中国玉米新品种DNA指纹库建立系列研究 Ⅱ.适于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的SSR核心引物的确定

本项研究利用60个玉米自交系对初选出的158个SSR引物对进行进一步筛选,综合考虑PIC值大小、扩增带型统计的难易及引物的重复性高低,确定bnlg439、bnlg125、phi053、bnlg197、phi072、bnlg238、phi126、bnlg161、bnlg240、bnlg619共10个引物对作为构建玉米自交系和杂交种指纹库的核心引物;同时提出适用于计算玉米SSR指纹图谱概率的公式:P=1/N,对自交系N=n;对杂交种,N=Cn1+Cn2。n为所用引物的等位基因数。

适合棉花品种鉴定的SSR核心引物的筛选

本研究利用来自Cotton Marker Database(CMD)数据库中的2000个引物对32份审定棉花品种基因组DNA进行了PCR扩增,筛选出26个多态性核心引物,其中11个引物被推荐为棉花品种鉴定的首选核心引物,同时提出了核心引物理论上可区分的最大品种数的计算公式:N=G1×…×Gn,理论推测结果表明:利用11个首选核心引物进行棉花品种鉴定是可行的。建立在SSR指纹数据基础上的不同组合品种(系)间聚类分析以及对25份区试品系和A品种的真实性鉴定,结果表明:所有参试品种(系)遗传基础狭窄,32份审定品种间DNA水平上的差异与品种来源的系谱分析结果基本吻合,首选核心引物不仅可以对品种(系)的真实性做出鉴定,而且对遗传距离狭窄的品种(系)具有很好的鉴别力。

甘蓝型油菜SSR核心引物研究

为了确定一组适用于品种纯度鉴定和遗传多样性分析的SSR核心引物,以100份具有代表性的甘蓝型油菜品种（系）为研究材料对746对SSR引物进行筛选,综合考虑PIC（平均多态信息量）值大小、引物重复性、扩增带型清晰度、连锁群分布等因素,确定44对引物为甘蓝型油菜核心引物,其中20对引物为首选核心引物,24对引物为备选核心引物。20对首选核心引物每对可检测到3~9个多态性位点,PIC值介于0.56~0.80,共检测到102个位点,分布于11个连锁群上。随机抽取1对核心引物对一个杂交组合大田制种F1纯度进行鉴定,其鉴定结果与田间自然鉴定结果一致,并可同时鉴别出来源于父本及外来的混杂单株。将44对核心引物应用于品种的系谱分析和100份品种遗传多样性聚类分析,同样得到了很好的验证结果。该套SSR核心引物适用于甘蓝型油菜品种鉴定及遗传多样性研究。

陆地棉SSR核心引物筛选及95份骨干种质的遗传多样性分析

从391对棉花SSR引物中筛选出均匀分布于棉花26条染色体的52对核心引物,对92份陆地棉和3份亚洲棉骨干种质进行多样性分析,结果表明,52对引物的等位基因数范围为2～13,平均5.7692个,多态信息含量(Polymorphism Information Contents,PIC)在0.3457～0.8800间,均值为0.7100,显示在这些位点上,供试材料的遗传变异比较丰富;聚类分析显示,在相似系数为0.73处,3份亚洲棉种质单独聚为一类,92份陆地棉种质被分为4大类群,与系谱分析结果较为吻合;在陆地棉种内,92份种质资源的相似系数在0.71～0.97之间,平均为0.84,表明陆地棉种内的遗传相似性较高,遗传基础狭窄;而广泛的亲本选配与频繁的引种,以及选育过程中未知血缘的渗入,又致使陆地棉遗传背景丰富。

玉米杂交种纯度鉴定SNP 核心引物的确定及高通量检测方案的建立

纯度是玉米种子质量的重要指标之一,尤其杂交种自交株是影响田间产量的关键因素。KASP(kompetitive allele specific PCR)技术具有高通量、低成本的优点,适用于种子纯度检测。本研究基于12套杂交种及其父母本的三联体样本及335份玉米杂交种国家审定标准样品SNP指纹,从384个SNP基础位点筛选获得60个候选位点,位点转化为KASP引物的成功率为95%。综合考虑引物双亲互补率、多态性、稳定性和分型效果等多项指标,最终确定20个引物作为玉米杂交种纯度鉴定的核心引物,能够有效鉴定99.7%供试样品纯度。对于待测样品京科968通过SNP-DNA指纹数据库查询,并选择双亲互补型引物进行纯度鉴定。在检测的110个个体中,共检出1个自交苗和2个异型株,纯度为97.3%。同时,基于纯度核心引物对批量样品检测建立高通量纯度检测方案,具有快捷、准确、高通量和低成本的特点,为政府监管和企业提供了更多纯度鉴定方案的选择。

鉴定烟草种质资源SSR核心引物筛选和验证

核心引物对遗传多样性分析、种质资源鉴定、品种纯度和真实性检测、指纹图谱构建等研究具有重要价值。本研究利用均匀分布于烟草24条染色体的278对SSR引物,对20份亲缘关系相对较远的烟草材料进行初步筛选,筛选出32对引物。再加上10份亲缘关系较近的材料,共30份烟草材料对32对引物进行复筛,最终确定14对为核心引物,并通过12份系谱已知的烟草材料进行有效性验证。利用14对核心引物对39份烟草材料进行遗传多样性聚类分析,与农艺性状聚类分析相比较,结果表明该套SSR核心引物适用于烟草种质资源鉴定和遗传多样性分析。

棉花杂交种SSR核心引物的筛选与评价

为筛选到一套针对棉花杂交种真实性和纯度进行鉴定的核心引物,本实验以79个棉花杂交种为材料,采用分子标记技术,对已公布的2300对SSR引物通过PCR扩增,经初筛和复选,最终获得扩增条带清晰、重复性好且分辨能力强的56对核心引物。利用这56对SSR引物对生产上推广的37个棉花杂交种进行多态性验证,共检测到95个多态性位点,变幅为1～3个;161个基因型,变幅为2～3个。随机抽出10对引物,通过组合方式可以将37个品种完全区分开。对37个品种的SSR分子标记结果进行UPGMA聚类,在相似系数为0.54时,20个长江流域杂交种中有19个被划分到第一类,17个黄河流域品种中有11个被划分到第二类,较好地反映出不同棉区因育种目标的不同所产生的差异。表明该套引物有很好的代表性、实用性和有效性。

烤烟种质资源SSR核心引物的筛选及验证

为筛选到适合烤烟品种利用的核心引物,准确评价烟草种质资源遗传多样性和亲缘关系,利用5份遗传差异明显的烤烟种质对分布于烟草24条连锁群上的2317对SSR引物进行初步筛选,筛选出70对引物。再利用20份不同地理来源的烤烟种质对初筛引物进行复筛,最终确定24对核心引物。利用核心引物对20份烤烟种质进行遗传多样性分析,共得到85个多态性位点,平均PIC值为0.52,平均等位位点数为3.54。同时对这20份烤烟种质进行聚类分析和主坐标分析,验证24对核心引物的有效性。结果显示,两种研究方法结论一致,与种质亲缘关系吻合度较高。表明该SSR核心引物体系准确有效,可以适用于烤烟种质资源鉴定和遗传多样性分析。

适于玉米SSR核心引物的通用PCR扩增反应程序的建立

通过研究退火温度与引物TM值之间的关系,确定玉米核心引物设计时对TM值的特殊要求,通过比较3种PCR扩增程序,确定两步法扩增作为新设计引物的统一的PCR反应程序,为基于玉米SSR核心引物构建多重PCR组合反应进行高通量的基因分型奠定了基础。

适用于玉米DNA指纹库构建的SSR核心引物的重新设计与优化

为了确定出适用于玉米DNA指纹库构建的引物,对部分并不是完全符合玉米DNA指纹库构建引物筛选原则的引物进行重新设计与优化,使其基本符合核心引物设计的要求。以umc2105、umc1705和phi299852为例,下载原引物的基因组序列,利用两个常用的引物设计软件Primer Premier5.0和Oligo6.57进行引物的重新设计及评估,在Tm值、GC含量、引发效率、错误引发率、3'端G值、引物二聚体等方面对引物进行改善,结果表明,经过对原引物的重新设计和优化,新设计的引物均能清晰的扩增,扩增效果得到了明显的改善,并且均能在统一的条件下进行实验,符合了玉米DNA指纹库构建的要求。

辣椒杂交种纯度鉴定的SSR核心引物筛选

旨在确定一套适于辣椒杂交种纯度鉴定的核心SSR引物,利用17对SSR引物对100份已知辣椒(Capsicum)杂交种进行DNA指纹分析。根据多态性和杂合率两个指标,确定Hpms1-214、Es395和Hpms1-5为辣椒杂交种纯度鉴定的首选核心引物,利用这3个引物进行筛选,97个品种(占97%)能够找到具有杂合带型的鉴定引物,确定5个引物Es330、Es363、Epms923、Es120和Es64为辣椒杂交种纯度鉴定的备选核心引物。筛选出14个品种的特异性引物,可进一步筛选每个辣椒杂交种的双亲互补型引物。

山西省主推玉米杂交种纯度鉴定SSR核心引物的筛选

选用10对SSR核心引物对18份山西省玉米杂交种进行DNA指纹分析,并综合考虑多态性和杂合率,认为umc1590和umc1196这2对引物可鉴定17个品种纯度,phi402893,phi102228,phi233376,p-phi072,umc1066和phi022也可作为纯度鉴定的引物。建议采用umc1590,phi402893,phi233376,phi022这4对引物对18个杂交种纯度进行检测。

适于甜菜品种鉴定的SSR核心引物的筛选

为了筛选出适合于甜菜杂交种鉴定的核心引物,以16个在中国种植面积较大的进口甜菜品种为材料,对已公布的130对甜菜SSR引物以及70对甜菜EST-SSR引物进行筛选。结果从200对甜菜SSR引物中筛选出了24对扩增条带清晰、重复性好且多态性高的核心引物。这24对引物中有22对引物的PIC值大于0.5,其中7对引物的PIC值均大于0.8,可以作为甜菜品种鉴定的首选核心引物。利用筛选出的核心引物对16个甜菜品种进行聚类分析,结果16个品种分为3类,基本上是同一公司的品种聚在了一起。甜菜SSR核心引物的筛选将大大加速甜菜品种纯度和真实性鉴定的速度,也将更快的促进甜菜分子生物学其他领域的发展。

基于辣椒品种鉴定的SSR核心引物筛选

为辣椒新品种审定及保护提供参考依据,以10个辣椒自育亲本及组配的25个杂交组合为材料,筛选出适合辣椒品种鉴定的SSR核心引物。结果表明:筛选出的20对核心SSR引物在35份材料(组合)中共检测到55个等位基因,75个基因型,扩增片段的大小都在450bp以下。核心引物组成的标记组合,聚类分类效果较好,且具备较强的鉴别能力,能完全鉴别所有参试材料(组合)。

适于贵州玉米种质DNA指纹库构建的SSR核心引物筛选

为了筛选出适用于贵州玉米种质DNA指纹库构建的引物,以21份贵州普通玉米自交系和36份糯玉米品种为材料,综合比较PIC值大小、扩增带型清晰度及引物的重复性高低,对87对SSR引物进行筛选,以确定贵州玉米种质DNA指纹库构建的核心SSR引物。结果表明:筛选出的23对和15对SSR引物可分别作为构建贵州普通玉米和贵州糯玉种质DNA指纹库的核心引物。

适合甜菜品种鉴定的SRAP核心引物的筛选

为筛选适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物,以12个进口国外甜菜品种为材料,对546对SRAP引物组合进行扩增,利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,选择适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物组合。结果从546对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、重复性好的引物组合23对,这23对引物组合共扩增出177条多态性条带,引物的PIC值均大于0.6。平均每对引物扩增7.7条多态性条带,从理论上讲,这些核心引物完全可以实现对现有甜菜品种的鉴定。

辣椒杂交种纯度鉴定的SSR核心引物筛选（英文）

[目的]该研究旨在筛选一套适于辣椒杂交种纯度鉴定的核心SSR引物。[方法]利用17对SSR引物对100份已知辣椒杂交种进行DNA指纹分析。[结果]根据多态性和杂合率两个指标,确定Hpms1-214、Es395和Hpms1-5为辣椒杂交种纯度鉴定的首选核心引物。利用这3个引物进行筛选,97个品种(占97%)能够找到具有杂合带型的鉴定引物,确定5个引物Es330、Es363、Epms923、Es120和Es64为辣椒杂交种纯度鉴定的备选核心引物。筛选出14个品种的特异性引物,可进一步筛选每个辣椒杂交种的双亲互补型引物。[结论]该研究为构建辣椒杂交种纯度鉴定标准DNA指纹图谱奠定基础。

火龙果SSR分子标记核心引物的筛选

为了筛选出适合火龙果种质资源遗传多样性分析和品种鉴定的SSR核心引物,以遗传背景差异较大的8份火龙果种质资源对已报道的20对火龙果SSR引物和本课题组转录组测序开发的100对EST-SSR引物进行初步筛选,筛选出引物36对。再利用18份形态差异较大、不同来源的火龙果种质资源对初筛引物进行复筛和验证,筛选出24对SSR核心引物,并通过遗传多样性分析和聚类分析验证引物的有效性。24对核心引物对18份火龙果种质资源进行遗传多样性分析,共得到117个等位基因,平均每个位点等位基因数(Na)4.88个,有效等位基因数(Ne)为2.341,期望杂合度(He)为0.516,多态性信息含量指数(PIC)平均为0.471,说明引物的多态性较高,能够有效揭示18份火龙果种质资源的遗传多样性。筛选出的24对SSR引物,带型清晰、稳定,多态性较高,可作为核心引物用于现有的火龙果种质资源鉴定和遗传多样性分析等研究。

苎麻种质DNA指纹库构建的SSR核心引物筛选

为了筛选出适用于苎麻种质DNA指纹库构建的引物,以108份苎麻种质为材料,综合比较扩增带型及引物的重复性高低,对27对SSR引物进行筛选,以确定苎麻种质DNA指纹库构建的核心SSR引物。结果表明:筛选出的8对SSR引物可作为苎麻种质DNA指纹库的核心引物。

基于8个海岛棉和4个陆地棉品种(系)SSR多态性核心引物的筛选

【目的】筛选针对海岛棉、陆地棉与海岛棉之间的核心引物。【方法】以8个海岛棉和4个陆地棉品种(系)为材料,采用分子标记技术,对已在Cotton Microsatellite Database(CMD)网站上公布的3 229对SSR引物,PCR扩增,通过PAGE胶电泳、检测,对获得的扩增条带清晰、重复性好且分辨能力强的核心引物进行统计分析。【结果】94对为海岛棉核心引物,214对为陆海之间差异明显的核心引物。【结论】筛选到了部分核心引物,所选择的SSR引物在海岛棉中多态性较低,选出率仅为2.9%。