH水平及核Nrf2、Gpx4、xCT、HO-1蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较,木犀草素25、50μmol/L组心肌细胞表面积、ROS荧光强度、MDA、Fe^(2+)水平及ANP、BNP、NFATc1 mRNA表达显著降低,细胞中SOD、GSH水平及核Nrf2、Gpx4、xCT、HO-1蛋白表达显著升高(P<0.05)。Brusatol可逆转木犀草素的作用(P<0.05)。结论:木犀草素可抑制氧化应激,减轻AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞肥大,其作用机制可能与增强Nrf2的核转录,激活Nrf2/Gpx4通路,抑制铁死亡有关。

丹酚酸B基于Nrf2-Gpx4通路介导的铁死亡途径改善单侧输尿管梗阻大鼠肾脏间质纤维化

目的基于核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)-谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,Gpx4)通路介导的铁死亡途径,探究丹酚酸B对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠肾脏间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)的改善作用。方法采用随机数字表法将40只大鼠分为假手术组、模型组、丹酚酸B组、丹酚酸B+Nrf2抑制剂组,每组10只。除假手术组外,其余各组建立UUO模型,假手术组除不结扎、剪断输尿管外,其余操作相同。丹酚酸B组灌胃100 mg·kg^(-1)·d^(-1)丹酚酸B,丹酚酸B+Nrf2抑制剂组在丹酚酸B组基础上腹腔注射Nrf2抑制剂ML38530 mg·kg^(-1)·d^(-1),假手术组、模型组灌胃等体积无菌生理盐水,连续9 d。HE染色和Masson染色检测肾组织形态和纤维化情况;试剂盒检测肾脏组织中Fe^(2+)、丙二醛(maleicdialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹检测肾脏组织中Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ,CoL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Collagen-Ⅲ,CoL-Ⅲ)、Nrf2、Gpx4的mRNA和蛋白水平。结果与假手术组相比,模型组肾脏组织中Fe^(2+)、MDA含量,CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05),血清中SOD活性降低(P<0.05),肾脏组织中Nrf2、Gpx4的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05);与模型组相比,丹酚酸B组肾脏组织中Fe^(2+)、MDA含量,CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05),血清中SOD活性,肾脏组织中Nrf2、Gpx4的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05);与丹酚酸B组相比,丹酚酸B+Nrf2抑制剂组肾脏组织中Fe^(2+)、MDA含量,CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05),血清中SOD活性,肾脏组织中Nrf2、Gpx4的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。结论丹酚酸B能够激活Nrf2-Gpx4通路进而抑制铁死亡实现对UUO大鼠RIF的缓解。

灯盏花素调控Nrf2/Gpx4通路对MIRI模型心肌凋亡的影响及作用机制研究

[目的]探究灯盏花素调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)通路对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)模型心肌凋亡的影响及作用机制。[方法]45只大鼠随机分为Sham组、MIRI组和MIRI+灯盏花素组,每组15只。通过结扎左前降支冠状动脉建立MIRI模型,建模24 h后,MIRI+灯盏花素组使用灯盏花素灌胃(200 mg/kg,1次/d,7 d)。比较各组大鼠心功能、心肌组织损伤、细胞凋亡、血清氧化应激因子、Nrf2/Gpx4通路表达水平。[结果]3组的上述指标比较差异显著(P<0.05)。MIRI组的左室收缩压力(LVESP)、上升和下降速率(±dP/dt max)、超氧化物歧化酶(SOD)、Nrf2和Gpx4 mRNA和蛋白水平显著低于Sham组,左室舒张末压力(LVEDP)、凋亡指数、丙二醛(MDA)水平显著高于Sham组(P<0.05)。MIRI+灯盏花素组的LVESP、±dP/dt max、SOD、Nrf2和Gpx4 mRNA和蛋白水平显著高于MIRI组,而LVEDP、凋亡指数和MDA显著低于MIRI组(P<0.05)。[结论]灯盏花素具有缓解MIRI模型大鼠心肌细胞凋亡的功能,并且其保护心功能的机制可能与促进Nrf2/Gpx4通路有关。

五味子乙素调控Nrf2/HO-1/GPX4铁死亡途径减轻糖尿病小鼠心肌损伤的机制研究

目的:探讨五味子乙素对糖尿病(DM)小鼠心肌损伤的影响及机制。方法:小鼠采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ,50 mg/kg)诱导建立DM模型,造模后分为模型组、五味子乙素低剂量(50 mg/kg)组、五味子乙素高剂量(100 mg/kg)组、五味子乙素(100 mg/kg)+ML385(30 mg/kg)组,每组18只;另取18只小鼠为正常对照组。五味子乙素各剂量组小鼠分别给予相应剂量的五味子乙素灌胃,五味子乙素+ML385组小鼠在给予100 mg/kg五味子乙素灌胃的同时腹腔注射ML38530 mg/kg,正常对照组与模型组小鼠灌胃相应体积生理盐水,1次/d,连续给药4 w后,使用超声心动图分析小鼠心功能;检测小鼠FBG、体质量、心脏质量,计算心脏指数,检测小鼠血清LDH、CK-MB、cTnⅠ水平;检测小鼠心肌组织SOD、GSH-Px、MDA、Fe^(2+)水平;二氢乙锭(DHE)荧光法检测心肌组织ROS水平;HE和Masson染色检测心肌组织病理学变化,并计算CVF;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡;RT-qPCR和Western Blot检测心肌Nrf2、HO-1、GPX4 mRNA和蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠LVEF、LVFS、体质量显著降低,LVEDD、LVESD、FBG、心脏质量、心脏指数、CVF、心肌细胞凋亡率及血清LDH、CK-MB、cTnⅠ水平和心肌组织MDA、ROS、Fe^(2+)水平显著升高,心肌组织SOD、GSH-Px水平和Nrf2、HO-1、GPX4 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05),心肌组织损伤及胶原纤维沉积明显。与模型组比较,五味子乙素低、高剂量组上述指标均显著改善(P<0.05),心肌组织损伤及胶原纤维沉积明显减轻。Nrf2抑制剂ML385能显著逆转五味子乙素对DM小鼠心肌损伤的保护作用。结论:五味子乙素可抑制铁死亡进而减轻DM小鼠心肌损伤,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1/GPX4信号通路有关。

普罗布考经Nrf2/Gpx4途径抑制铁死亡保护H9C2心肌细胞

目的:研究普罗布考(probucol)对RSL3(一种铁死亡诱导剂)诱导的心肌细胞铁死亡的影响并探讨其可能机制。方法:使用大鼠胚胎心肌细胞H9C2进行体外实验,细胞经浓度梯度的RSL3处理12 h,采用CCK8法检测心肌细胞的存活率。随后细胞用RSL3(1.406μmol/L)与浓度梯度的probucol共处理12 h,测得probucol的最佳干预浓度。然后将在对数生长期的细胞随机分成4组:对照组(DMSO组)、RSL3(1.406μmol/L)组、RSL3(1.406μmol/L)+probucol(50μmol/L)组、probucol(50μmol/L)组。光镜下观察细胞形态,Western blotting检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)蛋白的表达以及流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的浓度。结果:H9C2心肌细胞经probucol治疗后细胞活性增强、形态改善。probucol剂量依赖性的抑制RSL3诱导的H9C2心肌细胞的铁死亡;RSL3的IC50为1.406μmol/L,probucol的最佳干预浓度为50μmol/L。DMSO组细胞形态呈梭型,长势良好,贴壁性好,折光度强;RSL3组的细胞皱缩、贴壁性差,折光度减弱;RSL3+probucol组细胞状态明显改善,与DMSO组细胞形态基本相似;与DMSO组相比,RSL3组细胞内ROS浓度升高,Nrf2及Gpx4蛋白的表达降低(P<0.05);与RSL3组相比,RSL3+probucol组Nrf2、Gpx4蛋白的表达水平显著升高,细胞内ROS浓度明显降低(P<0.05)。结论:probucol降低细胞内氧化应激抑制RSL3诱导的心肌细胞铁死亡,其机制可能为通过升高Nrf2蛋白和Gpx4蛋白的表达水平。

地黄苷A对CLP诱导的脓毒症大鼠脑功能障碍和Nrf2/GPX4介导的铁死亡通路的影响

目的:探究地黄苷A(ReA)对盲肠结扎穿孔(CLP)诱导的脓毒症大鼠脑功能障碍的影响及机制。方法:将56只CLP诱导的脓毒症SD大鼠随机分为CLP组(n=12)、CLP+20ReA组(n=11)、CLP+40ReA组(n=11)、CLP+80ReA组(n=11)和GPX4-IN-3组(n=11),将只进行假手术的10只SD大鼠作为Sham组。Sham组和CLP组大鼠灌胃1 mL 1%二甲基亚砜。CLP+20ReA组、CLP+40ReA组、CLP+80ReA组大鼠分别灌胃1 mL剂量为20、40和80 mg/kg/d的地黄苷A。GPX4-IN-3组大鼠同时灌胃0.5 mL剂量为80 mg/kg/d的地黄苷A和0.5 mL剂量为15 mg/kg/d的铁死亡选择性诱导剂GPX4-IN-3。各组大鼠均给药3 d。通过神经功能评分和Morris水迷宫实验评价大鼠脑功能;采用ELISA法检测大鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)和S100β水平;采用称重法检测大鼠脑组织含水量;采用HE染色和尼氏染色评价大鼠脑损伤情况;采用微量法检测大鼠脑组织还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平和Fe^(2+)含量;采用ELISA法检测大鼠脑组织白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;采用Western blot检测大鼠脑组织核因子E2相关因子2(Nrf2)、Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白水平。结果:与CLP组比较,CLP+20ReA组、CLP+40ReA组和CLP+80ReA组大鼠的神经功能评分和逃避潜伏期降低(P<0.05),穿越平台次数升高(P<0.05),神经元损伤减轻,血清NSE和S100β水平降低(P<0.05),脑组织GSH水平升高(P<0.05),脑组织含水量、MDA、IL-6和TNF-α水平以及Fe^(2+)含量均降低(P<0.05),脑组织Nrf2(细胞核)和GPX4的蛋白表达水平升高(P<0.05),Keap1的蛋白表达水平降低(P<0.05)。与CLP+80ReA组比较,GPX4-IN-3组大鼠的脑功能障碍加重,Nrf2/GPX4通路被抑制(P<0.05)。结论:地黄苷A通过激活Nrf2/GPX4通路抑制铁死亡,从而减轻CLP诱导的脓毒症大鼠脑功能障碍。

补中益气汤通过调节Nrf2/PPARγ/GPX4通路抑制铁死亡改善自身免疫性甲状腺炎小鼠甲状腺损伤

目的:基于核因子E2相关性因子2(Nrf2)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)/谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)通路探讨补中益气汤改善自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠铁死亡的作用机制。方法:将120只SPF级8周龄NOD.H-2h4小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、补中益气汤低、中、高剂量组及西药组,各20只,除空白组外,采用经典的高碘水(0.05%碘化钠)喂养,8周后制成AIT模型。补中益气汤低、中、高剂量组分别予4.78、9.56、19.12 g·kg^(-1)补中益气汤灌胃,西药组给予3.033×10^(-5) g·kg^(-1)硒酵母片混悬液灌胃,空白组及模型组给予等体积蒸馏水灌胃,连续8周后实施取材。苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠甲状腺组织病理形态;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)含量;试剂盒检测小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;采用免疫荧光检测甲状腺组织中GPX4定位表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)检测甲状腺组织Nrf2、PPARγ、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、溶质载体家族3成员2(SLC3A2)、溶血卵磷脂酰基转移酶3(LPCAT3)、GPX4 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测甲状腺组织Nrf2、PPARγ、SLC7A11、SLC3A2、LPCAT3、GPX4蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组小鼠光镜下可见甲状腺组织内明显的淋巴细胞浸润现象,血清中TGAb、TPOAb含量显著升高(P<0.01),MDA水平显著升高,SOD水平显著降低(P<0.01);甲状腺组织中Nrf2、PPARγ、SLC7A11、SLC3A2、GPX4表达显著降低(P<0.01),LPCAT3的表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,补中益气汤各剂量组及西药组小鼠光镜下甲状腺组织内的淋巴细胞浸润程度减轻,血清中TPOAb、TGAb含量明显降低(P<0.05,P<0.01),MDA水平明显降低、SOD水平明显升高(P<0.05,P<0.01);甲状腺组织中Nrf2、PPARγ、SLC7A11、SLC3A2、GPX4表达明显升高、LPCAT3的表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。与西药组比较,补中益气汤各剂量组甲状腺组织中Nrf2、PPARγ、SLC7A11、SLC3A2、GPX4、LPCAT3表达总体趋势差异明显(P<0.05,P<0.01)。结论:补中益气汤可有效改善AIT的炎症损伤,其作用机制可能与调控Nrf2/PPARγ/GPX4抑制铁死亡进程有关。

基于Nrf2/GPX4信号通路探讨半夏泻心汤诱导胃癌细胞铁死亡的机制

目的:观察半夏泻心汤(BXT)对人胃癌HGC-27、MKN-45、AGS细胞增殖的影响及其作用机制。方法:采用细胞增殖与活性检测法(CCK-8)检测不同浓度的BXT含药血清(5%、10%、20%)对HGC-27、MKN-45、AGS细胞增殖的影响;线粒体膜电位探针(TMRE)检测细胞内线粒体膜电位表达,采用试剂盒对铁离子(Fe^(2+))含量、脂质过氧化物(LPO)与超氧化物歧化酶(SOD)活性进行检测,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测糖原合成激酶3β(GSK3β)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)、核转录因子E2相关因子2(Nrf2)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、重链溶质载体家族3成员2(SLC3A2)、转铁蛋白受体3(TFRC)和肿瘤蛋白P53(TP53)mRNA表达。结果:CCK-8结果显示含药血清干预3种胃癌细胞24 h,与空白组比较,BXT组与卡培他滨组均可显著降低胃癌细胞存活率(P<0.01);含药血清干预胃癌细胞48 h,与空白组比较,卡培他滨组与BXT组均可明显降低3种胃癌细胞存活率,BXT组呈现剂量依赖,以20%效果最明显(P<0.01)。在铁死亡生化指标方面,与空白组比较,BXT组与卡培他滨组可以显著降低胃癌细胞中线粒体膜电位表达、SOD活性(P<0.01),显著提高LPO、Fe^(2+)的含量(P<0.01),从而提高胃癌细胞对铁死亡的敏感。在Nrf2/GPX4通路方面,与空白组比较,BXT组可以通过降低胃癌细胞中p-GSK3β、Nrf2、GPX4蛋白表达(P<0.01),提高SLC7A11、SLC3A2 mRNA表达(P<0.05),提高胃癌细胞中GSK3β的蛋白表达(P<0.01),提高TP53、TFRC mRNA表达(P<0.05,P<0.01),抑制Nrf2/GPX4通路诱导胃癌细胞发生铁死亡。与卡培他滨组比较,20%BXT组效果更为明显。结论:半夏泻心汤可以通过抑制Nrf2/GPX4通路的诱导胃癌细胞HGC-27、MKN-45、AGS发生铁死亡。