α_(1A)-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2稳定共表达细胞的构建

目的建立α_(1A)-肾上腺素能受体(α_(1A)-AR)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)稳定共表达细胞。方法①将pcDNA3.1-α_(1A)-AR-3×FLAG重组质粒转染至U2OS-EGFPNFAT2细胞,经潮霉素B(Hygro-B)200 mg·L^(-1)压力筛选后加入α_(1A)-AR激动剂去甲肾上腺素(NE,10μmol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测细胞核内绿色荧光强度,验证EGFP-NFAT2核转位,筛选得到稳定表达α_(1A)-AR的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测该细胞和对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中α_(1A)-AR mRNA和蛋白的表达水平。③将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞接种于96孔板,分别加入NE(10^(-8)~10^(-5) mol·L^(-1))或α2-AR激动剂右美托咪定(DMED,10^^(-8.8)~10^(-5) mol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位。④将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞分为溶剂对照组、α1-AR拮抗剂萘派地尔(1μmol·L^(-1))组、NE(1μmol·L^(-1))组、萘派地尔+NE(各1μmol·L^(-1)共孵育)组、α2-AR拮抗剂阿替美唑(0.1μmol·L^(-1))组、DMED(0.1μmol·L^(-1))组、阿替美唑+DMED(各0.1μmol·L^(-1)共孵育)组和萘派地尔+DMED(萘派地尔1μmol·L^(-1)与DMED 0.1μmol·L^(-1)共孵育)组,药物孵育时间均为30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位,验证该细胞α_(1A)-AR功能的特异性。结果①Hygro-B压力筛选得到58株U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞,NE 10μmol·L^(-1)孵育后,其中50号细胞核内绿色荧光强度最强,故选定其为稳定共表达α_(1A)-AR和EGFPNFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②Western印迹法结果显示,U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞可明显表达α_(1A)-AR蛋白,而对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中未见α_(1A)-AR蛋白表达。RT-qPCR结果显示,该细胞在传代5~20代内α_(1A)-AR mRNA均稳定表达,其表达水平为对照细胞的500~800倍。③NE或DMED使U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞中EGFP-NFAT2核转位明显增加,半数有效浓度(EC50)分别为5.94×10^(-7)和6.15×10^(-8) mol·L^(-1)。④与溶剂对照组和萘派地尔组比较,NE组U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),而萘派地尔+NE组EGFP-NFAT2核转位较NE组明显减弱(P<0.01)。与溶剂对照组和阿替美唑组比较,DMED组EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),阿替美唑+DMED组EGFP-NFAT2核转位与DMED组比较无明显差别,而萘派地尔+DMED组EGFP-NFAT2核转位较DMED组明显减弱(P<0.01)。结论成功构建稳定共表达α_(1A)-AR和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFPNFAT2-α_(1A)-AR细胞,可用于靶向α_(1A)-AR化合物筛选和受体分子机制研究。

核因子-κB活化在重症急性胰腺炎大鼠肺损伤中的作用

本研究通过重症急性胰腺炎(SAP)模型，探讨核因子-kB(NF-kB)活化在大鼠SAP肺损伤发病中的作用。

类固醇受体辅活化子-3缺失对核因子-κB表达及活性的影响

目的观察类固醇受体辅活化子（SRC）-3蛋白缺失对脂多糖（LPS）诱导的炎症反应中核因子-KB（NF—KB）表达及活性的影响。方法健康清洁野生型（SRC-3＋/-）小鼠、SRC-3基因敲除（SRC-3-/-）小鼠各20只，雌性，体质量约20g，分为SRC-3＋/-组和SRC-3-/-组，每组设正常（N）、1h、4h、12h四个时相点，每个时相点各5只小鼠。采用腹腔注射5mg／kg体质量LPS构建炎症反应动物模型，Westernblot测定肝组织IKB-α、NF—KBp65／p50和干扰素调控因子-1（IRF-1）的蛋白表达。结果LPS刺激后早期两组小鼠肝组织IKB—d蛋白水平显著降低，其中SRC-3＊/＊组小鼠下降更明显；两组小鼠肝组织NF—KBp65／p50蛋白表达和核转位程度均显著增加，其蛋白表达水平SRC-3。组小鼠高于SRC-3＋/＋组，而核转位程度却显著低于SRC-3＊/＊组；无论是SRC-3＋/＋组还是SRC-3。-组小鼠，LPS刺激引起IRF-1蛋白表达水平显著增加，在相应时相点SRC-3。-组小鼠均显著低于SRC-3＋/＋组。结论SRC-3可通过干预NF—KB的活性来调控炎症反应，其蛋白缺失减轻炎症反应程度可能是其导致IKB—α降解障碍和NF—KB活性下降所致。

活化的T细胞核内因子(NFAT)的调节及其在神经系统中的功能

活化的T细胞核内因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)作为细胞信号转导通路中的一类重要的转录因子参与细胞功能的调节.NFAT的活化主要是通过细胞内钙/钙调神经磷酸酶(Ca2+/calcineurin)的刺激启动,它脱磷酸后发生核转位并与DNA的特定序列结合,同时通过与其它转录因子的协同作用,调节目的基因的特定表达.NFAT在免疫系统中所调节的基因表达已经得到了充分的研究.近年实验研究发现,NFAT的转录因子家族在脊椎动物的神经系统中也发挥着非常重要的作用.本文综述了NFAT家族蛋白的分类、结构、磷酸酶与激酶对其出入核的调节及在神经系统中的研究进展,使得能够更加全面地认识calcineurin/NFAT信号通路的作用.此外,由于环孢菌素A(cyclosporin A)等药物在神经系统应用的局限性,对于NFAT调节深入研究,也将为筛选或者开发更为高效、低毒药物提供新的思路.

TNF-α干预内皮细胞后MAPK与NF-kB之间关系的研究

目的：研究肿瘤坏死因子（TNF-α）干预下人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）核因子-kB（NF-kB）活性的变化情况及其与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路之间的关系。方法：培养HUVEC用TNF-α干预,观察NF-kB活性和抑制物IkBα表达,并观察胞外信号调节激酶抑制剂PD098059、C-Jun氨基末端激酶抑制剂SP600125、P38MAPK抑制剂SB203850和PDTC对TNF-α激活内皮细胞NF-kB的影响,用凝胶迁移实验测定NF-kB活性,Western Blotting检测其抑制物IkBα的表达情况。结果：10ng/mL的TNF-α处理30min后NF—kB活性开始增强,4h后恢复正常,IkBα的表达在30min开始下降,4h恢复正常;PD098059和SP600125预处理组NF-kB的活性没有减弱,SB203850与PDTC预处理组NF-kB活性减弱并减弱程度相同。结论：在体外培养的HUVEC中,TNF-α通过降解IkBα而活化NF-kB,P38MAPK通路参与了这一过程。

核因子-κB的活化在急性胰腺炎大鼠的中性粒细胞凋亡延迟中的作用

重症急性胰腺炎（SAP）是一个死亡率极高的疾病，O’Neills等^[1]研究结果表明，SAP时外周血中性粒细胞（PMN）凋亡受到抑制。核因子-kB（NF-xB）作为一个重要的核转录因子，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。本研究旨在观察NF-KB的活化在SAP大鼠外周血PMN凋亡中的调控作用。

沉默Periostin基因调节小鼠成骨细胞代谢对抑制破骨活性的作用

目的通过观察沉默Periostin后小鼠成骨细胞中特异性转录因子(Runx2)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)及骨保护素(OPG)表达变化,探讨其影响破骨活性的分子机制。方法将小鼠成骨细胞株(MC3T3-E1)分为实验组和对照组,实验组使用LVpFU-GW-016PSC66473-1病毒转染,对照组用pFU-GW-016PSC53349-1病毒,保持两组细胞状态相当。用MDC法检测基因沉默效果,Western blot法检测两组细胞Runx2、RANKL和OPG蛋白表达情况。结果沉默Periostin后发现:实验组荧光表达较对照组明显增强(P<0.01);实验组Runx2和RANKL蛋白表达较对照组明显下调(P<0.05);OPG蛋白表达较对照组显著升高(P<0.05)。结论沉默Periostin可改变小鼠成骨细胞RANKL和OPG表达,并可能通过核因子-κB(NF-κB)信号通路介导影响Runx2基因,增强成骨细胞功能并抑制骨破坏。

基于胃黏膜MyD88、ATF2、NF-κB蛋白表达情况分析化浊解毒方加减治疗慢性萎缩性胃炎的机制

目的:基于胃黏膜髓样分化因子88(MyD88)、活化复制因子2抗体(ATF2)、核因子-kB(NF-κB)蛋白表达情况分析化浊解毒方加减治疗慢性萎缩性胃炎(CAG)的机制。方法:采用随机数字表法将于2021年1月~2023年5月在上海中医药大学深圳医院接受治疗的120例CAG患者分为A组和B组,每组各60例。A组给予幽门螺杆菌根除三联疗法,B组在A组基础上给予化浊解毒方加减治疗,两组均持续治疗2周。比较两组治疗2周后的临床疗效,治疗前、治疗2周后的胃镜黏膜征象积分、成纤维细胞生长因子23(FGF-23)、白细胞介素-32(IL-32)、降钙素基因相关肽(CGRP)、人表皮生长因子(EGF)、胃黏膜MyD88、ATF2、NF-κB蛋白表达情况,治疗期间的不良反应。结果:B组治疗2周后的总有效率高于A组(88.33%vs 71.67%,P<0.05)。两组治疗2周后的胃镜黏膜征象各项评分均比治疗前低,且与A组比较,B组较低(P<0.05)。两组治疗2周后的血清FGF-23、IL-32、EGF水平均比治疗前低,且与A组比较,B组较低;两组血清CGRP水平比治疗前升高,且与A组比较,B组较高(P<0.05)。两组治疗2周后的胃黏膜MyD88、ATF2、NF-κB蛋白表达均比治疗前低,且与A组比较,B组较低(P<0.05)。B组和A组治疗期间的不良反应发生率比较,差异无统计学意义(5.00%vs 11.67%,P>0.05)。结论:化浊解毒方加减治疗可有效减轻CAG患者胃黏膜炎症反应及胃黏膜损伤程度,分析其机制可能与其能调节胃黏膜MyD88、ATF2、NF-κB蛋白的表达有关,有助于提高治疗效果,且安全性良好。

青藤碱对胶原诱导的关节炎大鼠血清OPG/RANKL、IL-17含量的影响

目的探讨青藤碱(SIN)对胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠血清骨破坏因子血清骨保护素(OPG)、核周因子κB受体活化因子的配体(RANKL)、白细胞介素17(IL-17)的作用,了解其治疗的骨保护作用。方法建立CIA大鼠模型,以炎症指标、X线片证实造模成功;分为对照组、模型组、SIN组、MTX组,用ELISA法分析CIA大鼠血清OPG、RANKL、炎性细胞因子IL-17的水平。结果与正常组比较,模型组大鼠外周血RANKL、IL-l7水平明显升高(P<0.05),OPG水平明显降低(P<0.05),OPG/RANKL比值下降。与模型组比较,SIN组外周血OPG水平及OPG/RANKL比值明显升高(P<0.05);与MTX组比较,SIN组OPG、OPG/RANKL比值无明显差异(P>0.05)。结论在成功建立的CIA大鼠模型中,青藤碱能够提高外周血OPG/RANKL比值,提示青藤碱对类风湿性关节炎有骨保护作用。

三硝基苯磺酸/乙醇灌肠液诱导大鼠溃疡性结肠炎TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达及电针的干预作用

目的探讨三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠液诱导大鼠溃疡性结肠炎TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达及电针的干预作用。方法雄性Wistar大鼠240只,随机分为正常对照组、模型组、电针组、TLR4单克隆抗体(TLR4mAb)组、LY294002组和TLR4mAb-LY294002联合治疗(T&L)组。以TNBS/乙醇溶液灌肠诱导大鼠溃疡性结肠炎模型,电针组造模同时给予电针足三里穴治疗,TLR4mAb组给予TLR4mAb腹腔注射,LY294002组则予LY294002注射液腹腔注射,T&L组则同时给与上述TLR4mAb和LY294002腹腔注射,共4周,每日行疾病活动指数(DAI)评分。造模4周后处死大鼠取结肠组织标本,评价结肠黏膜损伤指数(CMDI)和组织学损伤指数(TDI);免疫印迹法测定结肠黏膜磷酸化AKT(P-AKT)和活化NF-κB含量;RT-PCR法检测结肠组织中TLR4mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达。结果与正常对照组比较,模型组结肠组织TLR4mRNA、PI3K mRNA、P-AKT、活化NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达和DAI、CMDI及TDI均显著升高(P<0.01);与模型组比较,TLR4mAb组TLR4mRNA表达显著下降(P<0.01),LY294002组PI3K mRNA、P-AKT表达显著下降(P<0.01),而在电针组和T&L组TLR4mRNA、PI3K mRNA及P-AKT表达均明显降低(P<0.01);与上述变化相对应,与模型组相比,各治疗组活化NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达和DAI、CMDI及TDI均明显降低(P<0.05或P<0.01),电针组和T&L组上述6指标优于TLR4mAb组和LY294002组,活化NF-κB与TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达呈正相关(r1=0.579,P<0.05;r2=0.561,P<0.05)。结论电针足三里穴能显著降低实验性溃疡性结肠炎大鼠的NF-κB活性及TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达,从而减轻结肠组织损害程度,这与其阻断TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路有密切关系。

慢性牙周炎患者龈沟液OPG和RANKL的变化及意义

目的:探讨慢性牙周炎患者龈沟液中核因子-κB受体活化子配体(receptor activator for NF-κBligand,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的变化及意义。方法:采用滤纸条法收集23例正常对照者和34例慢性牙周炎患者龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)标本,ELISA法测定上清液RANKL和OPG含量,利用Optimas5.0图像分析软件对检测牙的根尖片进行灰度分析。结果:对照组和慢性牙周炎组临床指标(PD、AL、PLI和SBI)之间存在显著性统计学差异(P<0.01)。2组GCF中RANKL、OPG和RANKL/OPG比值之间存在显著性统计学差异(P<0.01)。慢性牙周炎组GCF中OPG浓度与PD和AL之间存在负相关关系(分别为P<0.01和P<0.05),RANKL浓度及RANKL/OPG比值与根尖片灰度值之间存在负相关关系(P<0.05),GCF中RANKL和OPG浓度及RANKL/OPG比值与PLI和SBI之间无相关关系(P>0.05)。结论:RANKL和OPG在慢性牙周炎患者的牙槽骨组织破坏过程中发挥作用。

跑台运动对去卵巢大鼠骨组织中OPG、RANKL和RUNX2 mRNA表达的影响

目的:观察去卵巢大鼠经跑台运动后其骨组织中OPG、RANKL和RUNX2 mRNA表达变化,探讨力学刺激防治绝经后骨质疏松的作用机制。方法:健康3月龄雌性SD大鼠30只,体重(270±10)g,按随机方法平均分为假手术组、去卵巢组和跑台运动组,每组10只。假手术组仅在术中牵动卵巢并不行卵巢切除,其余两组均行卵巢切除术。假手术组和去卵巢组大鼠正常饲养;跑台运动组大鼠在术后1周开始在动物跑台上运动,跑速为18 m/min,每次45 min,1次/d,6 d/周,共训练11周。12周后处死所有动物,取左侧股骨头,脱钙后石腊切片,用倒置相差显微镜观察其组织学变化;取右股骨头提总RNA,实时PCR法检测OPG、RANKL和RUNX2的mRNA表达情况。结果:去卵巢组骨小梁稀疏,骨细胞少,跑台运动组骨小梁粗壮增厚。去卵巢组骨组织中OPG的mRNA表达为(0.131±0.080),RNAKL的mRNA表达为(8.013±3.550),RUNX2的mRNA表达为(3.245±5.090)。跑台运动组其骨组织中OPG的mRNA表达为(0.566±0.260),RANKL的mRNA表达为(5.232±3.670),RUNX2的mRNA表达为(2.753±3.680)。和去卵巢组比较,跑台运动组的OPG的mRNA表达升高,差异有统计学意义;而RANKL和RUNX2的表达下降,差异无统计学意义。结论:力学刺激能通过促进去卵巢大鼠骨组织中OPG的表达而发挥其抗绝经后骨质疏松的效果,这对今后研究绝经后骨质疏松症的治疗提供了新的思路。

β-七叶皂甙对脑损伤大鼠脑组织核因子-κB活性与肿瘤坏死因子-α蛋白表达的影响

目的 研究β-七叶皂甙(β-aescin)对大鼠急性脑损伤后脑组织核因子-κB(NF-κB)活性和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达的影响。 方法 62只SD大鼠采用自由落体致伤法制作脑外伤模型,随机分成四组: (1)假手术对照组(A); (2)创伤组(B); (3)β-七叶皂甙治疗组(C); (4)吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC)治疗组(D)。每组分别在术后6, 24h和3d三个时相点收取脑组织标本,采用凝胶电泳迁移率分析(EMSA)测定脑组织NF-κB活性;放射免疫法测定脑组织TNF-α蛋白水平,并测定脑组织含水量及进行病理形态学观察。 结果 与假手术对照组比较,大鼠脑损伤后脑组织NF-κB活性和TNF-α蛋白水平以及脑组织含水量显著增高(P<0. 01);与创伤组比较,β-七叶皂甙和PDTC治疗组脑组织NF-κB活性(P<0. 01 )、脑组织TNF-α蛋白水平(P<0. 01)及脑组织含水量(P<0. 05)均显著降低。 结论 β-七叶皂甙可以抑制NF-κB活化,下调TNF-α蛋白表达,从而减轻脑水肿。这可能是β-七叶皂甙治疗创伤性脑水肿的分子生物学作用机制之一。

皮瓣缺血再灌注期间核因子-κB活性的变化及其意义

目的 探讨核因子(NF) κB活性变化在皮瓣缺血再灌注(I/R)损伤中的作用。方法将60只雄性SD大鼠随机分为3组:对照组;I/R组;吡咯烷二硫氨基甲酸酯(PDTC)处理组。制备右下腹岛状皮瓣I/R模型。PDTC处理组于再灌注前及早期,分2次静脉注射PDTC(3 0 0mg/kg体重)。采用免疫组织化学及凝胶电泳迁移率法,检测皮瓣NF κB活化情况,并行组织学观察。结果 I/R组再灌注后NF κBp65阳性细胞较对照组明显增加,NF κB活性于再灌注1、3h显著增强;PDTC处理组再灌注1、2h阳性细胞数(7.90±3 .73、10 .60±3 .2 0 )较I/R组(19.5 0±6.93、18.5 0±5 .68)明显减少(P均<0 .0 1) ,再灌注1hNF κB活性受到抑制,中性粒细胞浸润及组织水肿程度较I/R组明显改善。结论 NF

辅酶Q10干预糖尿病牙周炎大鼠血清骨指标的变化

目的:探索辅酶Q10对伴2型糖尿病牙周炎大鼠血清RANKL、OPG的水平,及牙周病损中的作用。方法:选择质量200g左右Wistar健康雄性清洁级大鼠48只,随机分为3组:糖尿病对照组(DG),牙周炎+糖尿病+NaCl组(PDNaG),牙周炎+糖尿病+Co Q10组(PDCoG)。观察大鼠的牙周探诊深度,牙槽骨垂直吸收高度,H E染色检测牙周组织病理变化。酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清R ANKL/OPG水平。结果:灌胃第8周,各组大鼠的牙周探诊深度、牙槽骨垂直吸收高度差异均有统计学意义(P<0.05);各组血清RANKL、OPG水平差异无统计学意义(P>0.05);灌胃第8周,各组间RANKL/OPG的比值差异有统计学意义(P<0.05)。结论:辅酶Q10对伴2型糖尿病牙周炎大鼠牙周炎有改善作用,可调节血清R ANKL/OPG达到平衡。