用凝集素和非同位素标记底物测定核心α-1,6-岩藻糖转移酶及其应用

报道了一个不需同位素和ＨＰＬＣ的α－１，６－岩藻糖转移酶（α１，６ＦｕＴ，又称核心岩藻糖转移酶）的测定法，包括从正常人血浆提纯运铁蛋白，消化成带有天冬酰胺（Ａｓｎ）的二天线Ｎ－糖链，去除外端唾液酸和半乳糖后，用生物素酰胺乙酰基团标记其Ａｓｎ，并以此生物素衍生物标记的Ａｓｎ－七糖的Ｎ－糖链为受体底物，ＧＤＰ－Ｌ－岩藻糖为供体底物，用ＬＣＡ柱吸附法分离岩藻糖化后的产物，再用ＨＲｐ－Ａｖｉｄｉｎ交联物与柱上带有生物素的产物结合，此ＨＲＰ－Ａｖｉｄｉｎ－生物素。岩藻糖化产物从柱上洗脱后测定ＨＲＰ活力可代表α１，６ＦｕＴ活力。此法在较宽的范围内，产物量与酶量和反应时间成正比．人肝细胞癌、亚硝胺诱发大鼠肝癌后期或用佛波酯（ＰＭＡ）处理人肝癌细胞后，α１，６ＦｕＴ增高，而用视黄酸或ｄｂ－ｃＡＭＰ处理人肝癌细胞后，则该酶活力降低。

PARP1通过调控N-糖基转移酶FUT8影响胃癌AGS细胞的增殖与5-FU耐药

目的:探讨聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP1)对胃癌AGS细胞的增殖和5-FU耐药性的影响及其可能的机制。方法:收集2018年5月至2019年12月于恩施土家族苗族自治州中心医院就诊的72例胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织,采用qPCR和免疫组化法检测胃癌和癌旁组织中PARP1的表达状况。CCK-8法、流式细胞术和集落形成实验分别检测PARP1抑制剂AG14361对胃癌AGS细胞增殖、凋亡和集落形成的影响,MTT法检测AG14361对胃癌细胞5-FU敏感性的影响。mRNA测序分析AG14361处理AGS细胞后差异基因整体分布情况,KEGG富集分析相关信号通路。向AGS细胞转染siFUT8以敲减FUT8基因的表达,qPCR和WB法检测AGS细胞内α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的表达状况和敲减FUT8效果,CCK-8法、流式细胞术和集落形成实验分别检测AG14361处理对敲减FUT8表达的AGS细胞增殖、凋亡和集落形成的影响。结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中PARP1呈高表达(P<0.001)。AG14361处理可显著抑制AGS细胞的增殖和细胞集落形成,促进AGS细胞凋亡(均P<0.01)。AG14361处理可降低5-FU杀伤胃癌细胞的IC_(50),且在AGS细胞中尤为明显,IC50下降超过60%。m RNA测序结果显示,N-糖基化修饰中FUT8是AG14361抑制AGS细胞增殖的关键糖基转移酶(P<0.05)。与siNC组相比,IC_(50)浓度的AG14361可显著逆转干扰FUT8对AGS细胞增殖的增加,促进细胞凋亡和BAX蛋白表达、抑制Bcl2蛋白表达,抑制FUT8干扰所致AGS细胞集落的增加(均P<0.01)。结论:PARP1可通过调控N-糖基转移酶FUT8促进胃癌细胞恶性转化,其抑制剂AG14361可增强胃癌细胞对5-FU的敏感性,PARP1可能成为胃癌治疗的一个潜在靶标。

核心岩藻糖基转移酶缺损导致B细胞抗体产生下降

目的探讨核心岩藻糖基转移酶(Fut8)对B细胞抗体产生的影响。方法小鼠经OVA免疫后,取其脾脏分离单个淋巴细胞,应用流式细胞术分析小鼠脾脏细胞中B细胞群的分布情况;ELISPOT实验检测小鼠B细胞产生抗体的能力;收集小鼠OVA免疫过程中第0、14、28天的血清,ELISA技术检测小鼠血清中抗体的效价。结果 Fut8基因缺失导致小鼠脾脏细胞中所有的B细胞和成熟B细胞的数量下降(P<0.05);Fut8^(-/-)小鼠和Fut8^(+/+)小鼠抗体产生细胞的平均数量分别为16个和27个,与Fut8^(+/+)小鼠相比,Fut8^(-/-)小鼠B细胞产生抗体的能力下降(P<0.05);第1次免疫之后Fut8^(-/-)和Fut8^(+/+)小鼠抗-OVA IgG抗体的效价分别为1∶12 800和1∶51 200,第2次免疫之后,抗体的效价分别为1∶102 400和1∶409 600,Fut8的缺失导致血清中抗体效价下降(P<0.05)。结论核心岩藻糖基化对B细胞的抗体产生具有重要的调节作用。

α-1,6岩藻糖基转移酶与甲胎蛋白异质体在原发性肝癌诊断中的应用

目的:分析α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)与甲胎蛋白异质体(AFP-L3)在原发性肝癌(PLC)诊断中的应用价值。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测我院92例PLC患者和42例非原发肝癌(NPLC)患者血清中FUT8和AFP-L3。结果:经统计学分析,PLC组与NPLC组血清FUT8和AFP-L3比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)与甲胎蛋白异质体(AFP-L3)在原发性肝癌(PLC)诊断中有一定的应用价值。

恶性髓系肿瘤细胞部分岩藻糖转移酶基因表达研究

目的研究恶性髓系肿瘤细胞中部分岩藻糖转移酶(FUT1-3、FUT6-7)基因的相对表达情况。方法应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HL-60细胞及31名急性髓细胞白血病(AML)患者与骨髓增生异常综合征(MDS)患者(患者组)的FUT1-3、FUT6-7基因的相对表达情况,同时以正常CD34+细胞作为HL-60细胞的正常对照、以25名健康体检者作为患者组的正常对照。结果 FUT1-3、FUT6-7基因在HL-60细胞及其对照组的相对表达分别为:0.30±0.03 vs 1.08±0.06、0.68±0.05 vs 1.20±0.14、0.68±0.04 vs 1.00±0.05、0.82±0.03 vs 1.00±0.05、0.59±0.12 vs 1.02±0.15(P<0.01)。FUT1、FUT3基因在患者组与对照组的相对表达分别为:0.85±0.67 vs 1.31±0.5、0.53±0.48 vs 1.34±0.69(P<0.05);FUT2、FUT6、FUT7基因的相对表达量在患者组与对照组间无明显差异(P>0.05)。FUT1-3、FUT6-7基因在AML患者(n=13)与MDS患者(n=18)间的相对表达量差异亦不明显(P>0.05)。结论 FUT1-3、FUT6-7基因在恶性髓系肿瘤细胞HL-60及AML与MDS患者中出现不同程度的相对表达减弱,二者间部分具有关联性。

Lewis y抗原及α1,2-岩藻糖转移酶基因在卵巢癌细胞系中的表达

目的探讨卵巢癌细胞系中Lewisy抗原及α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-FT)基因FUT1表达变化对卵巢癌细胞增殖、耐药和转移的影响。方法采用免疫细胞化学法、免疫细胞荧光法测定α1,2-FT基因FUT1转染前后的人卵巢癌细胞系RMG-I和RMG-I-H、人卵巢癌高转移细胞系HO8910PM及亲本细胞系HO8910、人卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP及亲本细胞系COC1中Lewisy抗原的表达。利用RT-PCR法及real-time PCR法检测上述6种细胞中FUT1基因表达的变化。结果经免疫化学方法和免疫细胞荧光法分析,在RMG-I-H、HO8910PM及COC1/DDP细胞系中Lewisy表达强度分别为(53.90±4.33),(37.31±0.19)和(28.52±1.45),与相应的亲本细胞系RMG-I(32.18±0.64)、HO8910(14.96±0.61)及COC1(19.26±0.83)比较均明显升高(P均<0.05)。与RMG-I相比,RMG-I-H中的FUT1基因表达上调3.07倍,与HO8910相比,HO8910PM中的FUT1基因表达上调2.13倍,与COC1相比,COC1/DDP中的α1,2-FT基因表达上调2.42倍(P均<0.05)。结论人卵巢癌细胞表面Lewisy抗原与卵巢癌细胞的增殖、耐药及转移等生物学行为密切相关。

CK8寡糖链结构及翻译水平改变与人肝癌细胞转移相关性研究

糖组学方法筛查人肝癌细胞转移过程中发挥重要作用的核心岩藻糖基化蛋白质分子,解析比较筛出的差异蛋白——细胞角蛋白8(CK8)翻译及糖基化修饰改变与人肝癌细胞转移潜能的关系.应用双向电泳(2-DE)、凝集素亲和印迹、凝集素亲和沉淀联合质谱分析技术,筛查并验证与肝癌转移相关的核心岩藻糖基化蛋白;应用细胞免疫荧光和蛋白质免疫印迹检测CK8的蛋白质表达情况;应用免疫沉淀结合多种凝集素亲和印迹,推测其与肝癌转移相关的寡糖链结构改变.研究发现,3种不同转移潜能人肝癌细胞Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H的扁豆凝集素(LCA)亲和印迹表达谱中,分子质量55～60ku、等电点4～6区域处有核心岩藻糖基化蛋白呈差异表达,质谱鉴定为CK8.LCA亲和沉淀及蛋白质印迹进一步验证CK8异常核心岩藻糖基化与肝癌转移相关;研究发现,CK8分布于细胞浆内,在MHCC97-L和MHCC97-H细胞中蛋白质表达水平较Hep3B高,在MHCC97-H中与LCA和蓖麻凝集素(RCA-1)的亲和力较Hep3B强.以上结果提示,2-DE和凝集素印迹技术联合MALDI-TOF-MS/MS分析可用于筛查疾病过程相关的异常糖基化蛋白质分子,CK8蛋白水平、核心岩藻糖基化及β-1,4末端半乳糖基化的增加均与肝癌细胞转移潜能相关.

核心岩藻糖基转移酶Fut8基因敲除小鼠肠道菌群特征

目的探究Fut8基因敲除对ICR小鼠肠道菌群结构的影响。方法分别在Fut8^(+/+)和Fut8^(-/-)小鼠出生后不同时间点检测体重,采集粪便样本,采用PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)的方法检测小鼠粪便中菌群的组成;利用高效液相色谱法(HPLC)测定Fut8^(+/+)和Fut8^(-/-)小鼠Fut8酶活。结果 Fut8^(-/-)小鼠与Fut8^(+/+)小鼠相比生长缓慢(P<0.05);完全丧失核心岩藻糖基化活性;肠道菌群结构不同,其中拟杆菌门微生物存在显著差异。结论核心岩藻糖基转移酶Fut8基因敲除对小鼠肠道菌群结构有显著影响。

广西巴马小型猪FUT1基因的克隆和序列分析

为了进一步探索α1岩藻糖转移酶(FUT1)基因的遗传效应,试验采用RT-PCR的方法从广西巴马小型猪十二指肠组织中扩增FUT1基因的编码区序列。结果表明:广西巴马小型猪FUT1基因的编码区全长1 098 bp,与GenBank参考序列(登录号为NM_214068)相比,在第380和887位点发生错义突变,分别导致苏氨酸突变为甲硫氨酸,亮氨酸突变为脯氨酸。与普通猪、人、牛及家鼠的同源性分别为99.8%、82.2%、85.2%、77.9%。

核心岩藻糖修饰与疾病相关性研究进展

糖基化是生物体内功能最多样的一种翻译后修饰,核心岩藻糖(core fucose,CF)为N-聚糖的一种常见糖型,受α-1,6岩藻糖基转移酶催化调控。近年来研究表明,CF修饰在肿瘤等疾病的发生与进展中发挥重要作用。糖蛋白丰度较低、糖链的微观不均一性以及质谱等检测技术的限制,给CF修饰蛋白质的发现及应用研究带来了极大的挑战。本文主要介绍蛋白质CF修饰的生物合成、调控机制以及参与调控的生理病理过程,期望为CF修饰蛋白质的发现及临床应用提供新思路。

复方生脉成骨胶囊修复激素性股骨头坏死的作用机制

背景:复方生脉成骨胶囊治疗早期激素性股骨头坏死的疗效佳,但具体治疗机制尚不完全明确。目的:观察复方生脉成骨胶囊干预对激素性股骨头坏死大鼠骨组织中岩藻糖基转移酶8、成骨基因及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响。方法:取60只雄性SD大鼠,采用随机数字表法分为空白组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组及中药高剂量组,每组12只。模型组和中药低、中、高剂量组通过皮下注射咪喹莫特(每2周一次,共2次)与臀肌注射甲强龙(1次/周,共4次)的方法建立激素性股骨头坏死模型,末次造模给药后第2天,中药低、中、高剂量组分别灌胃给予1.89,3.78,7.56 g/(kg·d)的复方生脉成骨胶囊溶液,模型组灌胃给予等量生理盐水,连续给药8周。给药结束后,分别进行股骨头micro-CT扫描、组织学染色、压缩实验、RT-qPCR及Western blot检测。结果与结论:①micro-CT扫描显示,与空白组比较,模型组大鼠骨小梁体积分数、骨小梁数量及骨小梁厚度减少(P<0.05),骨小梁离散度增加(P<0.05);与模型组比较,中药低、中、高剂量组骨小梁体积分数、骨小梁数量及骨小梁厚度增加(P<0.05),骨小梁离散度减少(P<0.05),且呈剂量依赖性。②苏木精-伊红染色显示,与模型组比较,中药低、中、高剂量组空骨陷窝率减少(P<0.05),且呈剂量依赖性;免疫组化染色显示,与空白组比较,模型组岩藻糖基转移酶8、Runx2、骨形态发生蛋白2的蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,中药低、中、高剂量组岩藻糖基转移酶8、Runx2、骨形态发生蛋白2的蛋白表达升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。③压缩实验显示,与模型组相比,中药低、中、高剂量组股骨头最大载荷及弹性模量升高(P<0.05),且呈剂量依赖性;④RT-qPCR及Western blot检测显示,与空白组相比,模型组岩藻糖基转移酶8、Runx2、碱性磷酸酶、骨钙素、成骨细胞特异性转录因子及骨形态发生蛋白2的mRNA与蛋白表达降低(P<0.05);与模型组相比,中药低、中、高剂量组上述指标的mRNA与蛋白表达升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。与空白组比较,模型组Wnt2、低密度脂蛋白受体相关蛋白5及β-连环蛋白的mRNA与蛋白表达降低(P<0.05),糖原合成酶激酶3β的mRNA与蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,中药低、中、高剂量组Wnt2、低密度脂蛋白受体相关蛋白5及β-连环蛋白的mRNA与蛋白表达升高(P<0.05),糖原合成酶激酶3β的mRNA与蛋白表达降低(P<0.05),且呈剂量依赖性。⑤结果表明,复方生脉成骨胶囊治疗激素性股骨头坏死的机制可能是通过上调岩藻糖基转移酶8表达来激活Wnt/β-catenin信号通路,促进骨形成。

阻断核心岩藻糖基化修饰对小鼠前B细胞信号传导能力的影响

目的 观察阻抑核心岩藻糖基化修饰对前B细胞信号传导的调节作用.方法 利用逆转录病毒包装技术建立核心岩藻糖转移酶Fut8基因沉默前B细胞株（70Z/3-Fut8-RNAi细胞）.用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）及Western blot检测Fur8 mRNA、蛋白表达和细胞内信号分子的酪氨酸磷酸化水平.结果 成功构建重组pSINsi-hU6-Fut8 siRNA质粒,逆转录病毒包装后病毒滴度可达2.1×10^5 CFU/ ml.Real-time PCR及Western blot检测结果表明70Z/3-Fut8-RNAi细胞的Fut8基因和蛋白表达明显下降,蛋白表达水平下调70％ - 80％,mRNA水平下调70％ -80％,以及pre-BCR介导的细胞信号传导,即CD79a及BTK磷酸化显著下降.结论 成功构建70Z/3-Fut8-RNAi细胞株,Fut8修饰的核心岩藻糖基化可能在早期B细胞的细胞信号传导过程中发挥重要的调节作用.

母猪繁殖性能相关5个候选基因的PCR-RFLP多态性研究

为了比较ESR、NCOA1、ADAMTS1、FUT1和RBP4基因对猪繁殖性能的效应大小,采用PCR-RFLP技术,分别检测了杜洛克、长白和大白群体内5个基因的基因型频率和等位基因频率,并分析不同基因型与3个猪群体的总产仔数(TNB)、产活仔数(NBA)和出生窝重(BLW)相关性。结果表明:对猪繁殖性能影响效应最大的是NCOA1和RBP4基因,其次是FUT1和ADAMTS1基因,最小的是ESR基因。NCOA1基因在杜洛克和大白群体内AA型的NBA比BB型的分别高1.11和1.92头,AA型的TNB比BB型的分别高1.18头和0.53头。RBP4基因在3个猪群体内AA型的TNB比BB型的高0.53—0.86,在杜洛克和大白群体内AA型的NBA比BB型的分别高1.1头和1.29头。FUT1在杜洛克和大白群体内AA型的TNB比CBB型的分别高0.47和0.56),AA型的NBA比BB型的分别高0.76头和1.06头。ADAMTS1基因在3个猪群体内AB型的TNB比AA型的高0.67—0.88,AB型的NBA比AA型的高0.54—0.86。在大白群体内ESR基因的BB型的TNB、NBA比AA型的分别高0.36头和0.41头。5个基因的不同基因型对3个猪群体BLW影响不显著。