Runt相关基因2/核心结合因子a1在小鼠牙周组织发育中的免疫组化定位研究

目的探讨Runt相关基因2/核心结合因子a1(Runx2/Cbfa1)在小鼠牙周组织发育过程中的时空表达及意义。方法建立BALB/c小鼠牙周发育动物模型,采用免疫组化方法检测Runx2/Cbfa1在小鼠出生后各期牙周组织发育中的表达及特点。结果Runx2/Cbfa1在牙齿发育过程中的表达具有时空特异性,在牙根开始发育之前,仅在牙槽骨及成骨细胞中表达;当牙根开始发育即从第11天以后各期,在根部牙周膜细胞、成牙骨质细胞及成骨细胞中均呈阳性表达,但牙槽骨呈阴性表达。结论Runx2/Cbfa1在成牙骨质细胞及成骨细胞的分化及牙植骨的形成具有重要作用,可能在牙周组织的发育中发挥作用。

2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1mRNA表达与骨折的愈合

背景:骨髓间充质干细胞成骨分化与成脂分化方向对骨再生和修复的影响是目前的研究热点,过氧化物酶体增殖物激活受体γ特别是过氧化物酶体增殖物激活受体γ2和核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞分化方向有调控作用。目的:分析2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1的表达变化与骨折愈合障碍的关系。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-08/12在中南大学第三附属医院中心实验室完成。材料:选用雄性SD大鼠30只,按随机数字表法分为2组,对照组10只,实验组20只,分别给予普通饲料、高糖高脂饲料喂养。方法:大鼠喂养8周后断尾法取血,实验组腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg,对照组注射等量枸橼酸盐缓冲液。注射2周后断尾法取血,建立大鼠左胫骨牵引成骨模型,行左胫骨中上段骨干横行截骨,安置特制延长外固定架,牵引14d。主要观察指标:行X射线摄片比较2组大鼠牵引间隙内骨痂的形成;在组织学水平观察牵引骨痂内微骨柱及初始基质前沿形成及骨折两端髓腔内脂肪细胞形成,并计算骨折两端髓腔内脂肪细胞与骨髓腔面积百分比;以反转录-聚合酶链反应法检测双侧股骨骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1mRNA的表达。结果:实验组大鼠高糖高脂饲料喂养8周后,总胆固醇、三酰甘油及空腹胰岛素浓度均高于对照组(P<0.05～0.01);实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素2周后:空腹血糖、总胆固醇及三酰甘油浓度高于对照组(P<0.05～0.01),说明2型糖尿病建立成功。X射线摄片显示,实验组大鼠骨折断端之间牵引骨痂形成明显减少,骨痂组织学检查表现为微骨柱基质排列紊乱,初始基质前沿浅染。组织学检查显示,实验组大鼠骨折两端髓腔内脂肪细胞及脂肪细胞占骨髓腔面积百分比高于对照组(P<0.01)。反转录-聚合酶链反应法检测显示,实验组大鼠双侧股骨骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA表达上调(P<0.05),核心结合因子α1mRNA表达下调(P<0.05)。结论:2型糖尿病大鼠骨折愈合障碍可能与2型糖尿病条件下骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA表达增加及核心结合因子α1mRNA的表达受抑制有关。

17β-雌二醇通过激活核心结合蛋白因子2诱导牙髓干细胞成牙本质分化

目的:探讨17β-雌二醇(E2)调节牙髓干细胞(DPSCs)成牙本质分化的分子机制。方法:对体外培养的人DPSCs施加1μmol/L E2刺激,通过qRT-PCR、Western blot和免疫荧光技术检测成牙本质分化标志性基因及下游相关因子表达变化,阐明E2调节DPSCs成牙本质分化的机制。结果:E2上调DPSCs中DSPP和DMP1mRNA表达和ALP活性,增强DSPP在细胞中的染色强度,促进DPSCs的成牙本质分化。在E2诱导的DPSCs成牙本质分化过程中,E2激活Runx2活性,RNA干扰Runx2明显减弱DSPP和DMP1 mRNA表达以及DSPP染色强度。结论:雌激素E2部分通过激活Runx2活性促进DPSCs的成牙本质分化。

血清维生素K2、补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白3和核心结合因子a1与冠状动脉钙化的相关性研究

目的探讨人血清中维生素K2(VK2)、补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白3(CTRP3)和核心结合因子a1(Cbfa1)水平与冠状动脉钙化(CAC)的关系。方法选取2016年6～12月就诊哈尔滨医科大学附属第一医院,因胸痛行冠状动脉64排CT造影检查的患者100例,根据结果分为CAC组60例和非冠状动脉钙化组(NCAC组)40例。CAC组根据冠状动脉钙化积分又分为轻度组23例、中度组19例和重度组18例。采用酶联免疫吸附法测定各组患者血清CTRP3、Cbfa1和VK2水平,其他各项指标来源于病例资料,比较两组患者的血清CTRP3、Cbfa1、VK2和其他各项指标水平。分析血清VK2、CTRP3和Cbfa1之间以及与其他变量的相关性,多因素回归分析载脂蛋白A、载脂蛋白B/载脂蛋白A、同型半胱氨酸、VK2与CAC之间的关系。结果与NCAC组比较,CAC组年龄偏大、合并高血压和糖尿病较多,CAC组血清总胆固醇、空腹血糖、同型半胱氨酸、钙离子水平和载脂蛋白B/载脂蛋白A比值均升高,高密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白A水平均降低(均为P<0.05)。两组患者血清CTRP3和Cbfa1水平比较,差异无统计学意义(均为P>0.05),但CAC组血清VK2水平较NCAC组明显降低[(2.92±0.80)μg/L比(3.57±0.59)μg/L,P=0.012]。Pearson相关性分析显示,血清VK2水平与糖尿病呈负相关(r=-0.317,P=0.046),血清CTRP3水平与空腹血糖呈负相关(r=-0.561,P=0.048),血清Cbfa1与ALP呈负相关(r=-0.673,P=0.023)。Logistic回归分析显示,VK2是CAC的独立影响因素(OR:0.251,95%CI:0.074～0.844,P=0.025)。结论血清CTRP3、Cbfa1水平与CAC无相关性,VK2水平与CAC呈负相关,可作为CAC的独立预测因子。

降钙素经ERK-MAPK信号通路调控成骨细胞核心结合因子a1mRNA表达

目的研究降钙素对成骨细胞核心结合因子a1(cbfa1)mRNA表达情况以及细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在这一过程中的作用。方法取24 h内新生SD大鼠颅骨培养成骨细胞,分别加入不同浓度降钙素(0.01、0.1、1 ng/mL)和一定浓度ERK特异性抑制剂U0126进行干预,应用RT-PCR技术检测成骨细胞cbfa1 mRNA的表达情况;应用Western Blot-ting技术检测phos-ERK 1/2蛋白表达情况;采用Independent-Samples检验法分析比较各组间总体均值差异。结果加入0.01、0.1、1 ng/mL的降钙素干预后,成骨细胞表面cbfa1mRNA的表达随降钙素浓度的增加而增强,且中、高浓度组与空白对照组比较差异具有非常显著意义(P<0.01),此外降钙素刺激了phos-ERK1/2蛋白的表达。U0126可阻断以上所有效应。结论降钙素可上调成骨细胞cbfa1mRNA的表达,且ERK-MAPK信号通路参与了此过程。

外周血核心结合因子-β核苷酸结合寡聚化结构域样受体3组织抑制剂在膝骨关节炎中的表达及与病情的相关性分析

目的分析外周血核心结合因子-β(Cbf-β)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)、组织抑制剂(TIMP-1)在膝骨关节炎中的表达及与病情的相关性。方法选取2021年2月至2022年2月河南神火集团总医院收治的膝骨关节炎患者150例设为研究组,另选取同期在河南神火集团总医院进行体检的健康人群150名设为对照组。分析2组人群外周血Cbf-β、NLRP3、TIMP-1水平表达情况。使用磁共振成像对患者进行检测,随后按照Recht标准将膝骨关节炎分为四级,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级,分析不同病情下患者外周血Cbf-β、NLRP3、TIMP-1水平表达情况及三者的相关性。结果与对照组相比,研究组Cbf-β、TIMP-1水平较高,NLRP3水平较低,差异具有统计学意义(P<0.05);与Ⅰ级患者相比,Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级患者Cbf-β、TIMP-1水平呈不断上升趋势,NLRP3呈不断下降的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05);Cbf-β、NLRP3呈负相关(r=-9.068,P=0.003);Cbf-β、TIMP-1呈正相关(r=11.830,P=0.001);NLRP3、TIMP-1呈负相关(r=-22.820,P=0.001);Cbf-β、TIMP-1与膝骨关节Recht等级呈正相关;NLRP3与膝骨关节炎Recht等级呈负相关。结论外周血Cbf-β、NLRP3、TIMP-1在膝骨关节炎中呈现出异常表达,三者在膝骨关节炎中存在着相关性,且Cbf-β、TIMP-1与膝骨关节Recht等级呈正相关;NLRP3与膝骨关节炎Recht等级呈负相关。说明三者与膝骨关节炎密切相关,对其检测有着一定的诊断价值。

转录因子Runx2、Osterix与骨髓间质干细胞的成骨分化

在骨髓间质干细胞向成骨细胞的分化过程中,Runx2与Osterix是两个极为重要的转录因子。Runx2又称核心结合因子,属于runt域基因家族,体内外实验均表明Runx2为骨髓间质干细胞成骨分化和骨发育所必需,Runx2基因是骨形成的关键基因。而Osterix则是一种新近发现的含锌指结构的转录因子,它虽不是Runx2表达所需的转录因子,但其位于成骨细胞分化路径中Runx2的下游调控成骨细胞的生成。

转化生长因子β对成骨细胞增殖、BMP-2及Cbfal基因表达的影响

目的:通过转化生长因子β(TGF-β)对体外成骨细胞增殖、骨形态蛋白-2(BMP-2)及核心结合因子1(Cbfal)基因表达的影响,探讨TGF-β对骨代谢影响的可能机制。方法:不同浓度的TGF(0、0.01、100ng/ml)刺激体外培养的大鼠成骨细胞,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,用半定量RT-PCR法检测成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达。结果:TGF-β可明显促进成骨细胞增殖(P<0.05),并促进成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达(P<0.01),具有浓度依赖性。结论:TGF-β可促进成骨细胞的增殖、分化及成熟,可能是通过增强BMP-2、Cbfal基因的表达来实现的。

骨质疏松性椎体压缩性骨折患者血清BMP-2,Runx2水平对术后骨折延迟愈合的预测价值

目的探讨骨质疏松性椎体压缩性骨折(Osteoporotic vertebral compressibility fracture,OVCF)患者血清骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、核心结合因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)水平对术后骨折延迟愈合的预测价值。方法选取2020年1月-2023年4月徐州医科大学附属淮安医院骨科收治的260例OVCF患者为研究对象,均采用经皮椎体成形术(Percutaneous vertebroplasty,PVP)或椎体后凸成形术(Percutanous kyphoplasty,PKP)治疗,根据术后3个月骨折愈合情况分延迟愈合组、正常愈合组。分析OVCF患者术后骨折延迟愈合的影响因素及血清BMP-2,Runx2水平对术后骨折延迟愈合的预测价值。绘制决策曲线和临床影响曲线,评价血清BMP-2,Runx2水平对术后骨折延迟愈合的价值。结果260例患者术后无失访,22例出现骨折延迟愈合,发生率为8.46%(22/260)。延迟愈合组年龄、吸烟比率、合并糖尿病比率、合并甲状腺疾病比率、有椎体裂隙征比率大于正常愈合组,骨密度T值、术前和术后3个月血清BMP-2,Runx2水平小于正常愈合组,差异有统计学意义(P<0.05)。合并糖尿病、有椎体裂隙征是OVCF患者术后骨折延迟愈合的独立危险因素,骨密度T值、BMP-2,Runx2是OVCF患者术后骨折延迟愈合的独立保护因素(P<0.05)。BMP-2,Runx2联合预测OVCF患者术后骨折延迟愈合对应AUC值为0.856。阈值在0.10~0.63范围内,BMP-2,Runx2联合评估模型评估OVCF患者术后骨折延迟愈合的净受益率优于单独检测。在阈值概率为0.26时,被该模型划分入高风险的人数与真阳性人数基本达成一致。结论OVCF患者血清BMP-2,Runx2水平降低,二者联合检测对术后骨折延迟愈合具有较高的预测效能。

异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞相关细胞因子表达影响的实验研究

为探讨异补骨脂素加锌对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞相关基因表达的影响,用改良的组织块培养法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,在成骨细胞体系中加入异补骨脂素与锌,以雌激素为阳性对照,空白组为阴性对照。结果显示:异补骨脂素加锌较单纯应用异补骨脂素或硫酸锌在48 h时促体外大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原的表达;异补骨脂素加锌组可以明显上调大鼠成骨细胞TGF-β1的细胞信号转导因子Smad4 mRNA的表达(P<0.01);能促进Runx2/Cbfa1 mRNA的表达(P<0.05)。与空白对照组相比,异补骨脂素组,异补骨脂素加锌组均能增强Osterix mRNA的表达(P<0.05)。与单纯应用异补骨脂素或者锌相比,异补骨脂素与锌联合应用能够协同增效,对促进体外培养的成骨细胞相关转录因子的表达更加明显,探讨了异补骨脂素及其与锌配伍调节骨代谢的分子机制,为提高骨质疏松症的临床疗效以及抗骨质疏松新药的开发提供了实验依据。

Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化相关基因表达的影响

背景:Runx2在成骨分化的信号途径中起核心作用,在诱导干细胞成骨分化及促进骨愈合方面具有重要的研究意义。目的:观察Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化的影响。方法:(1)扩增Runx2基因,利用腺病毒载体构建Runx2重组腺病毒(pA d-Runx2),检测病毒滴度后用重组腺病毒感染脐血间充质干细胞,并于荧光显微镜下观察荧光表达变化;(2)感染后1,3,7,14 d采用实时荧光定量PCR及Western blot检测脐血间充质干细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP的mRNA和蛋白表达。结果与结论:(1)成功制备pA d-Runx2重组腺病毒,病毒滴度为1.7×10^(10)pfu/L;(2)Runx2重组腺病毒感染脐血间充质干细胞后细胞形态呈成骨样细胞改变,对照组细胞无明显变化;(3)感染组细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP mRNA和蛋白的表达量随感染时间的增加均有不同程度的上调;(4)结果表明,高表达Runx2基因腺病毒感染脐血间充质干细胞,能够上调BMP-2、OCN、ALP基因的表达,从而促进脐血间充质干细胞的成骨分化。

慢性肾衰竭大鼠主动脉弹性功能与血管基质金属蛋白酶2表达及钙化间的关系

目的探讨主动脉基质金属蛋白酶2(MMP-2)在慢性肾衰竭大鼠主动脉弹性功能变化中的作用及机制。方法将20只大鼠随机分为正常对照组、慢性肾衰竭组、慢性肾衰竭血管钙化组。8周造模成功后测量大鼠主动脉脉搏波传导速度(PWV),分别用逆转录-聚合酶链反应和免疫组织化学方法检测大鼠主动脉核心结合因子α1(Cbfα1)及MMP-2 mRNA和蛋白的表达。EVG染色方法检测主动脉弹性纤维的改变。结果慢性肾衰竭血管钙化组PWV值和主动脉Cbfα1、MMP-2的mRNA及蛋白表达均高于慢性肾衰竭组及正常对照组(P<0.05),PWV与主动脉MMP-2表达呈正相关(r=0.754,P=0.02)。结论慢性肾衰竭大鼠血管弹性功能下降的可能机制之一是血管壁MMP-2表达升高导致弹性蛋白降解,同时后期的血管钙化也参与其中。

珍珠层水溶性基质对兔骨髓基质干细胞BMP-2和Cbfα1基因表达的影响

目的从珍珠层水溶性基质(WSM)对兔骨髓基质干细胞分泌的骨形成蛋白-2和核心结合因子基因表达的影响入手,研究WSM产生成骨作用的机制和途径。方法培养新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(BMSCs),并用低温下提取的珍珠层水溶性基质作用后,检测不同浓度WSM作用下碱性磷酸酶的活性,制定剂量-效应曲线,确定量效关系;采用一步RT-PCR方法检测不同浓度WSM诱导兔BMSCs后骨形成蛋白-2和核心结合因子的基因表达量并进行统计学分析。结果WSM可以增加兔BMSCs中碱性磷酸酶的活性,在150～200μg/ml浓度之间作用明显,碱性磷酸酶活性增加显著;WSM诱导兔BMSCs后骨形成蛋白的表达量明显增加,核心结合因子的表达量无明显变化。结论WSM通过增加骨形成蛋白-2的基因表达量诱导兔BMSCs向成骨细胞分化,与核心结合因子的作用关系不明显。

深刺加电针法对膝骨关节炎兔软骨细胞HDAC4和Runx2的影响

目的:观察深刺加电针法对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)软骨细胞组蛋白脱乙酰基酶4(histone deacetylase 4,HDAC4)和核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)表达的影响。方法:新西兰兔40只,随机分为2组,正常组(n=10)和造模组(n=30),正常组不予任何处理,造模组采用Hulth-Telhag手术法建立左膝骨关节炎模型,X线检查造模情况,造模成功者随机分为3组:模型组(n=10)、深刺加电针组(n=10)、普通电针组(n=10)。模型组不做治疗,深刺加电针组和普通电针组取内外膝眼、足三里、阴陵泉、梁丘穴,留针20 min,每日1次,5次为1个疗程,持续4个疗程。4周后观察Lequesne MG膝关节评估级别、HE染色观察软骨细胞的组织学改变,甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态,透射电镜观察细胞的超微形态结构,免疫组织化学法、蛋白质印迹法(Western bolt,WB)检测兔软骨细胞HDAC4和Runx2蛋白表达。结果:深刺加电针组、普通电针组和模型组兔行为学发生明显改变;与正常组比较,模型组关节活动度变小,软骨细胞排列紊乱、数目减少,HDAC4蛋白表达降低,Runx2表达升高(均P=0.000);与模型组相比,深刺加电针组和普通电针组膝关节活动度显著提高,软骨细胞排列有序、数目较多,HDAC4的蛋白表达升高,Runx2蛋白的表达降低(均P=0.000);深刺加电针组和普通电针组比较也有统计学差异(均P=0.000)。结论:深刺加电针法能上调HDAC4和下调Runx2的表达,从而抑制兔膝骨关节软骨细胞肥大分化,这可能是治疗KOA的机制之一,深刺加电针法较普通电针法能更有效地治疗KOA,可能通过增强针感和得气程度从而更好发挥疗效。

血清Runx2 mRNA表达与尿毒症患者动脉血管钙化的关系研究

目的探讨血清Runt相关转录因子2(Runx^(2))mRNA表达与尿毒症患者动脉血管钙化的关系。方法选取行自体动静脉内瘘成形术及切除重造术的尿毒症患者78例并收集患者的血管组织、血清样本及临床资料。根据硝酸银染色结果进行钙化评分,并将患者分为钙化组(n=23)和未钙化组(n=55)。采用免疫组化法检测血管组织的Runx^(2)表达水平,实时荧光定量PCR检测血清Runx^(2) mRNA表达水平。比较2组患者临床各指标的变化,通过线性回归分析各指标对血管钙化的影响因素,通过受试者工作特征(ROC)曲线评价血清Runx^(2) mRNA表达水平对血管钙化的预测能力。结果硝酸银染色结果显示,与未钙化组比较,钙化组黑色沉积显著增多;免疫组化结果显示,钙化组Runx^(2)评分显著增高(P<0.01)。与未钙化组比较,钙化组年龄、透析龄、血清Runx^(2) mRNA表达水平、血磷、全段甲状旁腺素(iPTH)均显著增高,血白蛋白和血钙显著降低(P<0.05)。Spearman相关分析显示,血清Runx^(2) m RNA水平、年龄、透析龄、血磷、i PTH、Runx^(2)评分与钙化评分呈正相关,血白蛋白和血钙与钙化评分呈负相关(P<0.05)。多元线性回归分析结果显示,血清Runx^(2) mRNA表达水平升高、高透析龄、低血钙是尿毒症患者动脉血管钙化的影响因素(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清Runx^(2) mRNA、透析龄和血钙三者联合诊断预测血管钙化的曲线下面积(AUC)为0.934。结论血清Runx^(2) mRNA表达是尿毒症患者动脉血管钙化的独立危险因素,可能成为诊断预测尿毒症患者动脉血管钙化的生物标志物。

钛表面粗糙度对成骨细胞核心结合因子α1亚基基因表达的影响

目的 通过研究种植体表面粗糙度对成骨细胞黏附、增殖、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）含量以及核心结合因子α1亚基（core bindingfactor alpha 1 subunit,Cbfα1）基因表达的影响,探讨种植体表面形态影响界面生物学反应的可能途径.方法 直径15 mm、厚2 mm的纯钛圆盘试件48个,均分为4组,每组12个.分别采用粒度为88～125μm（微度粗糙组）、125～150μm（中度粗糙组）、250～500μm（重度粗糙组）的金刚砂颗粒喷砂,后两组试件再用10%的盐酸、硫酸混合液处理5 min;剩余1组未处理作为对照组.测试4组试件表面粗糙度.将成骨细胞接种于4组试件表面,采用扫描电镜、吖啶橙荧光染色及考马斯亮蓝染色检测试件粗糙度对成骨细胞黏附、增殖的影响.采用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定成骨细胞ALP含量的变化.采用荧光实时定量聚合酶链反应测定成骨细胞Cbfα1基因表达的变化.结果 处理后微、中、重度粗糙组和对照组的粗糙度分别为（1.00±0.20）、（1.67±0.08）、（2.40±0.20）和（0.12±0.03）μm.3个粗糙组成骨细胞的数量及ALP含量均高于对照组（P＜0.05）.与对照组相比,粗糙表面上Cbfα1的mRNA水平明显增加（P＜0.05）;中度粗糙组为（0.93±0.03）;微度粗糙组次之,为（0.50±0.03）;重度粗糙组最低,为（0.37±0.07）;对照组仅为（0.10±0.06）.结论 种植体表面粗糙度的差异可造成成骨细胞骨源性基因Cbfα1表达及ALP含量不同.粗糙度在1～2μm范围内成骨细胞的生长、ALP含量及Cbfα1基因的表达较强.

RNA干扰沉默VDR基因对小鼠成骨细胞Dmp1、Cbfa1及BMP-2 mRNA表达的影响

目的:利用RNA干扰技术,阻断VDR在小鼠成骨细胞株mc3t3-E1中的表达,观察VDR表达受抑后对小鼠成骨细胞Dmp1、Cbfa1及BMP-2基因mRNA表达的影响。方法:针对小鼠VDRmRNA144、594、852、3628位点设计、合成4对21核苷酸siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4);在阳离子脂质体介导下转染mc3t3-E1细胞,以空白及非特异性siRNA作为对照,各组于转染24h及72h后收集细胞分别抽提RNA及蛋白。采用RT-PCR法检测细胞中VDRmRNA表达水平的改变,Westernblot法检测VDR蛋白表达的变化,从而筛选有效序列。进一步应用SYBRGreen荧光实时PCR方法定量检测成骨细胞功能基因-Dmp1、Cbfa1及BMP-2基因mRNA表达情况。结果:与空白对照组相比,转染siRNA3、siRNA4的mc3t3-E1细胞VDRmRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01),转染siRNA1、2及非特异性siRNA的mc3t3-E1细胞VDR的表达与对照组相比无显著差异(P>0.05)。荧光定量PCR结果显示,转染siRNA3、siRNA4的mc3t3-E1细胞Dmp1、Cbfa1、BMP-2mRNA表达明显下调(P<0.01)。结论:针对小鼠VDRmRNA852、3628位点设计、合成的siRNA可有效抑制小鼠成骨细胞株VDR的转录和表达;VDR表达受抑可下调mc3t3-E1细胞功能基因Dmp1、Cbfa1、BMP-2mRNA的表达;VDR在维持成骨细胞功能中起着一定的作用。

SD大鼠下颌第一磨牙DLX5、RUNX2、OSX、DSP的表达分析

目的:观察远端缺失同源盒5(distal-less homeobox5,DLX5)、核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)在出生后SD大鼠下颌第一磨牙不同发育阶段的表达情况,探讨其在SD大鼠出生后下颌第一磨牙发育矿化的作用机制。方法:采用免疫组化法分析出生后1、7、14、28d SD大鼠下颌第一磨牙中DLX5、RUNX2、OSX、DSP的表达分布。结果:DLX5在出生后1、7、14d中均有表达,表达量呈现出上升趋势,但是在28d时不表达;RUNX2在出生后1、7、14、28d均表达,表达量在7d时呈现最低;OSX在出生后1、7、14、28d均有表达,表达量在14d时呈现最低;DSP在出生后1、7、14、28d均有表达,表达量呈上升趋势。结论:DLX5、RUNX2、OSX、DSP在大鼠出生后各阶段的表达量不同,具有时空特异性,表明DLX5、RUNX2、OSX、DSP可能对出生后SD大鼠下颌第一磨牙发育及矿化具有一定的调控作用。

同时伴有t(8;21)和inv(16)/t(16;16)染色体易位的急性髓系白血病:实验室诊断

目的探讨同时具有t(8;21)和inv(16)/t(16;16)染色体易位的急性髓系白血病(AML)的实验室诊断特征。方法取患者骨髓进行形态学及流式细胞术检测;应用RHG显带技术进行细胞遗传学分析;应用实时荧光定量聚合酶链式反应(RQ-PCR)和荧光原位杂交技术(FISH)检测AML1/ETO、核心结合因子-β(CBFβ)/平滑肌肌球蛋白重链基因(MYH11)融合基因。结果细胞形态学诊断为急性粒单核细胞白血病伴嗜酸粒细胞增多(M4Eo);流式细胞术分析细胞表达髓系抗原;染色体RHG显带示46,xx,t(8;21)(q22;q22)[11]//46,xx[9];FISH及RQ-PCR检测示AML1/ETO及CBFβ/MYH11阳性。结论该病例的实验室诊断结果对CBF-AML致病机制的研究具有重要意义,也为临床实施个体化治疗方案提供了实验室依据。

VEGF通过MAPK途径上调MC3T3-E1及C2C12细胞中Cbfa1基因的表达

目的研究生长因子VEGF对Cbfa1的调节作用及其与MAPK信号传导通路的关系。方法采用瞬时转染技术和RT-PCR方法。结果在MC3T3．E1细胞中，VEGF（1×10^-8～1×10^-6g·L^-1）作用24小时能够增加Cbfa1基因启动子活性，相对荧光素酶活性分别为对照组的1．29（P〈0．05），1．28（P〈0．01）和1．40（P〈0．05）。而加入PD98059（10μmol/L）后不但抑制了Cbfa1基因启动子活性的基础表达，而且完全阻断了VEGF所诱导的Cbfa1基因启动子活性的增加（P〈0．05）。C2C12细胞中不同浓度的VEGF处理组，其相对荧光素酶活性与对照组相比未见显著性差异。MC3T3-E1细胞中，VEGF处理前后，MC3T3-E1细胞中Cbfa1基因mRNA的表达水平未见显著变化。C2C12细胞中，VEGF处理后，第2天和第3天Cbfa1基因mRNA的表达由处理前的32．63±4．41，分别增加至46．56±2．70（P〈0．01）和50．35±5．62（P〈0．05）。PD98059阻断了C2C12细胞中VEGF对Cbfa1基因mRNA表达的上调作用。结论VEGF部分通过MAPK信号传导通路增加MC3T3-E1和C2C12细胞中小鼠Cbfa1基因启动子活性及mRNA的表达。