中国流行株HIV-1Gag蛋白在重组鸡痘病毒的表达及鉴定

目的 以鸡痘病毒为载体，表达ＨＩＶ－１ Ｇａｇ蛋白，进而研制ＡＩＤＳ疫苗。方法 以鸡痘病毒２８２Ｅ４株 非必需区ＴＫ基因为侧翼，插入ＶＶ突变型Ｐ７．５串联启动子和牛痘病毒Ａ包涵体晚期启动子与２０个串联的突变型 早期痘苗病毒Ｐ７．５启动子组成复合启动子及ＬａｃＺ报告基因构建重组表达质粒ｐＵＴＡＬ。在ＡＴ１－Ｐ７．５复合启动子 下游，插入编码中国流行株 ＨＩＶ－１ Ｇａｇ基因（Ｂ亚型），构建了重组表达质粒ｐＵＴＡＬ－Ｇａｇ。重组质粒Ｇａｇ与ＦＰＶ共 转染ＣＥＦ细胞，进行同源重组。通过ＢＵｄＲ加压筛选，Ｘ－ｇａｌ染色，获得重组鸡痘病毒ｖＵＴＡＬＧ，用于感染ＢＨＫ细胞 并免疫小鼠。结果 经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测，重组病毒表达了Ｇａｇ蛋白相对分子质量分别为５５０００、４８０００、２４０００和 １７０００，为Ｇａｇ蛋白的Ｐ５５、Ｐ４８、Ｐ２４和Ｐ１７蛋白。重组病毒免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。结论 所重组的病毒 成功地表达了目的蛋白并进行了正确加工。

中国流行株HIV-1B亚型Gag重组鸡痘病毒构建及其免疫原性

在以鸡痘病毒 ( FPV) 2 82 E4 株为基础构建的重组表达质粒 p UTAL的 ATI-P7.5复合启动子下游 ,插入编码中国流行株 HIV-1 B亚型核心蛋白 gag基因 ,构建了重组表达质粒 p UTALG。重组质粒与 FPV共转染 CEF细胞 ,进行了同源重组。通过 BUd R加压筛选 ,X-gal染色 ,获得重组鸡痘病毒 v UTALG。 Westernblot检测结果表明 ,重组病毒表达了 Gag蛋白 ,裂解后其相对分子质量分别为 5 5× 1 0 3 、4 8× 1 0 3 、2 4× 1 0 3 和1 7× 1 0 3 。以重组病毒 v UTALG免疫小鼠 ,与 FPV对照比较 ,小鼠脾 T淋巴细胞 CD4 + T细胞数和 CD4 + /CD8+值均有上升趋势 ,Con A、LPS诱导的脾细胞增殖能力增强 ,并能诱导 CTL和 HIV-1特异的血清抗体反应 。

表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因酵母工程菌的构建及表达条件的优化

目的 构建表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的酵母工程菌 ,并优化表达条件。方法 将gag gp12 0嵌合基因插入到酵母表达载体pHILS1中 ,构建了表达质粒pHILGP。线性化质粒电转化毕赤酵母菌GS115后进行整合 ,通过PCR及表达产物的SDS PAGE和ELISA等方法筛选阳性酵母工程菌 ,并优化表达条件。结果 成功构建表达融合蛋白的酵母工程菌 ,表达量为 13%左右。表达蛋白能与HIV 1阳性血清发生反应 ,但其相对分子质量 (Mr)比预计计算的值要小。最佳表达条件为 :BMMY培养基 ,85 %溶解氧 ,培养时间 3d ,1%甲醇诱导浓度。结论 表达的融合蛋白具有很好的抗原特异性 ,存在于上清中 ,这有利于目的蛋白的分离纯化。