17β-雌二醇通过激活核心结合蛋白因子2诱导牙髓干细胞成牙本质分化

目的:探讨17β-雌二醇(E2)调节牙髓干细胞(DPSCs)成牙本质分化的分子机制。方法:对体外培养的人DPSCs施加1μmol/L E2刺激,通过qRT-PCR、Western blot和免疫荧光技术检测成牙本质分化标志性基因及下游相关因子表达变化,阐明E2调节DPSCs成牙本质分化的机制。结果:E2上调DPSCs中DSPP和DMP1mRNA表达和ALP活性,增强DSPP在细胞中的染色强度,促进DPSCs的成牙本质分化。在E2诱导的DPSCs成牙本质分化过程中,E2激活Runx2活性,RNA干扰Runx2明显减弱DSPP和DMP1 mRNA表达以及DSPP染色强度。结论:雌激素E2部分通过激活Runx2活性促进DPSCs的成牙本质分化。

比较浓缩生长因子提取液和富血小板纤维蛋白提取液对成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响

目的:比较浓缩生长因子提取液(concentrated growth factor extract,CGFe)和富血小板纤维蛋白提取液(platelet-rich fibrin extract,PRFe)对成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响。方法:制备CGFe和PRFe。分别采用含CGFe(10%,20%,30%)与PRFe(10%,20%,30%)的DMEM培养基培养MC3T3-E1。分别于培养的第1,3,5,7天,采用MTT法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色法检测细胞中ALP的活性;采用定量RTPCR(quantitative RT-PCR,RT-qPCR)检测培养第3和7天细胞中核心结合蛋白因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)和成骨细胞特异性转录因子(Osterix,Osx)mRNA表达水平。结果:在1,3,5,7 d时,与对照组相比,CGFe与PRFe均能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,差异有统计学意义(均P<0.05)。除第1天外,相同浓度的CGFe与PRFe比较,CGFe组细胞的增殖活性高于PRFe组,差异有统计学差异(均P<0.05)。在1,3,5,7 d时,与对照组相比,CGFe组与PRFe组的ALP活性均明显升高,差异有统计学意义(均P<0.05)。除第1天外,相同浓度的CGFe组与PRFe组比较,CGFe组的ALP活性高于PRFe组,差异有统计学意义(均P<0.05)。在3,7 d时,与对照组相比,CGFe组与PRFe组Osx和Runx2 mRNA表达水平均明显升高,差异有统计学意义(均P<0.05);相同浓度的CGFe组与PRFe组比较,CGFe组Osx mRNA表达水平明显高于PRFe组,Runx2 mRNA表达水平明显低于PRFe组,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:CGFe比PRFe更能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,这可能与其增加ALP活性及上调成骨相关基因Osx的表达有关。

腺相关病毒介导核心结合蛋白因子2对小鼠退行性膝关节炎的保护作用

目的观察腺相关病毒介导核心结合蛋白因子2(Runx2)对小鼠退行性膝关节炎的修复作用。方法60只大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)随机分为假手术组、模型组和Runx2组,模型组和Runx2组小鼠通过小鼠右后肢膝关节前交叉韧带切断手术,建立退行性膝骨关节炎小鼠模型。假手术组小鼠仅做手术,不切断交叉韧带。小鼠建模成功4周后,假手术组和模型组小鼠膝关节腔注射携带空载体的阴性腺相关病毒。Runx2组小鼠膝关节腔注射携带Runx2基因的腺相关病毒。注射21 d后,分析3组小鼠攀爬时间和长距离运动能力;分析关节软骨和滑膜评分的变化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测3组小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL)-1β水平;采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析3组小鼠软骨组织中OSX和骨保护素(OPG)mRNA表达水平。计量数据比较采用单因素方差分析,组建两两比较采用LSD法。结果与模型组小鼠攀爬时间和长运动距离[(539.11±79.21)s和(68.20±13.99)m]比较,Runx2组[(1401.72±102.83)s和(201.58±17.92)m]明显增加,差异有统计学意义(t=9.102,P<0.05;t=6.119,P<0.05)。与模型组小鼠膝关节软骨评分和膝关节滑膜评分[(7.51±1.82)分和(7.25±1.93)分]比较,Runx2组[(5.98±1.86)分和(6.01±1.62)分]明显下降,差异有统计学意义(t=6.195,P<0.05;t=5.018,P<0.05)。与模型组小鼠外周血TNF-α和IL-1β水平[(251.50±43.19)ng/L和(271.57±32.19)ng/L]比较,Runx2组[(78.54±8.19)ng/L和(98.40±10.32)ng/L]明显下降,差异有统计学意义(t=7.001,P<0.05;t=7.193,P<0.05)。与假手术组和模型组骨桥蛋白(OPN)mRNA水平(1.00±0.19和0.94±0.17)比较,Runx2组(2.55±0.23)显著增加,差异有统计学意义(t=2.209,P<0.05;t=2.413,P<0.05)。与假手术组和模型组OSX mRNA水平(0.98±0.14和1.09±0.21)比较,Runx2组(3.01±0.20)显著增加,差异有统计学意义(t=2.501,P<0.05;t=2.216,P<0.05)。结论腺相关病毒介导Runx2可降低退行性膝关节炎小鼠的炎性因子水平,促进成骨细胞成熟,降低膝关节软骨和滑膜的病理变化,提高小鼠运动能力。

过量氟对大鼠切牙成釉细胞Cbfα1表达的影响

目的:了解过量氟对大鼠切牙核心结合因子(Cbfα1)蛋白表达的影响,从蛋白水平探讨氟斑牙的发病机制。方法:20只Wistar大鼠,随机分为实验组(饮用100mg/L氟化水)和对照组(饮用蒸馏水),饲养8周后,处死大鼠,获取切牙标本,通过免疫组化染色进行观察,比较Cbfα1在2组大鼠切牙成釉细胞中的表达情况,采用Axioplan2imaging显微图像分析系统和SPSS10.0软件包分别进行图像和数据统计分析。结果:免疫组化结果显示,Cbfα1在分泌期的成釉细胞胞核中明显表达,实验组阳性率(35.28±1.20)%显著高于对照组(14.41±4.07)%,差异有显著性(P<0.01)。结论:过量氟有可能引起Cbfα1蛋白在分泌期成釉细胞中的表达增多,从而在某种程度上影响釉质的矿化和发育,导致釉质发育障碍。

补肾中药成分配伍调控RUNX2、OSX对大鼠BMSCs成骨分化的影响

目的观察补肾代表中药淫羊藿、补骨脂、女贞子、何首乌有效成分对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及向成骨细胞定向分化的影响。方法将65只SPF级SD雌性大鼠随机分为正常对照组、阳性转化液对照组、补肾中药配伍组(补肾中药1组、2组、3组、4组、5组、6组、7组、8组、9组)、非补肾中药对照组(黄芪甲苷组、川芎嗪组)。通过血清药理学方法,对实验大鼠连续灌胃给药3 d后,取材获得含药血清,使用各组大鼠含药血清培养骨髓间充质干细胞6 d、12 d、18 d;用茜素红染色对钙化结节进行成骨细胞鉴定;应用MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖率,酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,用实时定量PCR法检测核心结合蛋白因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)的基因表达。结果补肾中药有效成分不同配伍含药血清作用于体外培养骨髓间充质干细胞72 h,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖。ALP在12 d达到高峰值。Real-Time PCR结果显示补肾中药有效成分能上调RUNX2、OSX的基因表达。结论补肾中药有效成分配伍能提高骨髓间充质干细胞增殖率,促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,其机制与补肾中药有效成分配伍能上调RUNX2、OSX的基因表达相关。

深刺加电针法对膝骨关节炎兔软骨细胞HDAC4和Runx2的影响

目的:观察深刺加电针法对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)软骨细胞组蛋白脱乙酰基酶4(histone deacetylase 4,HDAC4)和核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)表达的影响。方法:新西兰兔40只,随机分为2组,正常组(n=10)和造模组(n=30),正常组不予任何处理,造模组采用Hulth-Telhag手术法建立左膝骨关节炎模型,X线检查造模情况,造模成功者随机分为3组:模型组(n=10)、深刺加电针组(n=10)、普通电针组(n=10)。模型组不做治疗,深刺加电针组和普通电针组取内外膝眼、足三里、阴陵泉、梁丘穴,留针20 min,每日1次,5次为1个疗程,持续4个疗程。4周后观察Lequesne MG膝关节评估级别、HE染色观察软骨细胞的组织学改变,甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态,透射电镜观察细胞的超微形态结构,免疫组织化学法、蛋白质印迹法(Western bolt,WB)检测兔软骨细胞HDAC4和Runx2蛋白表达。结果:深刺加电针组、普通电针组和模型组兔行为学发生明显改变;与正常组比较,模型组关节活动度变小,软骨细胞排列紊乱、数目减少,HDAC4蛋白表达降低,Runx2表达升高(均P=0.000);与模型组相比,深刺加电针组和普通电针组膝关节活动度显著提高,软骨细胞排列有序、数目较多,HDAC4的蛋白表达升高,Runx2蛋白的表达降低(均P=0.000);深刺加电针组和普通电针组比较也有统计学差异(均P=0.000)。结论:深刺加电针法能上调HDAC4和下调Runx2的表达,从而抑制兔膝骨关节软骨细胞肥大分化,这可能是治疗KOA的机制之一,深刺加电针法较普通电针法能更有效地治疗KOA,可能通过增强针感和得气程度从而更好发挥疗效。

SD大鼠下颌第一磨牙DLX5、RUNX2、OSX、DSP的表达分析

目的:观察远端缺失同源盒5(distal-less homeobox5,DLX5)、核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)在出生后SD大鼠下颌第一磨牙不同发育阶段的表达情况,探讨其在SD大鼠出生后下颌第一磨牙发育矿化的作用机制。方法:采用免疫组化法分析出生后1、7、14、28d SD大鼠下颌第一磨牙中DLX5、RUNX2、OSX、DSP的表达分布。结果:DLX5在出生后1、7、14d中均有表达,表达量呈现出上升趋势,但是在28d时不表达;RUNX2在出生后1、7、14、28d均表达,表达量在7d时呈现最低;OSX在出生后1、7、14、28d均有表达,表达量在14d时呈现最低;DSP在出生后1、7、14、28d均有表达,表达量呈上升趋势。结论:DLX5、RUNX2、OSX、DSP在大鼠出生后各阶段的表达量不同,具有时空特异性,表明DLX5、RUNX2、OSX、DSP可能对出生后SD大鼠下颌第一磨牙发育及矿化具有一定的调控作用。

健骨颗粒对去卵巢小鼠miR-141及成骨基因Dlx5/Msx2/Runx2的影响

目的:观察健骨颗粒对去卵巢小鼠骨组织中miR-141、Dlx5、Msx2、Runx2表达的影响,探讨健骨颗粒防治绝经后骨质疏松的作用机制。方法:30只C57小鼠按照随机数字表法分为假手术组、生理盐水组和健骨颗粒组,每组10只。假手术组只切除卵巢周围脂肪,不切除卵巢;生理盐水组和健骨颗粒组均手术切除双侧卵巢,并分别灌服生理盐水和健骨颗粒。干预8周后处死取材,采用micro CT观察胫骨形态并计量;realtime PCR检测骨组织miR-141、Dlx5、Msx2、Runx2等mRNA的表达;Western blot法检测骨组织Dlx5、Msx2、Runx2等蛋白含量。结果:与生理盐水组比较,健骨颗粒组骨小梁数量、宽度、长度、形态和分布部分恢复,密度和联结性有所增加,仍无法恢复到假手术组水平,但皮质骨面积增加,骨髓腔缩小,基本恢复到假手术组水平;骨矿物质含量(BMC)、骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨表面积和骨组织体积比值(BS/TV)、骨小梁数量(Tb.N)均明显升高;骨小梁分离度(Tb.Sp)、结构模型指数(SMI)指标均明显降低;小鼠骨组织miR-141、Msx2相对含量明显降低;骨组织Runx2、Dlx5相对含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:健骨颗粒可以有效降低miR-141的表达,并通过影响骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化BMP信号通路Dlx5/Msx2/Runx2信号轴来提高Dlx5、Runx2等成骨关键因子的表达,提高成骨能力,达到预防和治疗骨质疏松的目的。

骨形态发生蛋白-2碱性成纤维细胞生长因子及Cbfa1在强直性脊柱炎病理性成骨过程中的表达及意义

目的探讨骨形态发生蛋白2（BMP-2）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growthfactor，bFGF）和核心蛋广1结合W子（Cbfa1）在强直件脊柱炎（AS）病理性成骨过程中的表达及意义。方法通过原位杂交技术检测20例AS患者骶髂关节滑膜组织Lj20例股骨颈骨折髋关节置换患者（对照组）髋关节滑膜组织中BMP-2、bFGF和Cbfa1的表达情况，用图像分析系统统计阳性细胞与阴性细胞的灰度值。结果在AS患者骶髂关节滑膜组织中BMP-2、bFGF和Cbfal阳性表达，而对照组髋关节滑膜组织中BMP-2、bFGF和Cbfa1阴性表达，细胞的图像灰度值比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论BMP-2、bFGF和Cbfa1均为AS病理性成骨过程中重要的成骨因子，它们与AS骶髂关节成骨硬化过程密切相关。

淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化作用的实验研究

目的观察淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）骨向分化的作用特点。方法 （1）采用机械分离及全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,氨基安替吡啉测酚法检测不同浓度的淫羊藿苷在第3、6、9、12、15、18、21天对细胞上清液中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性的影响,采用茜素红染色法检测各浓度组BMSCs矿化情况,观察不同浓度的淫羊藿苷促BMSCs骨向分化的作用。（2）将BMSCs细胞分为空白对照组、成骨诱导组及淫羊藿苷组（0.5μg/m L）,在培养第7、14、21天检测各组细胞上清ALP活性,并于第14及21天分别检测各组细胞ALP阳性染色率与矿化结节数,同时采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测3个不同时间点各组细胞中核心结合蛋白因子（Runt-related transcripition factor-2,Runx2）及骨钙素（Osteocalcin）mRNA的表达水平。结果 （1）0.05~5.0μg/m L淫羊藿苷均可明显提高细胞上清液中ALP活性,其中0.2~2.0μg/m L浓度组细胞结节数亦明显增加（P〈0.01）。（2）淫羊藿苷促BMSCs骨向分化时,Runx2 mRNA表达水平及ALP活性均先升后降;Osteocalcin mRNA表达水平则持续上升（P〈0.01）;与成骨诱导组比较,作用14天后,淫羊藿苷组ALP活性及ALP阳性染色率均明显提高（P〈0.05,P〈0.01）。结论淫羊藿苷通过上调Runx2基因的表达,促使BMSCs向成骨细胞分化,并通过增加细胞ALP分泌及Osteocalcin基因的表达,促进细胞矿化的发生,从而促使新生成骨细胞的成熟。

Wnt信号通路对vaspin诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的研究Wnt/胞内β-连锁蛋白(β-catenin)信号通路对脂肪组织特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)介导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法体外培养4周龄雄性SD大鼠的BMSCs,分为4组:对照组,实验1、2、3组,分别加入成骨诱导液、含50 ng/ml、100 ng/ml vaspin的成骨诱导液及含100 ng/ml vaspin成骨诱导液+Dickkopf1(DKK1,Wnt/β-catenin信号通路特异性阻断剂),于成骨诱导第7天酶标仪检测碱性磷酸酶(ALP)活性,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨分化相关基因:ALP、核心蛋白结合因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)mRNA及β-catenin的表达水平。结果体外培养BMSCs,并加入不同浓度vaspin诱导后,实验1、2组ALP活性较对照组增加,并呈vaspin浓度依赖性(P均<0.05);成骨分化基因ALP、RUNX2、OSX mRNA表达水平增加,亦呈vaspin浓度依赖性(P均<0.05);β-catenin表达水平仅在加入100 ng/ml vaspin时升高(P<0.05);加入DKK1后(实验3组),ALP活性及成骨分化各基因表达水平较实验2组(100 ng/ml vaspin)显著下降(P均<0.05),β-catenin表达水平也显著下降(P<0.05)。结论 Vaspin可通过Wnt/β-catenin通路促进大鼠BMSCs成骨分化。