杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白基因的克隆及原核表达

目的:构建杜氏盐藻核基质附着区(MAR)结合蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化融合蛋白。方法:根据GenBank上杜氏盐藻MAR结合蛋白的cDNA全长序列设计出含有特定酶切位点的引物,PCR法获得MAR结合蛋白基因序列全长,将其克隆至载体pMD18-T中。酶切连接到pET-28a(+)上构建原核表达载体pET-MBP,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,Western blotting检验其表达结果。结果:重组质粒经酶切、PCR、测序鉴定,成功构建了原核表达载体pET-MBP,对表达的融合蛋白的Western blotting分析结果表明表达的蛋白质为目的蛋白。Ni2+亲和层析法纯化蛋白质,纯化后目的蛋白在总蛋白中的含量约为70%。结论:成功地克隆杜氏盐藻MAR结合蛋白基因的全长并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,且纯化了MAR结合蛋白的融合蛋白。

杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白cDNA片段的克隆及序列分析

目的:克隆杜氏盐藻核基质附着区(MAR)结合蛋白片段。方法:根据多种生物MAR结合蛋白氨基酸的高度保守序列EWYGWHF和KYGLIYQ,设计一对简并引物,以杜氏盐藻的cDNA为模板,进行PCR扩增,PCR产物与T载体相连,转化大肠杆菌JM109后,筛选鉴定,对阳性菌落进行测序分析。将测序结果推导成氨基酸序列,与GenBank上其他物种MAR结合蛋白序列进行同源性分析。结果:在杜氏盐藻中得到的cDNA片段,核苷酸长度为474bp,编码158个氨基酸(GenBank收录号为DQ124215)。推导的氨基酸序列与稻、莲、拟南芥、豌豆、烟草、酵母、果蝇和蟾的MAR结合蛋白相比较,同源性分别为74%、73%、73%、73%、71%、70%、68%和67%。结论:所克隆的序列可能为杜氏盐藻MAR结合蛋白片段。

杜氏盐藻核基质附着区的分离及特征性分析

采用0.5%TritonX 100破碎细胞,15%Percoll分离盐藻细胞核,25mM二碘水杨酸锂(lithiumdi iodosalicylate,LIS)抽提核蛋白,限制酶消化除去结合松弛的DNA,蛋白酶K SDS处理,酚/氯仿抽提,乙醇 沉淀提取核基质附着DNA,限制酶酶切连至pUC18载体上构建MARs文库。随机挑选6个克隆进行体外结 合实验筛选,筛选出一能与核基质结合的克隆,测序分析结果表明该序列具明显的MAR序列特征。

核基质附着区广泛参与基因组三维结构折叠的生物信息学分析

在细胞分裂间期,每条染色质都占据着特定的染色质领域(chromosome territory,CT)。每个CT领域内进一步分成不同的拓扑学相关区域(topological associated domain,TAD),每个TAD又由若干子TAD(sub-TAD)构成。不同的TAD相互聚集,形成基因活跃表达和不表达的A、B两种组份或区室(compartment)。然而,目前对于染色质折叠方式及维持机制的研究尚无定论。核基质附着区(matrix attachment regions,MARs)是在不同物种基因组中广泛存在的一类富含AT序列的与核基质结合的DNA元件,能够通过与CTCF、SATB1等调控蛋白质相互作用,对远距离的基因表达进行调控。本研究以染色质三维结构为背景,通过整合染色质三维结构及组蛋白修饰等组学数据,对MARs元件与染色质三维结构的关系进行研究,对MARs元件参与形成的相互作用网络的结构及功能进行探索。结果发现,MARs元件与染色质三维结构高度相关,而且在高强度相互作用中占据较大的比例,提示MARs元件在染色质折叠方面发挥作用。此外,通过拓扑结构聚类分析还首次揭示,MARs元件分为不同类型,包括维持染色质领域及空间构象等的结构单元部分,以及调控基因表达等的功能单元部分。这表明,MARs元件在基因组三维高级结构的建立、维持以及功能等方面发挥重要作用。

牛乳腺核基质附着区的克隆及其功能研究

从奶牛的全血中提取基因组DNA,参照GenBank已有序列,通过Prim er5.0和Vector 7.0辅助设计一对引物,克隆了牛乳腺核基质附着区(BMR s)。利用生物学软件对其进行初步分析后,TA克隆于pMD 18-T vector上。上下游引物5′端分别引入Kpn2Ⅰ和XhoⅠ酶切位点,将所得的BMR s克隆到pEGFP-C1的报告基因下游,构建成表达载体pBE,脂质体法转染牛耳成纤维细胞。以转染pEGFP-C1的牛耳成纤维细胞作为对照,发现所克隆的BMR s功能明显,在消除位置效应、增强报告基因表达方面具有一定的作用。

核基质附着区(MAR)调控的人胰岛素样生长因子(hIGF-1)转基因兔的制备

用ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子－１（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６只受体兔，有８只妊娠，共产下１９只活仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ，应用ＰＣＲ技术分析其外源基因整合情况，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ条带）。再对８只阳性兔的ＰＣＲ产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，得到５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１外源基因的转基因兔，转基因整合率为２６．３％（５／１９）。用１只阳性转基因公兔（５０２号）繁殖了６窝，共获得４２只仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ后，如上用ＰＣＲ分析和做Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，Ｆ１代中有５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１融合基因。

人β-珠蛋白核基质附着区介导表达载体稳定附着于中国仓鼠卵巢细胞

目的研究人β-珠蛋白核基质附着区是否能够介导表达载体稳定附着于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。方法人β-珠蛋白MAR序列克隆到pEGFP-C1构建重组质粒载体pEGFP-MAR,转染CHO细胞,使用Hirt裂解法提取细胞中附着体质粒,CaCl2法转化附着体质粒到宿主大肠杆菌DH5ɑ中,提取质粒,酶切,测序分析。结果还原质粒双酶切和单酶切结果均与转染前质粒酶切结果一致;测序分析得知还原质粒与转染前质粒中插入片段DNA序列相同。结论人β-珠蛋白MAR序列重组载体在CHO细胞中以附着体形式被完整还原出来。还原质粒酶切结果和测序结果均与转染前质粒一致。

Alpha 1抗胰蛋白酶核基质附着区增强RNA聚合酶Ⅱ依赖的转录

核基质附着区是一种真核生物的DNA元件,能调控染色体结构和活性。为研究体内MAR相关的染色质准入和转录调控,从人基因组中克隆了Alpha1抗胰蛋白酶核基质附着区(α1-ATMAR)并将其连入pEGFP-C1载体。分别以空载体和携带MAR的载体通过脂质体法转染人胚肾293细胞系。经G418筛选20天的细胞池用作实验分析。半定量RT-PCR及荧光显微镜观察显示此MAR能够增强临近基因的表达。进一步用染色质免疫共沉淀(ChIP)共定位CMV启动子和RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ),PCR结果显示存在MAR元件时,更多的RNA聚合酶Ⅱ被富集到启动子区。ChIP方法可用于证实MAR介导的转录激活,在实时检测方面比RT-PCR提供了更多动力学信息。这项技术为进一步研究基因表达调控提供了技术平台。

核基质附着区结合蛋白与皮肤鳞状细胞癌的相关性研究

目的探讨核基质附着区结合蛋白（MARBP）与皮肤鳞状细胞癌（SCC）的相关性，筛选相关性较高的MARBP。方法以取材自2例SCC患者正常皮肤组织和HaCaT细胞作为对照，应用RT—PCR方法，检测部分已知与肿瘤相关的MARBP（CUX1、LaminB1、Nucleolin、hnRNPU、SAFB2、SATB1、YBX1）mRNA在12例SCC肿瘤组织和瘤旁组织、人皮肤鳞状细胞癌细胞系Colo-16细胞、人表皮癌A431细胞的表达水平。结果所有被检测的MARBPmRNA在2例正常皮肤组织均未见明显表达，在12例SCC肿瘤组织和瘤旁组织、Colo-16、A431细胞系中均有不同程度和不同比例的表达，在HaCaT细胞系中，除SATB1外，其余MARBPmRNA均有表达。SCC肿瘤组织和瘤旁组织MARBPmRNA表达水平的比较显示CUX1、Nucleolin和YBX1差异有统计学意义；LaminB1、hnRNPU、SAFB2和SATB1差异无统计学意义。结论CUXl、Nucleolin和YBX1等MARBPrnRNA可能参与SCC的发生、发展；

杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的细胞定位

为研究核基质结合区结合蛋白的功能及调控机制,PCR扩增杜氏盐藻MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列,与绿色荧光蛋白基因融合构建真核表达载体,脂质体转染CHO细胞,Western blotting和荧光显微镜检测基因表达情况和细胞定位。结果显示:MBP及N端和C端融合蛋白成功在CHO细胞表达,MBP和C端部分定位于细胞核且聚集于核仁,N端部分分布整个细胞,说明MBP定位于细胞核且细胞定位信号位于C端,MBP可能与rRNA前体结合发挥作用。

新辅助化疗对胃癌细胞超微结构及核基质结合区结合蛋白质1表达的影响

目的探讨新辅助化疗对胃癌细胞超微结构的影响与对胃癌组织中核基质结合区结合蛋白质1(Special AT rich sequence binding protein 1,SATB1)表达的关系。方法对2013年12月至2015年12月江苏省中医院消化系肿瘤外科60例进展期胃癌患者术后癌组织进行超微结构观察,60例中40例行新辅助化疗,其中20例用介入途径(介入组),20例用静脉途径(静脉组),另20例直接行手术治疗为对照组。同时检测新辅助化疗前、后胃癌组织及癌旁组织SATB1的免疫组化表达。结果对化疗敏感的病例癌细胞的细胞器严重损伤,包括核固缩、线粒体和内质网肿胀;对化疗不敏感的病例癌细胞的细胞器未受破坏或仅轻度损伤,其中介入组细胞损伤程度高于静脉组(P=0.047)。在癌细胞损伤明显的病例中,SATB1的表达更加明显(P=0.035)。结论介入法新辅助化疗对胃癌细胞的损伤作用更大。SATB1的表达与胃癌细胞损伤程度相关,可作为评估新辅助化疗疗效新的标志物。

人T细胞基因组随机MARs的分离、克隆及序列分析

目的 分离、克隆人基因组随机MARs片段 ,分析其序列特征 ,为进一步研究MARs在真核细胞DNA复制及基因表达调控中的作用与机制奠定基础。方法 用DNaseⅠ、高盐和蛋白酶K处理细胞核 ,分离人T细胞基因组随机MARs片段 ,并将其克隆进入PUC19质粒 ;用体外结合实验筛选能与核基质蛋白结合的克隆并测序 ,生物信息学分析其序列的特征。结果 从人T细胞基因组中分离得到大量的MARs片段 ,构建成MARs库 ,初步任意挑选 5 8个克隆 ,体外结合实验证实其具有与核基质蛋白结合活性 ,对其中 1个克隆的序列分析表明 ,其序列AT含量较高 ,不仅含有AC 和ATAT基序 ,还包含有多个转录 复制起点、增强子序列、弯曲DNA和扭结DNA基序以及多个反向重复序列。结论 分离获得的DNA片段具有MAR的特性 ,同一DNA序列中存在不同的元件组合 ,其参与基因表达调控的功能应该是复杂。

S/MAR与基因表达

在真核生物的细胞核内 ,基因组是通过 DNA的核骨架附着区 ( SAR)或称核基质附着区( MAR) (简记为 S/MAR)锚定在核骨架网状系统上的 .S/MAR既有一定的特征 ,又有多样性 ,研究认为它参与了 DNA复制调控和转录调控等多种核内生化过程 .通过重组 ,在目的基因一侧或两侧带上 S/MAR后作基因转染或转基因动植物 ,发现整合后的基因表达有时可增强几倍 ,甚至上万倍 ,和 /或显示位置独立效应 .有些研究还报道 ,S/MAR能克服转基因在传代过程中存在的转基因沉默的问题 .这些功效使得 S/MAR将可能成为基因工程中一个有用的顺式调控元件 .本文报道了关于

高效整合转基因兔研究

用含有核基质附着区（ＭａｔｒｉｘＡｔｔａｃｈｍｅｎｔＲｅｇｉｏｎｓ，ＭＡＲ）的鸡珠蛋白基因与含有鼠金属硫蛋白（ＭＴ）基因启动子的人－类胰岛素促生长因子１（ｈ－ＩＧＦ－１）基因构建表达了载体。研究了ＭＡＲ对转基因兔整合率的影响。结果表明，带有ＭＡＲ的表达载体转基因兔整合率达到２６．３％，为一般不含ＭＡＲ构件转基因克整合率的两倍，对提高转基因动物生产效率，将起到重要作用。

MAR介导的非病毒附着体载体的研究进展

附着体载体可以使外源基因在宿主细胞中不整合到基因组上而是以附着体的形式存在,是一种新型的高效、安全、附着体表达载体。目前研究较多的是由S/MAR(Scaffold/Matrix Attachment Region,S/MAR)元件介导的质粒。虽然此类载体均能介导载体附着存在,但是转基因的表达量不同。最近研究发现,载体的启动子、骨架结构、CpG基序以及表达系统等方面能够影响转基因的表达,针对以上内容作一综述,希望据此进一步优化载体,为临床研究提供基础依据。

特异AT序列结合蛋白1与肿瘤关系的研究进展

特异AT序列结合蛋白1(special AT rich sequence binding protein,SATB1)是一种组织特异性的核基质结合蛋白,参与了染色质高级结构的形成和组织特异性基因的表达调控,并通过与核基质附着区(matrix attachment regions,MARs)序列结合以促进基因重组和染色质重建,从调节组蛋白乙酰化和甲基化水平等多种途径对基因的表达进行调控,在免疫调节、凋亡调控和肿瘤转移方面发挥重要的作用。本文将近年来有关SATB1与肿瘤关系的研究进展作一综述。

欧洲黑杨MARs的分离克隆及序列分析

为获得林木植物核基质附着区(MARs)序列,诱导欧洲黑杨(Populus nigra)愈伤组织并制备悬浮细胞,裂解释放细胞核,除去非MARs的游离DNA片段,得到核基质。碱性缓冲液分离残留DNA与结合蛋白,回收并克隆残留DNA,测序后得到两个具有MARs序列特征的DNA片段A7和A23。序列特征分析结果表明它们都含有MARs的特征基元,通过与其他已发表的MARs序列比较,认为是从杨树中分离到的两个MARs片段,并预测了其功能。该研究是首次从木本植物获得MARs序列。

豌豆MAR的分离及其功能分析

从3个不同品种豌豆中分离获得3个具有MARs序列特征的DNA片段MMAR、DMAR、HMAR。根据GenBank同源性搜索结果,发现这些片段均为未注册的DNA序列。经转化烟草并测定其GUS活性,结果发现两侧顺式重复连接MAR对外源基因的表达具有明显的增强作用,MMAR、HMAR和DMAR均不同程度提高了GUS的表达,分别为载体对照植株的4.16、3.66和2.08倍,但不同转化体间表达水平差异仍比较明显。

重组中国仓鼠卵巢细胞表达系统高效表达载体研究进展

生物制药是21世纪高科技产业,治疗性重组蛋白的生产是生物制药的重要部分。宿主细胞以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用途最为广泛,近70%宿主细胞是用CHO细胞表达系统生产的。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多,其中表达载体是重要因素之一。构建重组CHO细胞表达系统高效表达载体可以利用核基质附着区、泛在染色质开放元件,构建特定位点重组载体系统,以及选择合适的内部核糖体进入位点及弱化筛选标记等实现。CHO细胞表达高效载体构建涉及多个因素,需要进行不同元件的优化,才可达到高效表达。

SATB1及wnt/β-catenin信号通路相关分子在子痫前期胎盘组织中的表达及意义

目的：探讨富含AT序列的特异性结合蛋白1（SATB1）及蛋白（wnt）/β连环蛋白（β-catenin）信号通路相关分子在调控滋养细胞侵袭以及在子痫前期发病中的作用。方法收集2013年3月-2014年3月在重庆医科大学附属第一医院行人工流产术的20例孕8-10周孕妇的绒毛组织（早孕组）；同期在妇产科住院行水囊引产的18例中孕期（孕18-20周）孕妇的胎盘组织（中孕组）；同期行择期剖宫产术的20例健康足月妊娠孕妇的胎盘组织（正常足月组）；同期住院行选择性剖宫产术分娩的20例子痫前期孕妇（孕33-38周）的胎盘组织（子痫前期组）。采用免疫组化SP法检测各组绒毛或胎盘组织中SATB1及β-catenin的蛋白表达定位；采用蛋白印迹法检测各组绒毛或胎盘组织中SATB1及β-catenin的蛋白表达水平；采用细胞免疫荧光法检测SATB1及β-catenin在滋养细胞株HTR8/SVneo细胞中的定位表达，并对细胞中SATB1及β-catenin蛋白表达水平进行检测；采用免疫共沉淀法检测子痫前期组胎盘组织和缺氧/复氧组HTR8/SVneo细胞中的SATB1与β-catenin的相互关系；采用明胶酶谱法检测子痫前期组和缺氧/复氧组细胞中基质金属蛋白酶（MMP）2、9的活性水平。结果（1）正常足月组胎盘组织合体滋养细胞结节和纤维素样坏死很少见，毛细血管数目丰富；子痫前期组胎盘组织可见合体滋养细胞胞核空泡化明显，有较多纤维素样坏死，绒毛内微血管数目减少。（2）各组绒毛或胎盘组织中均可见SATB1棕黄色染色颗粒，子痫前期组胎盘组织中SATB1阳性染色强度较正常足月组明显减弱。（3）各组绒毛或胎盘组织中均可见β-catenin蛋白的表达，子痫前期组胎盘组织中β-catenin阳性染色强度较正常足月组减弱。（4）早孕组、中孕组、正常足月组及子痫前期组中SATB1蛋白表达水平分别为0.300±0.009、0.271±0.015、0.238±0.018及0.153±0.007；β-catenin蛋白表达水平分别为0.743±0.041、0.648±0.021、0.549±0.069及0.269±0.047。子痫前期组SATB1及β-catenin蛋白表达水平均较早孕组、中孕组、正常足月组明显下降，分别比较，差异均有统计学意义（P〈0.05）。（5）常氧组及缺氧/复氧组SATB1蛋白定位于细胞滋养细胞的胞核中，缺氧/复氧组细胞的荧光强度较常氧组细胞明显减弱；常氧组及缺氧/复氧组β-catenin蛋白定位于细胞滋养细胞的胞核及胞质中，缺氧/复氧组细胞的荧光强度较常氧组细胞明显减弱。（6）常氧组细胞SATB1及β-catenin蛋白表达水平分别为0.213±0.005和0.797±0.081，而缺氧/复氧组分别为0.083±0.021和0.543±0.131。两组分别比较，差异均有统计学意义（P〈0.05）。（7）子痫前期组胎盘组织中和缺氧/复氧组细胞中经SATB1抗体免疫共沉淀后的蛋白复合物中，均可检测到β-catenin蛋白的表达；同样，经β-catenin抗体免疫共沉淀后的蛋白复合物中，也均可检测到SATB1蛋白的表达。（8）子痫前期组胎盘组织中MMP-2、9活性水平分别为2.251±0.310、1.447±0.102，正常足月组分别为7.098±0.451、5.502±0.197，两组分别比较，差异有统计学意义（P〈0.05）。缺氧/复氧组细胞中MMP-2、9活性水平分别为0.471±0.104、0.297±0.103，常氧组分别为0.842±0.209、0.595±0.100，缺氧/复氧组细胞明显低于常氧组，分别比较，差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论子痫前期胎盘组织中SATB1表达水平下降，可能是通过调控wnt/β-catenin信号通路而影响MMP-2、9的活性水平改变，使滋养细胞的侵袭力减弱，最终导致子痫前期的发生。