核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞成骨细胞标志基因表达的影响

目的探讨核心结合因子α1(core-binding factor α1,Cbfa1)对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨定向分化的作用. 方法抽取3月龄日本大白兔股骨骨髓,密度梯度离心获得MSCs,以Cbfa1重组腺病毒转染第3代MSCs,3 d后免疫荧光法观察目的基因的表达,并于1～7 d MTT法检测其对细胞增殖的影响(Cbfa1腺病毒处理组).以正常培养组、单纯诱导组和对照腺病毒处理组作为对照,各组设置7、14 d两个时间点进行观察.RT-PCR法半定量分析Cbfa1腺病毒处理对MSCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和I型胶原等多种成骨细胞标志基因的影响,同时观察Cbfa1对MSCs成脂、成肌分化指标过氧化物酶体增殖物激活受体γ2和生肌决定因子的影响. 结果①免疫荧光显示,转染Cbfa1重组腺病毒后MSCs可以表达Cbfa1;②各组MSCs增殖差异无统计学意义(P>0.05);③RT-PCR显示7、14 d,Cbfa1腺病毒处理组ALP、OC和OPN的表达均明显上调,Ⅰ型胶原的表达基本不变;④Cofa1使PPARγ、MyoD的表达受到抑制. 结论 Cbfa1能明显促进MSCs成骨方向的分化.

恒古骨伤愈合剂促进兔坏死股骨头内核心结合因子α1基因表达的实验研究

目的研究中药恒古骨伤愈合剂(简称中药合剂)对兔坏死股骨头内核心结合因子α1(cbfα1)基因表达的影响。方法用大肠杆菌内毒素(LPS,10μg/kg体重)间隔24h两次静脉注射加甲基泼尼松3次肌肉注射制作的兔股骨头坏死模型,用中药合剂治疗后取股骨头行免疫组化,并提取总RNA行实时荧光定量多聚酶链反应(PCR),观察兔股骨头内cbfα1基因表达的动态变化特点。结果给药第4周时,中药组与模型组股骨头内cbfα1基因表达均为阴性,至第8、12周时,中药组免疫组化结果为弱阳性,模型组为阴性;至第12周时中药组股骨头内cbfα1mRNA的表达量是模型组的2·87倍。正常给药组与空白组比较差异无显著性。结论中药恒古骨伤愈合剂可促进坏死α股骨头内源性cbfα1基因的表达,以用药时间长者效果明显。

核心结合因子α1基因修饰骨髓间充质干细胞对骨缺损的修复研究

目的探讨以核心结合因子α1(core-bindingfactorα1,Cbfa1)基因修饰骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)作为种子细胞,与猪脱细胞骨基质材料复合构建组织工程骨修复兔桡骨缺损的可行性。方法选择3月龄日本大白兔40只,建立桡骨1.2cm缺损模型,根据不同的修复方式分成4组。A组:Cbfa1基因修饰MSCs与脱细胞骨基质材料复合后修复;B组:未行基因修饰的MSCs与脱细胞骨基质材料复合后修复;C组:单纯脱细胞骨基质支架材料修复;D组:空白对照,不作任何植骨处理。术后4、8和12周分别行大体、X线片和组织学观察评价修复效果,并对修复后桡骨进行生物力学检测。结果大体观察至术后12周取材时,A组原骨缺损植骨区新生骨成熟度好、饱满、质硬;B组植骨区有骨性连接,质软;C组可在植骨区发现少量骨性连接;D组形成骨不连。X线片和组织学观察示:术后4、8周A组支架材料降解、新骨生成及髓腔再建优于其它3组。术后12周A组支架材料完全降解,新骨塑形完成,骨髓腔通畅,皮质骨改建成正常的板层骨结构;B组缺损区近端部分骨髓腔塑形再通;C组截骨两端骨痂向植骨中长入,髓腔塑形不明显;D组纤维组织充填,形成骨不连。以前述各组健侧桡骨为正常对照组(仍为D组),余分组同前,行破坏压缩载荷检测,结果示12周后A、B组与D组比较差异无统计学意义(P>0.05),而C组与D组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论Cbfa1基因修饰MSCs与脱细胞骨基质材料复合构筑的组织工程骨可较好地修复兔桡骨缺损。

核心结合因子α1促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的观察核心结合因子α1(corebinding factorα1,Cbfα1)对兔骨髓间充质干细胞(marrowmesench ymalstemcells,MSCs)的促成骨效应。方法体外分离培养日本大白兔MSCs,按培养方法的不同分为3组。对照组:常规培养;单纯诱导组:以条件培养液(低糖DMEM+10%胎牛血清+10mmol/L地塞米松+50mg/L维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠)培养;实验组:以AdEasy1/Cbfα1转染MSCs,加入条件培养液培养。在诱导3d,1、2、3和4周时,行组织学观察和免疫组织化学等方法检测成骨标志碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)和骨钙素的表达。结果体外培养兔MSCs生长良好,实验组AdEasy1/Cbfα1转染后90%以上MSCs表达绿色荧光蛋白。实验组及单纯诱导组ALP染色呈棕黑色阳性,随培养时间延长逐渐加深,对照组仅少量散在细胞ALP呈弱阳性;第1、2、3和4周实验组ALP浓度与单纯诱导组及对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组及单纯诱导组从2周开始有红色的阳性染色矿化结节出现,对照组为阴性,结节数目随时间推移而增多。实验组及单纯诱导组1周时有少量骨钙素染色阳性,2、3及4周时大量出现,对照组为阴性。结论应用Cbfα1可促进兔MSCs向成骨细胞分化,其分子机制仍需进一步深入研究。

氟对成纤维细胞和成骨细胞核心结合因子α1表达的影响

目的观察不同剂量氟化物在不同时间段对成纤维细胞和成骨细胞核心结合因子α1(cbfa1)表达的影响。方法采用细胞培养的方法,将细胞分为对照组和6个染氟组(0．1、1．0、100．0、1000．0、10 000．0、20 000．0μg／L),分别在5个染氟时间段(2、4、24、48、72 h)收集培养细胞培养上清液和细胞,应用酶联免疫吸附(ELISA)法和免疫组化方法检测cbfa1蛋白含量和表达,应用RT-PCR方法检测染氟48 h cbfa1 mRNA的表达。结果①与对照组比较(2．13±0．07),成纤维细胞染氟48 h时,cbfa1蛋白含量在0．1、1．0、100．0、1 000．0、20 000．0μg／L组[(2.35±0．08)、(2．28±0．09)、(2．32±0．09)、(2．25±0．08)、(2．28±0．09)]及染氟72 h的10 000．0μg／L组(2．48±0．22)明显升高;染氟48 h,cbfa1 mRNA表达呈升高趋势,其中10 000．0μg／L组(1．29±0．30)与对照组(1．02±0．12)比较,明显增强;免疫组化结果显示,染氟48 h的0．1μg／L组成纤维细胞内可见明显cbfa1阳性表达。②在成骨细胞,染氟组cbfa1蛋白含量较对照组有不同程度增加;染氟48 h时,0．1、1．0、100．0、1 000．0μg／L组cbfa1 mRNA表达较对照组(1．27±0．20)升高,其中0．1μgL组(1．34±0．19)明显升高。结论氟能提高成纤维细胞和成骨细胞cbfa1蛋白含量,促进cbfa1和cbfa1 mRNA表达,成纤维细胞可能在氟骨症骨周化骨的发生中起重要作用。

构建股骨骨折合并脑损伤模型大鼠低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达

背景:骨折及脑损伤后造成的低氧环境导致一系列相关因子的表达,包括低氧诱导因子1α和核心结合因子α1,二者在骨折愈合中具有重要的调控作用。但骨折合并脑损伤后骨折愈合加速是否与低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达相关还不十分清楚。目的:构建脑损伤大鼠模型,对低氧诱导因子1α和核心结合因子α1在大鼠股骨骨折合并脑损伤及单纯股骨骨折模型的骨折愈合过程中表达的对比,评价脑损伤对骨折愈合的影响。方法:将大鼠随机分为空白组、单纯股骨骨折组和股骨骨折合并脑损伤组。造模后1,2,3,5周处死动物,通过股骨骨折断端X射线评分及骨痂组织进行苏木精-伊红染色评价模型大鼠不同时间点骨折愈合情况,通过免疫组织化学检测,评价3组低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达。结果与结论:股骨骨折合并脑损伤组的骨折愈合情况优于单纯股骨骨折组。单纯股骨骨折和股骨骨折合并脑损伤两组的组内1,2,3,5周低氧诱导因子1α和核心结合因子α1的表达比较,差异有显著性意义(P<0.05);同一时间段组间比较,单纯股骨骨折组和股骨骨折合并脑损伤组均明显高于空白组,股骨骨折合并脑损伤组高于单纯股骨骨折组(P<0.05)。结果证实,骨折合并脑损伤模型大鼠低氧诱导因子1α和核心结合因子α1表达更为突出,这可能是骨折合并脑损伤后骨折愈合加速的重要原因。

核心结合因子α1与正畸牙移动中牙槽骨改建的相关性研究

目的:通过对大鼠实验性正畸牙移动过程中牙周组织内的核心结合因子α1(core binding factor α1,cbfα1)进行定性及定量分析,研究cbfα1在牙槽骨改建过程中与成骨细胞分化的相关性。方法:选用8周龄雄性成年Wistar大鼠42只,随机分为加力0、1、3、5、7、10、14d组,每组6只。分别在固定加力装置后0、1、3、5、7、10、14d时处死动物,制备标本,进行免疫组化染色。采用SPSS11.0软件包进行Dunnett检验,研究正畸牙移动过程中cbfα1的表达变化。结果:在正常大鼠的牙周组织中,cbfα1呈弱阳性表达。各加力组中cbfα1的阳性表达随时间变化呈先升高后回降的趋势,压力区的牙槽骨表面cbfα1阳性表达显著低于张力区牙槽骨表面(P<0.01)。结论:cbfα1参与了正畸牙移动的骨改建过程,与成骨细胞的分化密切相关,从而促进了牙周组织的改建和稳定。

激素性股骨头坏死模型兔坏死股骨头内核心结合因子α1蛋白表达与普伐他汀的干预

背景:洛伐他汀、辛伐他汀等他汀类降脂药可上调核心结合因子α1的蛋白表达,促进骨坏死修复。目的:观察普伐他汀对激素性股骨头坏死兔模型核心结合因子α1的蛋白表达的影响。方法:将80只新西兰白兔分为对照组18只,实验组62只。实验组制备兔激素性股骨头缺血坏死模型。造模第5周,将造模成功兔36只分为模型组和他汀组,每组18只。他汀组以普伐他汀(1.2mg/kg)1次/d灌胃,模型组和对照组以等体积的蒸馏水灌胃。造模后8,12,16周分批处死动物,截取股骨头行免疫组化检测核心结合因子α1的蛋白表达。结果与结论:对照组不同时相点股骨头核心结合因子α1的蛋白表达均为阳性;模型组造模后8周及12周表达均为阴性,造模后16周表达呈弱阳性;他汀组造模后8,12,16周表达均为阳性,且随着用药时间的延长表达逐渐增强。结果说明普伐他汀可有效促进早期激素性股骨头坏死兔模型坏死股骨头核心结合因子α1的蛋白表达。

核心结合因子α1在成牙本质细胞样细胞MDPC-23中的表达

目的:观察核心结合因子α1(cbfα1)在成牙本质细胞样细胞MDPC-23中的表达情况,为进一步研究cbfα1在牙胚发育,尤其是成牙本质细胞分化过程中的作用奠定基础。方法:通过瞬时转染、免疫荧光染色、W esternb lot等方法,研究转染或BMP-2刺激时,cbfα1在MDPC-23细胞中的表达情况。结果:在普通MDPC-23细胞中未发现cbfα1的表达;转染pcDNA3-cbfα1 48 h后,cbfα1表达量最高;加入骨形态发生蛋白-2(BMP-2)刺激,可诱导内源性cbfα1的表达,但表达量小于pcDNA3-cbfα1组;而pcDNA3-cbfα1组和BMP-2+pcDNA3-cbfα1组的cbfα1表达量差异无显著性意义(P>0.05)。结论:转染pcDNA3-cbfα1 48 h后,cbfα1表达量最高,可作为今后研究的观测点。

氟对成纤维细胞核心结合因子α1及增殖活性量-效关系的影响

背景:氟通过刺激成纤维细胞向成骨细胞方向转化,可能在氟性骨损伤骨周化骨中起重要作用。核心结合因子α1作为成骨细胞特异性转录因子,是成骨细胞分化以及成骨的必要条件。目的:观察不同质量浓度氟化钠干预体外培养新生大鼠皮肤成纤维细胞不同时间后核心结合因子α1的表达及成纤维细胞的增殖活性。方法:采用细胞原代培养方法,将细胞分为对照组和7个染氟组(0.0001,0.001,0.01,0.1,1,10,20mg/L),分别在4个染氟时间段(24,48,72,96h)收集细胞培养上清液,应用酶联免疫法测定核心结合因子α1的含量;采用四甲基偶氮唑盐比色法观察氟对成纤维细胞增殖活性的影响。结果与结论:氟能提高成纤维细胞核心结合因子α1的表达,核心结合因子α1可能在成纤维细胞致氟性骨损伤骨周化骨中起重要作用。氟对成纤维细胞的增殖活性的影响呈一定的剂量-时间-效应关系,短时间-低剂量的氟可提高成纤维细胞的增殖活性,随着染氟剂量的增加及染氟时间的延长,成纤维细胞增殖活性明显减弱。

核心结合因子α1对牙本质涎磷蛋白基因转录调控的影响

目的观察核心结合因子α1(corebindingfactorα1,cbfα1)对牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)基因启动活性的影响。方法选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,DSPP基因上游2.6kb片段(-2475bp～+53bp)为启动子。通过采用瞬时转染、报告基因等方法,用SPSS10.0统计软件包对结果进行统计学分析,观察在MDPC-23中,cbfα1对DSPP基因启动子启动活性的影响。结果在MDPC-23细胞中,pGL3-Enhancer-2.6K+pcDNA3-cbfα1共转染组荧光素酶的表达量显著小于pGL3-Enhancer-2.6K+pcDNA3共转染组(P<0.01)。结论cbfα1对DSPP基因上游-2475bp～+53bp区域的启动活性有抑制作用。

核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞成骨表型转化

目的:观察细胞因子诱导成骨的共同信号分子核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,其成骨表型转变的可能性。方法:实验于2003-10/2004-10在解放军第三军医大学新桥医院骨科中心实验室完成。采用脂质体转染技术行核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,成骨标志基因I型胶原、骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶、核心结合因子α1mRNA的表达采用反转录-聚合酶链反应检测,骨钙素的表达采用免疫细胞化学染色检测,Cbfa蛋白的表达采用Westernblot检测。结果:①NIH3T3成纤维细胞经核心结合因子α1基因转染后出现骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶的表达,I型胶原表达增强,说明在转录水平有成骨标志基因的表达。②免疫细胞化学染色检测到了骨钙素的表达,显示NIH3T3细胞已发展为成骨细胞。③Westernblot检测到了核心结合因子α1蛋白的表达,证实了成纤维细胞发生了表型的改变。结论:核心结合因子α1基因转移NIH3T3成纤维细胞改变了成纤维细胞向成骨表型转化,增加了成骨细胞数量,使成骨能力增强成为可能。

核心结合因子α1重组慢病毒感染牙周膜成纤维细胞骨向分化的实验研究

目的观察含人核心结合因子α1(Core binding factor α1,CBFα1)基因的重组慢病毒感染对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)骨向分化的影响。方法将PDLFs分为3组:A组为未感染任何病毒的细胞组;B组为加阴性对照病毒感染的细胞组;C组为加CBFα1重组慢病毒感染的细胞组。应用免疫细胞化学的方法检测目的基因CBFα1在PDLFs中的表达,观察碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和矿化结节形成,评价各组细胞骨向分化的情况。结果免疫细胞化学检测证实了CBFα1在PDLFs中的有效表达。ALP活性检测和矿化结节染色均证实C组细胞骨向分化能力明显高于对照组。结论携带CBFα1基因的重组慢病毒可有效感染PDLFs,并促进其骨向分化,感染的CBFα1得到了有效表达。

核心结合因子α1对人牙本质基质蛋白1基因转录活性的作用

目的:观察核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)基因转录活性的影响。方法:将pCMV-Osf2瞬时转染至体外矿化诱导的HDPSCs中,检测转染后不同时间Cbfα1蛋白的表达变化。将不同长度的DMP1基因启动子片段重组报告基因载体与pCMV-Osf2分别共转染至细胞中,报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果:诱导后的HDPSCs中少量表达Cbfα1,在瞬时转染Cbfα1后,蛋白主要表达于细胞胞质中,并且在转染48 h后表达量达到最高值;Cbfα1可明显增强6个不同长度的DMP1基因启动子片段重组报告基因载体的荧光素酶活性,以pGL3-P-505～+86启动子活性增强最为明显(P<0.05)。计算机分析结果发现,DMP1基因启动子-505～+86 bp区存在Cbfα1的结合位点。结论:Cbfα1可上调人DMP1基因转录活性,是HDPSCs向成牙本质细胞方向分化重要的调节因子之一,DMP1基因启动子序列-199～-185 bp区可能是Cbfα1结合位点。

2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1mRNA表达与骨折的愈合

背景:骨髓间充质干细胞成骨分化与成脂分化方向对骨再生和修复的影响是目前的研究热点,过氧化物酶体增殖物激活受体γ特别是过氧化物酶体增殖物激活受体γ2和核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞分化方向有调控作用。目的:分析2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1的表达变化与骨折愈合障碍的关系。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-08/12在中南大学第三附属医院中心实验室完成。材料:选用雄性SD大鼠30只,按随机数字表法分为2组,对照组10只,实验组20只,分别给予普通饲料、高糖高脂饲料喂养。方法:大鼠喂养8周后断尾法取血,实验组腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg,对照组注射等量枸橼酸盐缓冲液。注射2周后断尾法取血,建立大鼠左胫骨牵引成骨模型,行左胫骨中上段骨干横行截骨,安置特制延长外固定架,牵引14d。主要观察指标:行X射线摄片比较2组大鼠牵引间隙内骨痂的形成;在组织学水平观察牵引骨痂内微骨柱及初始基质前沿形成及骨折两端髓腔内脂肪细胞形成,并计算骨折两端髓腔内脂肪细胞与骨髓腔面积百分比;以反转录-聚合酶链反应法检测双侧股骨骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1mRNA的表达。结果:实验组大鼠高糖高脂饲料喂养8周后,总胆固醇、三酰甘油及空腹胰岛素浓度均高于对照组(P<0.05～0.01);实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素2周后:空腹血糖、总胆固醇及三酰甘油浓度高于对照组(P<0.05～0.01),说明2型糖尿病建立成功。X射线摄片显示,实验组大鼠骨折断端之间牵引骨痂形成明显减少,骨痂组织学检查表现为微骨柱基质排列紊乱,初始基质前沿浅染。组织学检查显示,实验组大鼠骨折两端髓腔内脂肪细胞及脂肪细胞占骨髓腔面积百分比高于对照组(P<0.01)。反转录-聚合酶链反应法检测显示,实验组大鼠双侧股骨骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA表达上调(P<0.05),核心结合因子α1mRNA表达下调(P<0.05)。结论:2型糖尿病大鼠骨折愈合障碍可能与2型糖尿病条件下骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA表达增加及核心结合因子α1mRNA的表达受抑制有关。

兔下颌持续前导后髁突软骨中核心结合因子α1的表达及意义

目的:探讨兔下颌持续功能前导后髁突软骨中核心结合因子α1(corebindingfactorα1,Cbfα1)蛋白的表达及与髁突改建的关系。方法:60只8周龄日本大耳白兔,随机分为实验组和对照组,实验组动物每天24h戴用咬合前导矫正器。实验组与对照组动物分别在3天、1周、2周、4周、8周及12周时处死并取材,用免疫组化方法检测髁突组织内Cbfα1的分布和表达变化,并对其表达进行灰度测定,采用t检验和单因素方差分析对灰度值进行统计学分析。结果:Cbfα1主要在髁突软骨过渡层和肥大层软骨细胞的胞核和胞质中表达,钙化层的软骨细胞和成骨细胞中也可见Cbfα1的表达。实验组兔髁突软骨各层Cbfα1的表达强度均显著高于同期对照组(P<0.05),其中治疗后4周过渡层、肥大层和钙化层的表达均最为明显,分别是71.00±1.52,50.00±0.75和82.00±0.39。结论:下颌持续前导后,Cbfα1的动态变化与下颌髁突适应性生长改建关系密切。

核心结合因子α1在BMP-2调控细胞外基质蛋白表达中的作用

目的:探讨核心结合因子α1(cbfa1)在BMP-2调控体外培养的牙乳头细胞表达细胞外基质蛋白中的作用。方法:采用反义核酸技术,体外阻断培养的牙乳头细胞中cbfα1的表达,分别用RT-PCR、Western印迹等方法观察200ng/mLBMP-2作用6h后细胞中相关基质蛋白,碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨连蛋白(ON)、骨桥素(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)以及牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达,采用SPSS11.0软件包对数据进行方差分析。结果:外源性BMP-2能明显上调牙乳头细胞中ALP、OC含量以及OPN、BSP和ON的表达,当反义阻断cbfα1的表达时,ALP、OC、OPN和BSP的表达显著降低(P<0.01)。结论:cbfα1参与了BMP-2调控体外培养的牙乳头细胞表达细胞外基质蛋白的信号转导过程。

钙黏蛋白11和核心结合因子α1双基因修饰人骨髓间充质干细胞

背景:钙黏蛋白11对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,可促进细胞的黏附性能。利用核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,有望实现多能干细胞的成骨定向分化,并在诱导成骨分化的级联效应中发挥重要的信号作用。目的:拟采用腺病毒为载体,介导钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因修饰骨髓间充质干细胞,观察两基因的表达情况。设计、时间及地点:细胞-基因学实验,于2008-08在珠江医院中心实验室完成。材料:人骨髓间充质干细胞来源于1例胸椎骨折男性患者,由珠江医院提供,患者对实验知情同意。钙黏蛋白11全长cDNA质粒由日本神户理研Riken分子生物中心Takeichi教授惠赠,全长核心结合因子α1基因质粒由美国Baylor医学院Ducy博士提供,pAdeasy腺病毒系统由美国约翰霍普金斯遗传所Bert博士馈赠。方法:Percoll密度梯度离心+贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞。利用PCR技术获得钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因,分别构建到腺病毒穿梭载体上,然后分别通过同源重组获得重组腺病毒质粒,再将两病毒质粒包装获得重组病毒液,最后通过病毒将两基因导入骨髓间充质干细胞。主要观察指标:Westernblot法检测钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因在人骨髓间充质干细胞中的表达。结果:获得携带钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因的病毒液,将其感染人骨髓间充质干细胞后,以Westernblot检测两种基因同时获得高表达。结论:实验成功构建钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因腺病毒载体,通过病毒转染人骨髓间充质干细胞,二者获得高效表达。

核心结合因子α1对牙本质涎磷蛋白基因启动子不同片段启动活性的影响

目的:观察核心结合因子α1(cbfα1)对牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因启动子不同片段启动活性的影响。方法:选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,利用含DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体,采用报告基因方法观察cbfα1对DSPP基因启动子不同片段启动活性的影响。结果:在MDPC-23细胞中,pcDNA3-cbfα1共转染组相对于pcDNA3共转染组,pGL3-Enhancer-1(-4496～-3499 bp)、pGL3-Enhancer-2(-3519～-2515 bp)、pGL3-Enhancer-2-3、pGL3-Enhancer-95(-95～54 bp)活性增强(P<0.05);pGL3-Enhancer-1-3、pGL3-Enhancer-2.6 K(-2475～53 bp)活性降低(P<0.05)。结论:cbfα1可以调控DSPP基因的表达,cbfα1对DSPP基因启动子不同片段的启动活性有不同的调节作用。

高磷对大鼠血管平滑肌细胞钙化及核心结合因子α1表达的影响

[目的]研究高磷对体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙沉积以及核心结合因子α1(Cbfα1)的影响。[方法]体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,根据培养基中磷浓度分为:正常磷浓度(磷浓度1.4 mmol/L)和高磷浓度(磷浓度2.4 mmol/L)组,培养第3 d、6 d、9 d后,BCA法检测细胞内钙含量,放射免疫方法检测培养液骨钙素含量,ELISA检测细胞Cbfα1与DNA结合活性。[结果]正常磷浓度组VSMCs钙含量在9 d内无明显变化。高磷浓度组第3、6、9天细胞钙含量比第0天明显增高(P<0.01)。高磷浓度组细胞钙含量在第3、6、9天均明显高于相同时间点正常磷浓度组(P<0.05)。培养3 d后,高磷浓度组培养上清液骨钙素水平明显高于正常磷浓度组,(14.62±2.93)pg/μg蛋白vs(2.83±0.64)pg/μg蛋白,P<0.01。Cbfα1活性在正常磷浓度组细胞9 d内无明显变化;但在高磷浓度组6、9天与第0天比明显增强(P<0.05)。高磷浓度组在第6、9天细胞Cbfα1活性与相同时间点正常磷浓度组比明显增强(P<0.05)。[结论]高磷可直接刺激大鼠VSMC的钙沉积和骨钙素产生,其作用可能与高磷上调VSMC的Cbfα1表达有关。