利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。

一株草地贪夜蛾核型多角体病毒新分离物的室内毒力测定与基因组分析

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是我国重要的入侵农业害虫。草地贪夜蛾核型多角体病毒是专一性感染草地贪夜蛾的病原。本研究于江西省南昌市玉米田分离得到一株多粒包埋型草地贪夜蛾核型多角体病毒分离物,命名为草地贪夜蛾核型多角体病毒江西分离物(SfMNPV_JX),其对本地草地贪夜蛾幼虫毒力高,LC 50达到1.634×105 PIB/mL。全基因组测序表明,SfMNPV_JX基因组全长134241 bp,共包含140个ORF,系统发育分析显示,SfMNPV_JX属于α-杆状病毒GroupⅡ,是SfMNPV的一个分离物,与草地贪夜蛾核型多角体病毒哥伦比亚分离物(SfMNPV_Colombian)最为近似,序列相似性为97.85%。上述研究结果为研发绿色高效的草地贪夜蛾生物杀虫剂提供重要依据。

甜菜夜蛾核型多角体病毒颗粒剂制备及其抗逆性能评价

甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)具有专一性和高效性,可以有效控制甜菜夜蛾种群,而且对环境和生态安全。为了提高甜菜夜蛾核型多角体病毒的稳定性,以海藻酸钠为包埋材料,通过优化载体用量和进料速率等条件,采用喷雾法制备了病毒颗粒剂,并对其相关性能进行了表征和评价。结果表明:海藻酸钠质量浓度为1%,进料速率为13mL/min时制备的病毒颗粒剂呈不规则形状,颗粒剂产率79.4%,病毒含量1.0×10^(6)PIB/g,D_(50)在130μm左右。经颗粒剂海藻酸钠包埋的甜菜夜蛾核型多角体病毒具有良好的热稳定性和抗紫外性能,同时不会影响其对甜菜夜蛾幼虫的致病力。

落叶松尺蛾核型多角体病毒形态特征及分子检测技术建立

【目的】落叶松尺蛾核型多角体病毒(Erannis ankeraria nucleopolyhedrovirus,EranNPV)是有效调控落叶松尺蛾种群数量和质量的重要生物因子,明确EranNPV超微形态学结构,研究并建立其精准灵敏的分子(PCR)快速检测技术,有助于深入探究该病毒的传播机制和林间流行规律,从而为利用该病毒持续控制落叶松尺蛾提供技术支撑。【方法】利用扫描电镜和透射电镜对EranNPV多角体的外部形态和内部结构特征进行观察;根据EranNPV的ac54基因设计用于PCR检测的特异性引物EaV,通过多种昆虫病毒的PCR扩增结果验证引物特异性,测试该PCR检测技术体系对EranNPV基因组DNA和病毒悬浮液的灵敏性。【结果】电镜观察结果表明,该病毒多角体多为表面光滑的不规则多面体,少数多角体表面散布孔洞凹陷,平均直径为1.43±0.20μm,多角体内的病毒粒子呈单束分布,平均长度为219.14±17.50 nm;以EaV为引物,只有EranNPV能够扩增到目的条带,利用EaV为引物建立的PCR检测技术对EranNPV基因组DNA的检测灵敏度可达10 fg/mL,对EranNPV悬浮液的检测灵敏度可达1×102 OBs/mL。【结论】EranNPV为典型的单粒包埋型核型多角体病毒,利用EaV引物建立的PCR检测技术具有高度的特异性和灵敏度,有望进一步应用于EranNPV的林间传播和流行病学研究当中。

草地贪夜蛾核型多角体病毒Hub1的稳定性及对草地贪夜蛾的田间防治效果

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是一种破坏性极强的害虫,严重威胁粮食安全。草地贪夜蛾核型多角体病毒Hub1 (S. frugiperda nuclear polyhedrosis virus Hub1,SpfrNPV Hub1)是首个专一性针对草地贪夜蛾的病毒杀虫剂,具有较好的应用前景。本研究采用药膜法评价不同温度、pH值、光照条件等处理对SpfrNPV Hub1活性及稳定性的影响,并开展了20亿病毒包涵体(polyhedral inclusion body,PIB)/mL SpfrNPV Hub1悬浮剂防治草地贪夜蛾田间药效试验。稳定性测定结果表明:SpfrNPV Hub1在pH 4和pH 7,4℃及25℃条件下稳定,在pH9条件下较不稳定,在54℃高温及4000 lx强光照射条件下不稳定。田间药效试验结果显示:20亿PIB/mL SpfrNPV Hub1悬浮剂对草地贪夜蛾有较好的防治效果,制剂用量为1500~1875mL/hm^(2)时,药后7 d和14 d的防效分别达81.18%~82.57%和81.23%~83.06%,持效期长。本研究明确了不同温度、pH值、光照条件对SpfrNPV Hub1活性及稳定性的影响,为指导应用SpfrNPV Hub1防治草地贪夜蛾提供了重要技术支撑。

利用柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达载体系统在柞蚕蛹中表达人生长激素

为探究柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）表达载体一柞蚕蛹表达系统用于表达哺乳动物活性蛋白的可行性，利用该表达系统表达医用蛋白人生长激素（hGH）。构建插入hgh基因的转移表达载体pApM748BE／hgh，将该转移表达载体质粒DNA与病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh’基因组DNA共转染樗蚕（Philosamiacynthiam）培养细胞Pc一01，用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh。采用Westernblotting和ELISA方法，检测到柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV—△ph／-△ph／Aefp／hgh／hgh’后第7天体液中就有hGH明显表达；感染后第13～14天蛹体液中的hGH含量保持较高水平，重组hGH的最高表达量可达251．18肛g／mL；感染后第15～20天仍可以检测到hGH的表达，但表达产物出现降解现象。用活化的人红白血病细胞K562检测利用ApNPV表达载体系统在柞蚕蛹表达的重组hGH的体外活性，结果显示其对K562细胞的增殖具有明显的促进作用。

家蚕Gloverin 2克隆、高效表达及其抗核型多角体病毒感染作用研究

为获得家蚕抗菌肽葛佬素2(BmGloverin 2),并研究其在家蚕抗核型多角体病毒(BmNPV)感染过程中的作用,以经BmNPV诱导的3龄3日家蚕中肠cDNA为模板,根据GenBank上BmGloverin 2基因序列设计特异性引物,克隆出去除信号肽部分(1—18 aa)的BmGloverin 2基因,与表达载体pET-28a(+)连接构建pET28a(+)-BmGloverin 2,对含有pET28a(+)-BmGloverin 2重组质粒的菌株诱导表达,然后对抗菌肽重组蛋白进行Ni-IDA亲和层析、透析及浓缩过滤以获得高浓度目的蛋白;并采用抑菌试验检测BmGloverin 2重组蛋白生物活性;最后,将具有生物活性的BmGloverin 2重组蛋白和BmNPV混合处理4 h后喂食家蚕,并以直接喂食BmNPV和无菌水处理为对照组,以检测BmGloverin 2对BmNPV感染家蚕的影响。结果显示,成功克隆BmGloverin 2基因,并构建重组pET28a(+)-BmGloverin 2;在37℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导表达可获得大量BmGloverin 2重组蛋白,经SDS-PAGE检测其分子质量为19.1 ku,与预期大小相符,经过纯化浓缩最终获得BmGloverin 2重组蛋白;抑菌试验证明,重组BmGloverin 2蛋白具有生物活性;与BmNPV对照组相比,饲喂重组BmGloverin 2蛋白与BmNPV混合液处理组幼虫存活率提高。可见,BmGloverin 2在家蚕抵抗BmNPV侵染中发挥作用。

灰茶尺蠖核型多角体病毒对两种尺蠖的致病性

灰茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis grisescens Nucleopolyhedrovirus,EgNPV)是灰茶尺蠖幼虫的重要病原微生物。为明确其对茶树重要害虫尺蠖类的两个近缘种灰茶尺蠖Ectropis grisescens Warren和茶尺蠖E.obliqua Prout的致病性,进行了一系列的生物测定。结果表明,EgNPV对2龄灰茶尺蠖和茶尺蠖幼虫的剂量对数-死亡机率值回归方程和LC50分别为y=0.943x+0.3582,LC50=8.3×10^(4) PIB/mL;y=0.663x+1.614,LC50=1.3×10^(5) PIB/mL。当使用不同浓度EgNPV处理不同龄期灰茶尺蠖和茶尺蠖幼虫时发现,两种幼虫致死率趋势大致相同;在虫龄一致时,达到相同的致病率,灰茶尺蠖所需的时间比茶尺蠖平均短一天。使用2×106 PIB/mL浓度处理不同代别灰茶尺蠖和茶尺蠖2龄幼虫,在第1、2和第6代,EgNPV对两种幼虫的致死率均大于80%。上述结果表明灰茶尺蠖核型多角体病毒对灰茶尺蠖、茶尺蠖的幼虫都比较敏感,具有致死能力。这为灰茶尺蠖核型多角体病毒的合理应用提供理论基础。

柞蚕核型多角体病毒载体在培养细胞和休眠蛹中的基因表达效果

柞蚕核型多角体病毒(AnpeNPV)作为基因表达载体在柞蚕培养细胞(AnPe细胞)和柞蚕蛹中已经成功地表达出了外来基因,并生产出了大量蛋白质。比较了AnpeNPV与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)基因表达载体在培养细胞和昆虫活体组织内的β-半乳糖苷酶基因表达效果。结果显示,5×105个细胞中β-半乳糖苷酶的最高酶活性分别是AnpeNPV在AnPe细胞为40.9units/ml(TC-100培养液,FBS10%)和59.9units/ml(SF-900Ⅱ培养液),AcMNPV在Sf9细胞为72.4units/ml(TC-100,FBS10%)和66.4units/ml(SF-900Ⅱ)、在High5细胞为326units/ml(EX-CELL405培养液),BmNPV在Bm4细胞为15.1units/ml(TC-100,FBS10%),HycuNPV在SpIm细胞为68.6units/ml(SF-900Ⅱ)。活体组织内β-半乳糖苷酶的最高酶活性分别是柞蚕雌蛹为14.3units/g、雄蛹为11.7units/g,家蚕幼虫是10.1units/g。实验证明AnpeNPV/AnPe的外来基因表达水平与AcMNPV/Sf9和HycuNPV/SpIm相似、比BmNPV/Bm4高、不及AcMNPV/High5;AnpeNPV/柞蚕蛹,其雌蛹比BmNPV/家蚕5龄幼虫的外来基因表达效果好、雄蛹与之无明显差异,说明AnpeNPV基因表达载体无论是在培养细胞还是昆虫活体组织中均可与其他NPV基因表达载体相媲美。柞蚕蛹由于可以机械化、大规模地操作,对于大量生产蛋白质具有更好的应用前景。

柞蚕核型多角体病毒基因表达载体系统的构建与基因表达

柞蚕是一种主要分布在我国东北部山区、野外饲养的经济昆虫,以蛹滞育越冬,其蚕蛹具有个大、容易固定、保存时间长、无须饲养、容易运输等优点。利用柞蚕蛹作为生物反应器生产外来蛋白质,可以进行大规模机械化生产,并可减少操作上的烦琐和劳动力。以柞蚕核型多角体病毒(AnpeNPV)作为基因表达载体,在柞蚕培养细胞(AnPe细胞)和柞蚕蛹中成功地表达了β-半乳糖苷酶基因(LacZ),并利用AnPe细胞筛选、获得了纯化AnpeLacZ重组病毒。该重组病毒在TC-100(含10%FBS)培养的AnPe细胞中,感染后第12天β-半乳糖苷酶达到最高,酶活性为40.9units/ml,在SF-900Ⅱ培养的AnPe细胞中,感染后第18天β-半乳糖苷酶达到最高,酶活性为59.9units/ml,后者表达量稍高,但时间滞后。AnpeLacZ在5℃保存了7个月的柞蚕蛹中,感染后第15天酶活性达到最高,雌蛹为14.3units/g,雄蛹为11.7units/g,雌蛹比雄蛹略高。结果显示,柞蚕核型多角体病毒和柞蚕蛹可以作为一个可以机械化大规模生产的新型杆状病毒基因表达载体系统开发和利用。

美国白蛾核型多角体病毒ORF72原核表达载体的构建、表达及纯化

[目的]根据Ikdea对Hycu NPV全基因组序列的分析,筛选出功能还未被研究的、保守性高的ORF72基因。[方法]将ORF72基因构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。[结果]重组质粒p GEX-4T-1-ORF72的酶切检测以及测序结果均正确,证明重组质粒载体构建成功。通过SDS-PAGE凝胶电泳显示,ORF72蛋白能够与p GEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达,诱导表达后的融合蛋白大小约为38. 2 k Da。优化后的表达条件为:异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为1. 0 mmol·L-1,最佳诱导温度为25℃,最佳诱导时间为4 h,并且该蛋白在大肠杆菌BL21和Rosetta表达菌株中均能很好的表达,但在Rosetta菌株中表达量更高。[结论]成功构建了p GEX-4T-1-ORF72原核表达载体,确定出ORF72融合蛋白最佳诱导表达条件,诱导表达并纯化出ORF72融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定基础。

斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR检测

旨在建立一种快速、可靠的斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒(Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)的分子检测方法,以克服目前常规PCR技术很难检测到斜纹夜蛾成虫带病毒的缺陷。以SpltNPV的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,egt)基因为检测对象,基于该基因序列设计了巢式PCR引物,其中一对外侧引物egt-F/R和一对内侧引物egt1-F/R,并研究斜纹夜蛾成虫带毒的巢式PCR检测可靠性。结果表明:基于egt基因的巢式PCR方法可以特异性扩增SpltNPV的DNA,引物egt-F/R的扩增检测最低限为10-7μg/μL;且基于引物egt-F/R的两轮普通PCR无法检测出成虫带毒,而采用巢式PCR方法可有效扩增出目的egt片段,巢式PCR检测方法的灵敏度比两轮普通PCR检测方法提高2个数量级。因此,本研究成功建立了基于SpltNPV的egt基因的巢式PCR检测技术,该方法为斜纹夜蛾成虫带毒、传毒等流行病学研究提供了可靠的技术支撑。

柞蚕核型多角体病毒载体表达系统基因工程研究进展

柞蚕是一种野外饲养的经济昆虫，它以蛹滞育越冬，主要分布在我国东北部山区。我国柞蚕年产茧量６万ｔ左右，占世界柞蚕茧产量的９０％以上。柞蚕核型多角体病毒（ＡｐＮＰＶ）属杆状病毒科Ａ亚组，是柞蚕脓病的病原体，对柞蚕蛹十分敏感。建立柞蚕核型多角体病毒载体表达系统，以柞蚕蛹为宿主昆虫进行外源基因的大量表达生产，具有成本低、安全、易管理，可工业化生产等特点。本文概述柞蚕核型多角体病毒载体基因工程研究的进展，其中包括核型多角体蛋白基因的克隆，核苷酸序列分析，ｍＲＮＡ起始点的确定，转移载体的组建及所载外源基因在昆虫细胞和柞蚕体内的表达等。

家蚕核型多角体病毒ie-2基因dsRNA表达载体的构建

为了研究ie-2基因的dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果,根据NCBI公布的BmNPV(T3株)基因组序列,克隆了BmNPV极早期表达因子ie-2.将该基因用亚克隆的方法导入到L4440载体中构建L4440-ie-2,并成功转入大肠杆菌HT115(DE3).IPTG诱导可以成功表达相应的dsRNA.

利用柞蚕核型多角体病毒表达系统表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶

谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸。将该基因连接到柞蚕杆状病毒转移载体pApM748BE后与ApNPV-Δph/egfp+共转染Tn-High Five细胞获得重组病毒。将重组病毒注射到柞蚕蛹体内,收集发病蛹血淋巴,用镍离子螯合柱纯化得到纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测表明,ApGFAT蛋白在柞蚕蛹体内得到成功表达,酶活力为0.978μmol/(min·mg)。

用核型多角病毒载体在昆虫细胞中表达人白细胞介素-4

将编码人白细胞介素-4（IL－4）的cDNA插入苜蓿银纹夜蛾单核多角病毒（Autogranhacalifor－nicanuclearpolyhedrosisvirus，AcNPV）的多角体蛋白基因启动子下游，构建表达IL－4的重组病毒。感染该重组病毒的细胞可表达较高水平的IL－4多肽。所表达的重组IL－4具有较高的生物学活性，分子量为16KDa。

柞蚕核型多角体病毒转移载体的组建及外源基因在柞蚕蛹体内的表达

近几年,以昆虫杆状病毒为载体,表达外源基因的研究发展较快。由于杆状病毒载体具有所用的核多角体蛋白基因启动子效率高,外源基因插入容量大;重组病毒对人、畜等安全无害,所表达的外源蛋白的抗原性、免疫源性和生物学功能等均与其天然蛋白质相似等特点,因此,有关这一方面的研究日益受到人们重视。一、组建柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)转移载体的重要意义1983年,美国科学家 G.E.Smith 等采用基因工程技术首先建立了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)载体表达系统,即以AcNPV 为载体,用培养的昆虫细胞(如 Sf9)为宿主进行外源基因的表达。从那以后,该载体表达系统得到了深入的研究和应用。

中红侧沟茧蜂对棉铃虫核型多角体病毒的传播作用

中红侧沟茧蜂Microplitis mediator与核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus, NPV)是棉铃虫Helicoverpa armigera的两种重要生物防治因子。中红侧沟茧蜂传播NPV对于利用二者协同防治棉铃虫具有重要意义。本研究探讨了给中红侧沟茧蜂饲喂含病毒蜂蜜水、体表喷洒病毒液、中红侧沟茧蜂在染毒宿主体内产卵、从染毒宿主体内发育、蜂茧浸泡病毒5种带毒方式的传播病毒效率,以及饲喂带病毒蜂蜜水方式下的传播机制。结果表明,饲喂带病毒蜂蜜水和体表喷洒病毒时中红侧沟茧蜂传毒率较高,在连续传毒的3 d内传毒效率分别为15.1%、9.1%~9.3%、2.4%~4%,其他3种方式传毒效率较低。在田间防治时可以利用中红侧沟茧蜂的传毒作用采用病毒与寄生峰的协同防控策略。

以家蚕核型多角体病毒为载体高效表达天花粉蛋白基因

本文报道以家蚕核型多角体病毒为载体，在家蚕体内高效表达天花粉蛋白基因的结果。天花粉蛋白基因是用ＰＣＲ技术从栝楼基因组中分离的，该基因被插入到家蚕核型多角体病毒转移载体质粒ｐＢｍ—１的多角体蛋白基因启动子下游，构建成重组质粒ｐＢｍＴＣＳ。将重组质粒ＤＮＡ和野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕培养细胞，通过在家蚕培养细胞中进行同源重组和筛选，获得了无多角体的重组病毒ＢｍＴＣＳ。采用ＰＣＲ技术对重组病毒进行了鉴定，证实重组病毒合天花粉蛋白基因。重组病毒对家蚕的感染性不及野生病毒，提示表达产物对病毒的增殖有抑制作用。对重组病毒感染的家蚕血淋巴进行了ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和免疫印迹分析，结果显示在蚕体血淋巴中的表达产物天花粉蛋白占总蛋白的５％。本实验为利用基因工程方法大量生产天花粉蛋白提供了又一条新的途径。

家蚕核型多角体病毒lef-8基因克隆及系统进化分析

【目的】了解云南省德宏州陇川县蚕区家蚕核型多角体病毒(BmNPV)株系的遗传地位和多样性,为厘清云南蚕区BmNPV的起源及科学防控家蚕血液型脓病提供参考依据。【方法】对分离自云南省德宏州陇川县蚕区的BmNPV进行lef-8基因克隆,通过ExPASy、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、NetOGlyc 4.0、NetPhos 2.0及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并基于lef-8基因核苷酸序列相似性,采用MEGA7.0中的邻接法(NJ)构建系统发育进化树。【结果】云南省德宏州陇川县蚕区BmNPV-YNLC株的lef-8基因序列全长2631 bp,共编码876个氨基酸残基;其编码蛋白(LEF-8)无信号肽序列,也不存在跨膜结构域,蛋白分子量为101.63 kD,理论等电点(pI)为8.8;在第750~800位氨基酸残基区域具有较高的疏水性,部分氨基酸位点表现为亲水性,且具有较高抗原指数和表面可及性;存在6个潜在的N-糖基化位点,62个磷酸化位点(25个丝氨酸磷酸化位点,23个苏氨酸酸化位点,14个酪氨酸磷酸化位点),但不存在O-糖基化位点。BmNPV-YNLC株与BmNPV-T3株的lef-8基因核苷酸序列相似性为99.7%,BmNPV-YNLC株lef-8基因在第96~98位核苷酸序列上存在3个碱基(CAA)缺失;此外,还存在2个非同义突变(^(646)T→A和^(1895)C→G)和7个同义突变。基于lef-8基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近,而与我国流行的BmNPV遗传关系较远。【结论】lef-8基因在不同地区来源的BmNPV株系中高度保守,BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近,但其LEF-8蛋白N端存在氨基酸缺失突变,说明BmNPVYNLC株为云南蚕区的新流行株系。