HBV-TRL重组腺病毒载体的抗病毒活性

目的:观察有linker插入的乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBVTRL)重组腺病毒载体(RAd)对HBV复制的抑制作用.方法:以第四军医大学病原生物学教研室已构建的pcDNA3.1(-)/TRL,TR,TRmut,HBVc和hEDN为基础,分别将目的片段TRL,TR,TRmut,HBVc和hEDN插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒共转染HEK293细胞,重组产生含各目的片段的复制缺陷型腺病毒,即RAd/TRL,TR,HBVc和hEDN,经鉴定、扩增及滴度测定.其中RAd/TRL,TR为实验组,其余重组腺病毒为对照组.将获得的重组腺病毒感染HepG2.2.15细胞后通过间接免疫荧光检测重组腺病毒在细胞中的表达,并应用荧光定量PCR法检测细胞上清中HBVDNA含量.同时,应用MTT比色法检测细胞的代谢活性.结果:成功获得了含TRL,TR,HBVc和hEDN等不同目的片段的复制缺陷型腺病毒载体.RAd/TRL在HepG2.2.15细胞中得到有效表达,并且明显降低了细胞上清HBVDNA含量,与RAd/TR相比(P=0.0266,P<0.05),与其他对照组相比(P<0.01).MTT比色分析表明细胞代谢活性未受到影响(P>0.05).结论:成功地构建了RAd/TRL,其有效表达成功地抑制了HBV的复制.

严重急性呼吸综合征冠状病毒核衣壳蛋白对环氧合酶-2表达的影响

目的 探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）核衣壳蛋白对环氧合酶-2（COX-2）表达的影响.方法 将带有COX-2基因启动子的报告质粒分别与表达SARS-CoV基因组的单个基因的质粒共转染293T细胞,并测定荧光素酶的活性,采用RT-PCR和Western印迹法检测COX-2 mRNA和蛋白表达的变化.结果 SARS-CoV核衣壳蛋白能显著激活COX-2基因启动子的活性,并在mRNA和蛋白水平上调COX-2的表达,且这种激活作用随着核衣壳蛋白浓度的增加而增强.结论 SARS-CoV核衣壳蛋白能特异性地激活COX-2的表达.

上海地区2009年上半年手足口病患儿肠道病毒71病毒壳体蛋白VPI基因的检测与亚型分析

目的 了解2009年4月至5月肠道病毒（EV）71在上海地区儿童手足口病（HFMD）中的分子流行病学特点.方法 收集2009年4月至5月在复旦大学附属儿科医院临床诊断为HFMD的95例住院患儿咽拭子标本73份与粪便标本38份,采用TaqMan实时RT-PCR及套式RT-PCR进行EV71病毒壳体蛋白VP1基因检测,并进行基因测序分析.结果 73份咽拭子标本中,EV71阳性6份,检出率为8.2%;38份粪便标本中,EV71阳性24份,检出率为63.2%.28份套式RT-PCR阳性标本基因测序分析结果显示,27株为C4亚型,为绝对优势流行株,另有一株为C2亚型株;1例死亡患儿分离株为C4亚型,其VP1基因序列未见明显变异.结论 EV71是上海地区2009年4月至5月儿童HFMD的重要病原体,C4亚型株占绝对优势地位,同时伴有C2亚型株的流行.

重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组汉滩型病毒（Hantaanvirus，HTNV）核蛋白（recombinant HTNV nuclear protein，rHTNNP）和重组汉城型病毒（Seoulvirus，SEOV）核蛋白（recombinant SEOV nuclear protein，rSEONP），并进行纯化。方法从HTNVPS-6株和SEOVL-99株灭活病毒液中提取总RNA，依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物，用逆转录PCR法扩增此S基因片段，构建原核表达质粒pET-Trx-his—HTNNP和pET-Trx-his—SEONP，并在大肠埃希菌中诱导表达。表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后，用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性。结果重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确。表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26000，表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％，主要以可溶性形式表达，且纯度可达约70％。双向免疫扩散试验证实，这2种重组蛋白具有较好的抗原性。结论成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒，并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP，为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础。

深圳地区儿童呼吸道感染人类偏肺病毒检出及鉴定

目的应用呼吸道感染常见病毒快速筛查技术检测人类偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV），并对检出的hMPV进行分子生物学鉴定。方法采用Luminex100多功能悬浮点阵检测技术和多重PCR技术同时筛查检测呼吸道合胞病毒、流感病毒、人类偏肺病毒等7种病毒、11个亚型。人类偏肺病毒的鉴定采用hMPV核蛋白基因特异性片段PCR扩增、核酸测序，并进行进化树分析。结果47份临床标本共筛查出病毒19株，检出率40．2％（19／47），其中呼吸道合胞病毒8份、占检出病毒的42．1％（8／19），流感病毒7份（占36．8％），副流感病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、人类偏肺病毒各1份（占5．3％）。检出的这例人类偏肺病毒为深圳地区首例，经hMPV核蛋白基因特异性片段核酸序列分析，其与hMPV日本株、北京株、泰国株的同源性〉98％。进化树分析表明深圳株的病毒核蛋白基因与北京株、日本株、泰国株等在同一基因进化簇中。结论人类偏肺病毒可能是儿童呼吸道感染的主要病毒之一，应引起临床的重视。多功能悬浮点阵和多重PCR技术对病毒感染性疾病的快速筛查具有实用价值，尤其在解决流行病病原学分析方面具有重要意义。

SARS冠状病毒N蛋白基因的表达及其在SARS诊断中的应用

目的获得重组SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白抗原,建立特异性诊断SARS病毒感染的免疫学方法。方法大肠埃希菌中表达SARS病毒N蛋白基因,用金属螯合层析纯化N蛋白,建立检测SARS抗体的ELISA方法。结果大肠埃希菌中表达了SARS病毒全长N蛋白抗原,经包涵体洗涤和金属螯和纯化后得到纯度较高的重组蛋白。用重组抗原ELISA检测30名SARS患者抗体全部为阳性,30名正常人血清为阴性,30名发热非SARS患者血清为阴性。结论SARS表达核蛋白可以在大肠埃希菌中得到高效表达,纯化的重组N蛋白具有良好抗原性,可用于检测SARS抗体。

汉坦病毒体外感染乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞

目的证实乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞是汉坦病毒属（HV）汉滩病毒（HTNv）和汉城病毒（SEOV）感染的靶细胞，观察病毒感染星形胶质细胞后的动态变化。方法建立乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养体系，用HTNV76-118和SEOVL99分别感染乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞，免疫荧光染色、Western印迹和RT-PCR检测病毒感染细胞后病毒NP和S基因片段的变化。结果成功建立了乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养体系，并通过免疫荧光染色、Western印迹和RT-PCR证实HTNV76—118和SEOVL99可以感染离体培养的乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞，随感染时间推移，病毒感染细胞数和病毒量显著增加。结论乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞可作为HTNV和SEOV感染的靶细胞，这为研究。肾综合征出血热发病机制提供了实验平台。

甲型流行性感冒病毒抗原酶联免疫吸附检测试剂盒的研制及应用

目的 研制检测靶位针对甲型流行性感冒（流感）病毒核蛋白的甲型流感病毒抗原检测试剂盒,建立能检测甲型流感病毒所有亚型的方法.方法 采用双抗体夹心法检测标本中的甲型流感病毒,建立甲型流感病毒抗原ELISA方法,并对该试剂盒的灵敏性、特异性、精确性、稳定性进行测试和临床考核.结果 甲型流感病毒抗原ELISA试剂盒核蛋白检测下限为7.63 ng/Ml,灵敏度是血球凝集方法的256倍,是美国Quickdel公司胶体金产品的16倍;与乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、副流感病毒Ⅰ/Ⅲ型、肺炎支原体、鸡新城疫病毒、鸡法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒均无交叉,特异度为100%;批内、批间变异系数（CV）值均〈15%,符合国家标准;在4℃以下的稳定性可达1年,能通过37℃7 d加速试验.可检测亚型分别为H1N1、H3N2、H5N1和H9N2的甲型流感病毒.人流感病毒临床试验表明,与常规细胞培养方法比较,阳性符合率为93.44%,阴性符合率为99.31%;禽流感病毒临床试验表明,与常规细胞培养方法比较,阳性符合率为95.45%,阴性符合率为98.09%.结论 甲型流感病毒抗原ELISA试剂盒灵敏性、特异性强,可用于人甲型流感病毒和禽流感病毒感染的流行病学调查.