EGFR核易位在肿瘤中的研究进展

0引言 EGFR在人类肿瘤发生和恶性转变中具有中枢性的作用[1],放疗等可以介导EGFR的内在化,核EGFR与细胞周期蛋白D1（cyclin D1）基因的表达启动子相互作用,激活cyclin D1基因的表达,这是核EGFR的里程碑式研究,由此将研究引向核EG-FR通路在激活靶基因表达中的作用。

α-突触核蛋白的核易位机制及其功能

α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)是一种脑内含量丰富的可溶性蛋白质,既能参与正常突触功能的维持和囊泡运输,又与多种神经退行性疾病有关,然而其确切的功能目前仍未完全清楚。已有研究表明,在生理条件下,α-突触核蛋白主要定位在细胞质中,少部分能定位在细胞核中,具有多种生物学功能。在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者大脑及氧化应激的细胞中,均发现α-突触核蛋白趋向于向细胞核中聚集。α-突触核蛋白核易位受到多种因素的精密调控,除自身氨基酸序列外,还受到其129位丝氨酸磷酸化(S129)水平、点突变(A53T,A30P,G51D)、细胞内Ca2+水平的影响,以及核输入蛋α(importin-α)、三结构域蛋白28(tripartite motif-containing protein 28,TRIM28)等多种蛋白质的精密调控,其异常的核易位则与细胞毒性相关。核易位的α-突触核蛋白能和组蛋白去乙酰化酶及组蛋白甲基化酶相互作用,从而改变组蛋白乙酰化和甲基化水平,最终影响染色质的稳定性。此外,α-突触核蛋白能与DNA相互作用,从而改变DNA构象、参与DNA损伤修复及基因表达调控。本文综述了α-突触核蛋白的结构特征,生理及病理条件下的细胞核内定位现象,详细的核易位机制及其在胞核中的功能研究进展,将有助于了解α-突触核蛋白生理功能及其在疾病发生发展中的作用。

实时定量检测NF-κB p65亚基核易位方法的建立

目的:建立可直观检测NF-κB p65亚基核易位的方法。方法:构建NF-κB p65的真核表达重组质粒p EGFP-p65,转染He La细胞,加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)后采用活细胞成像技术观察绿色荧光蛋白在He La细胞内的变化。结果:TNF-α处理后0~2 h,EGFP-p65融合蛋白主要聚集在胞浆处;TNF-α处理后4~12 h,随处理时间的延长,细胞核处的绿色荧光蛋白逐渐增强,但细胞内总荧光值基本保持稳定。结论:TNF-α可以促进EGFP-p65入核。活细胞成像技术具有操作简单、实时动态、直观、定量等优点,可用于探讨人类免疫缺陷病毒(HIV)潜伏感染再激活剂的作用机制。

PRRSV体外感染Marc-145细胞对NF-κB p65/p50转录时相及核易位的影响

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染对细胞核转录因子-κB(NF-κB,p65/p50)mRNA转录时相及核易位的影响,探讨PRRSV感染导致的免疫抑制与NF-κB的活化异常是否有一定的相关性,运用实时荧光定量PCR技术对PRRSV感染Marc-145细胞不同时期NF-κB p50、p65mRNA的转录水平变化进行定量分析,并提取不同感染时期Marc-145细胞核蛋白,利用免疫印迹法检测细胞核内具有活性的p50、p65水平变化。荧光定量结果表明,Marc-145细胞感染PRRSV后第8～12小时,p50、p65转录水平急剧下调,第12～120小时p50、p65mRNA含量一直维持在较低水平,与接毒前及对照组同时期的转录水平相比,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)。免疫印迹结果表明,Marc-145细胞感染PRRSV后第12～96小时,细胞核内均未检测到p50的表达;感染后第12小时,细胞核内p65表达下调,第48～96小时未检测到p65的表达。可见,PRRSV体外感染Marc-145细胞能够抑制NF-κB p65/p50mRNA的转录及核易位。以上结果支持PRRSV感染早期无力的先天性免疫应答可能与NF-κB活化水平的低下有关的观点,为进一步研究PRRS的感染机制及NF-κB的功能提供新的思路和依据。

右美托咪定抑制NF-κB核易位减轻大鼠创伤性脑损伤神经炎症

目的探究右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)调节创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后小胶质细胞(microglial,MG)极化及神经炎症的机制。方法42只成年雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(sham组)、TBI组、TBI+DEX组(又分为治疗1 d、3 d和7 d组)、TBI+NF-κB抑制剂(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)组和TBI+DEX+PDTC组,每组6只。采用改良Feeney自由落体法制备大鼠TBI模型,造模后1 h腹腔注射PDTC 100 mg/kg、2 h腹腔注射DEX 100μg/kg,直至取材。于取材前采用改良的神经功能缺损评分法(modified neurological severity score,mNSS)评价大鼠神经功能,ELISA检测血清炎症因子,取大鼠损伤皮质通过Western Blot检测MG M1和M2表型标记物及MyD88、NF-κB p65蛋白表达,免疫荧光染色观察损伤皮质处NF-κB p65在MG中的表达及入核情况。计量资料多组间比较采用单因素及双因素方差分析。结果与Sham组相比,TBI组mNSS评分显著升高,DEX组mNSS评分明显低于TBI组,差异有统计学意义(P<0.05);ELISA和Western Blot检测TBI组血清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素(interleukin,IL)-1β水平及MG M1表型标记物(IL-1β和TNF-α)升高,抗炎因子IL-10和M2型标记物(精氨酸酶-1和IL-10)表达下降(P<0.05);DEX降低血清TNF-α及IL-1β的水平,提高IL-10水平,并促进MG M2表型极化(P<0.05)。此外,DEX组MyD88表达下调,NF-κB p65核易位被抑制,该效应可被PDTC增强。结论DEX可通过抑制NF-κB核易位调节TBI大鼠MG活化,减轻神经炎症。

芳香烃受体核易位蛋白高表达对人肝癌细胞SMMC7721增殖、凋亡和侵袭能力的影响

目的 检测芳香烃受体核易位蛋白（ARNT）高表达对肝癌细胞SMMC7721增殖、凋亡以及侵袭能力的影响。方法 构建ARNT基因稳定转染的肝癌细胞SMMC7721,细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测细胞24、48、72 h的增殖,膜联蛋白V（Annexin V）/碘化丙锭（PI）法检测细胞凋亡,TransweH实验检测细胞的侵袭能力。结果 筛选获得稳定高表达ARNT的克隆细胞,Western blot显示稳定转染ARNT的SMMC7721可明显上调ARNT蛋白的表达水平,上调倍数达2.65倍,ARNT高表达后细胞生长速度较对照组细胞明显减慢。24、48、72 h的细胞增殖抑制率分别为（18.70±4.25）%、（26.45±3.92）%、（35.14±3.64）%,ARNT高表达后细胞凋亡明显增加,细胞总凋亡比例为（9.43±1.09）%,而对照组细胞的总凋亡比例为（4.40±0.61）%,两者差异有统计学意义（P〈0.01）,Trarswell实验显示表达ARNT的肝癌细胞穿膜细胞数为（29.5±6.7）个,而对照组的穿膜细胞数为（58.3±14.8）个,差异有统计学意义（t=6.873,P〈0.01）。结论 ARNT能明显抑制肝癌细胞的生长、促进其凋亡,同时抑制肿瘤细胞的侵袭能力。

芳香烃受体核易位蛋白2基因表达对HCCLM6细胞侵袭和迁移的影响

目的探讨短发夹（sh）RNA芳香烃受体核易位蛋白（ARNT）2i慢病毒表达载体对高转移肝癌细胞HCCLM6侵袭和迁移的影响。方法以ARNT2为目的基因，化学合成4条干扰RNA，与经MluⅠ和ClaⅠ酶切后的pLVTHM载体连接过夜，筛选并鉴定阳性克隆。利用脂质体2000将ShRNA—ARNT2i，pCMV—dR8．74，pMD2G共转染293T细胞，获得shRNA—ARNT2i慢病毒颗粒，进一步感染HCCLM6靶细胞，并分为转染shRNAARNT2i组、未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组。用荧光实时定量PCR和Westernblot检测ARNT2基因的干扰效率。应用划痕和Boyden小室法观察ARNT2表达下调对HCCLM6侵袭和迁移能力的影响。用SPSS16．0统计软件对数据进行独立样本t检验和方差分析，其中多组资料两两比较采用LSD法。结果荧光实时定量PCR检测转染shRNAARNT2i组，未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组3组ARNT2mRNA相对表达值分别为0．154±0．024、0．860±0．145、1．004±0．009，F=113．14，P〈0．01，差异有统计学意义；Westernblot显示转染stLRNA—ARNT2i组ARNT2蛋白的表达量为16．45±1．6，转染阴性对照序列组ARNT2蛋白的表达量为44．56±2．07，两组比较，t=18．58，P〈0．01，差异有统计学意义；转染shRNA—ARNT2i组细胞在划痕48h后基本愈合，而转染阴性对照序列组和未转染的空白对照组划痕依然可见；转染shRNAARNT2i组穿膜细胞数为（13．25±1．04）个，而未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组的穿膜细胞数分别为（6．50±2．56）个、（6．75±2．05）个，F=29．645，P〈0．01，差异有统计学意义。结论shRNA—ARNT2i载体能显著下调HCCLM6细胞ARNT2基因和蛋白的表达，促进HCCLM6细胞的运动和侵袭。

百草枯引起神经元α-突触核蛋白寡聚化并向细胞核易位的时间依赖性研究

[背景]百草枯(PQ)作为散发性帕金森病(PD)的环境毒物之一可引起α-突触核蛋白(α-syn)异常聚集,但在其构象变化及亚细胞定位的研究有限。[目的]探讨PQ对多巴胺能神经元中α-syn构象以及亚细胞定位的影响。[方法]选取48只SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组和模型组,模型组腹腔注射PQ(15 mg·kg^(-1)),对照组腹腔注射等容量0.9%生理盐水,每周注射2次,连续8周以构建类PD样小鼠模型。观察各组小鼠神经行为学(旷场实验、爬杆实验)的变化,来评估小鼠运动能力的改变。染毒结束后取小鼠脑组织进行免疫组织化学染色(IHC),检测中脑多巴胺(DA)能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)以及α-syn的表达量;同时采用蛋白质印迹法(WB)检测小鼠中脑TH、α-syn的蛋白表达量。以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞作为多巴胺能神经元的体外模型,使用固定浓度PQ(100μmol·L^(-1))处理细胞不同时间(0、12、24、36、48 h)后,采用WB法分别检测全细胞、细胞质、细胞核α-syn的表达情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞外α-syn的表达水平;免疫荧光法(IFA)观察α-syn的位置变化。[结果]神经行为学结果显示,与对照组比较,随染毒时间的增加PQ模型组小鼠旷场周边区域停留时间增加(P<0.05),中央区域停留时间和移动距离减少(P<0.05),爬杆时间增加(P<0.05);动物实验IHC结果显示,6周、8周模型组与对照组比较,中脑TH阳性细胞数减少(P<0.05),而α-syn阳性表达量在4、6和8周增多(P<0.05);WB结果同样显示TH相对表达量在PQ染毒6、8周明显减少(P<0.05),寡聚体α-syn相对表达量在4、6和8周增多(P<0.05)。细胞实验WB结果显示,细胞全蛋白寡聚体α-syn相对表达量随时间依赖性增多(R^(2)=0.7440,P<0.05);细胞质寡聚体α-syn相对表达量随时间增加先增加后减少(P<0.05);细胞核寡聚体α-syn相对表达量随时间依赖性增加(R^(2)=0.7913,P<0.05);IFA结果显示,寡聚化的α-syn表达增加并向细胞核易位(P<0.05);ELISA结果表明,细胞所释放的α-syn随PQ染毒时间增加呈现上升的趋势(P<0.05)。[结论]PQ引起多巴胺能神经元内α-syn表达增加,结构发生寡聚化且向细胞核易位。

p62蛋白在食管鳞癌细胞中核浆易位的机制研究

目的:探讨p62蛋白在食管鳞癌细胞中核浆易位的影响因素及其可能机制。方法:采用核输出抑制剂KPT330处理食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE150和KYSE510后,利用免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜分别观察抑制剂处理前后食管鳞癌细胞中p62蛋白的定位情况。利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)磷酸化蛋白质组技术鉴定食管鳞癌细胞中p62蛋白的磷酸化位点。定点突变技术用于构建p62不同磷酸化状态的突变体。通过免疫共沉淀实验(Co-IP)、邻位连接实验(PLA)分析p62与GSK-3β的相互作用情况。结果:使用核输出抑制处理后,免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察发现,p62积聚在细胞核中。质谱鉴定结果显示,食管鳞癌细胞中p62蛋白存在T269/S272/S328/S332这4个位点的磷酸化,进一步发现T269/S272位点磷酸化、且同时S328/S332去磷酸化可使胞浆中的p62转移至细胞核中。Co-IP和PLA实验结果显示,p62与GSK-3β存在直接的相互作用。结论:食管鳞癌细胞中p62的核浆易位与其S328/S332磷酸化状态相关,且可能受GSK-3β激酶调控。

论296例自然流产夫妇染色体核型分析

目的探讨和分析自然流产和染色体核型异常之间的相互关系。方法随机选取本院自然流产夫妇共296例,对于检查出的染色体核型异常患者和自然流产次数进行统计,并分析二者的相关关系。结果全部流产患者中,经检查属于染色体核型异常患者夫妇共16例（5.41%）,属于臂间倒位患者共5例（1.69%）,全部受检者中属于互相易位为7例（2.36%）,属于罗伯逊易位患者共4例（1.35%）;全部受检者中,染色体易位共11例患者,占到核型异常类型的68.75%,患者自然流产1~6次的染色体核型异常检出率分别为2.63%、3.57%、7.35%、11.11%、10%、12.5%,在患者自然流产3次以上时,其染色体核型异常的检出率存在明显增加（χ2=18.035,P〈0.005）,显示存在着非常显著差异,具有统计学意义,并且在染色体核型中,通过相关分析和线性回归分析显示核型的异常检出率与自然流产的次数之间呈现正相关的关系（r=0.883）。结论染色体易位属于自然流产患者的核型异常的主要的类型。并且染色体异常检出率会伴随着患者自然流产次数的增多而出现明显的升高,二者存在明显的正相关关系。

EGFR及其下游通路在胶质瘤治疗中的研究进展

引言神经胶质瘤约占颅内原发恶性肿瘤的40%,多形性胶质母细胞瘤（GBM）是神经胶质瘤中最常见、恶性程度最高的一种类型,预后极差,超过90%的GBM是原发性GBM,绝大部分患者在确诊后的生存期只有一年,两年生存期的患者小于10%[1]。

白藜芦醇对帕金森病小鼠行为表现及对多巴胺能神经元NF-κB蛋白表达的影响

目的探讨白藜芦醇对帕金森病(PD)小鼠行为表现及对多巴胺(DA)能神经元核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达的影响。方法 1体内实验:50只雌性褐鼠随机均分为五组,1组模仿卵巢切除术行假手术;2组行双侧卵巢切除术;3组手术同2组,术后1周腹腔注射生理盐水连续4 d,腹腔注射MPTP连续7 d;4组手术同2组,术后1周腹腔注射白藜芦醇连续4 d,腹腔注射MPTP连续7 d;5组手术同2组,术后1周腹腔注射雌激素连续4 d,腹腔注射MPTP连续7 d;比较各组爬杆实验得分。2体外实验:当体外培养的MES23.5 DA能细胞密度达到60%时,A组换用无血清培养基;B组换用加有MPP+的无血清培养基;C组较前两组提前30 min换用加有白藜芦醇的无血清培养基进行预处理,30 min后换用同时含有白藜芦醇和MPP+的无血清培养基。培养24 h后,采用Western blotting法检测三组细胞中NF-κB蛋白。结果 1、2、3、4、5组爬杆实验得分分别为(8.39±1.21)、(5.62±0.90)、(3.79±1.17)、(8.01±1.03)、(8.27±1.39)分;2、3组得分低于其他三组,P均<0.05。B组细胞质NF-κB蛋白表达量较A组减少约57%(P<0.05),C组细胞质NF-κB蛋白表达量较B组增加约54%(P<0.05)。B组细胞核NF-κB蛋白表达量较A组增加约76%(P<0.05),C组细胞核NF-κB蛋白表达量较B组减少62%(P<0.05)。结论白藜芦醇可减轻MPTP致PD小鼠行为学表现,机制可能与其抑制DA能神经元内NF-κB核易位有关。

GAPDH与神经变性疾病

GAPDH又名甘油醛-3-磷酸脱氢酶,是糖酵解途径中的一种关键酶,能够催化甘油醛-3-磷酸转化为1,3-二磷酸甘油酸。但GAPDH除了糖酵解功能外,作为一种多功能酶,还具有独特的非糖酵解功能,例如基因表达调控,DNA修复和复制,神经变性,致病机制,细菌毒力,蛋白质-蛋白质相互作用,RNA输出,以及调控凋亡和自噬⑴。

巨颌症患者SH3BP2基因突变对NFATc1和SH3BP2蛋白表达的影响

目的分析SH3BP2基因点突变后,与其相关的信号转导通路发生的变化,探讨巨颌症发病的分子机制。方法采用免疫荧光技术检测巨颌症患者的活化T细胞核因子(nuclear factor of activated Tcells,NFAT)家族中的NFATc1及SH3BP2蛋白在细胞内的定位及表达含量的变化。结果巨颌症标本中NFATc1总体表达含量变化不明显,但发生了核内转位;SH3BP2在巨颌症组织中表达量增高。结论巨颌症致病基因SH3BP2发生点突变后,SH3BP2蛋白表达量可增多,并可导致NFATc1发生核内转位,这可能是导致巨颌症病变中破骨细胞被激活,形成骨吸收的重要机制。

注意新型非甾体抗雄激素药物阿帕他胺引起的皮肤不良事件

阿帕他胺(apalutamide)是一种新型口服非甾体抗雄激素药物,可直接与雄激素受体(androgen receptor,AR)的配体结合域结合抑制雄激素与AR的结合、AR核易位和AR介导的转录,进而诱导肿瘤细胞死亡[1]。

原花青素通过转录因子EB诱导的自噬-溶酶体途径促进人牙周膜干细胞成骨分化的研究

目的研究原花青素(PA)调节人牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的具体机制,探讨PA对转录因子EB(TFEB)的表达和自噬-溶酶体途径的影响。方法将PDLSCs分为对照组和PA组,通过转录组测序(RNA Seq)分析差异表达基因,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、碱性磷酸酶(ALP)染色和透射电子显微镜(TEM)观察细胞成骨能力和自噬水平。通过划痕实验和Trasnwell实验检测PDLSCs的迁移能力,溶酶体荧光探针(Lysotracker)染色和免疫荧光染色检测溶酶体的生物发生,蛋白质印迹法检测TFEB总蛋白及其在细胞质和细胞核中的表达,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察TFEB的核易位。使用小干扰RNA(siRNA)技术敲低TFEB基因,进行PA处理或无处理。蛋白质印迹法检测细胞中自噬标志物苄氯素1(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)和成骨标志物Runt相关转录因子2(RUNX2)、ALP和骨钙素的表达。结果与对照组相比,PA组中PDLSCs的成骨和自噬相关基因出现差异性表达(P<0.05)。PA组中成骨相关基因RUNX2(2.32±0.15)、Ⅰ型胶原蛋白ɑ1链(CoL1α1)(1.80±0.18)和自噬相关基因LC3B(1.87±0.08)、Beclin1(1.63±0.08)的mRNA表达水平均显著高于对照组(分别为1.01±0.16、1.00±0.10、1.00±0.07、1.00±0.06)(均P<0.001)。与对照组相比,PA组的ALP活性更高,TEM镜下自噬体和自噬溶酶体数目更多。PA显著促进了PDLSCs的迁移(P<0.05),并增加了溶酶体的数量和溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)的表达。PA组中TFEB总蛋白的相对表达水平(1.49±0.07)和TFEB在细胞核/细胞质中的相对表达水平(1.52±0.12)均显著高于对照组(分别为1.00±0.11、1.00±0.13)(均P<0.01)。PA组TFEB的细胞核/细胞质相对荧光强度(0.79±0.90)也显著高于对照组(0.11±0.08)(t=3.49,P<0.01)。敲低TFEB后,PDLSCs中TFEB(0.64±0.04)、LAMP1(0.69±0.09)、Beclin1(0.60±0.05)和LC3BⅡ/Ⅰ(0.73±0.07)蛋白的表达均显著低于阴性对照组(分别为1.00±0.15、1.00±0.10、1.00±0.05、1.00±0.06)(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。敲低TFEB后PA组中Beclin1(1.05±0.11)、LC3BⅡ/Ⅰ(1.02±0.09)、RUNX2(1.04±0.10)、ALP(1.04±0.16)和骨钙素(1.03±0.15)的表达均显著低于敲低前(分别为1.28±0.03、1.44±0.11、1.38±0.11、1.62±0.11、1.65±0.17)(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。结论PA通过促进PDLSCs中TFEB的表达和核易位,激活自噬-溶酶体途径,促进PDLSCs的成骨分化。

ARNT2在胃癌中的表达及临床意义

目的探讨人胃癌中芳香烃受体核易位蛋白2(ARNT2)的表达及临床意义。方法运用qRT-PCR和Western blotting检测ARNT2在正常胃细胞株及多种胃癌细胞株中的表达。通过免疫组织化学检测61例胃癌组织及相应癌旁胃黏膜组织中ARNT2的表达。结果 ARNT2 mRNA和蛋白在胃癌细胞株中的表达水平显著低于正常胃细胞株。胃癌组织中ARNT2的阳性表达率显著低于癌旁胃黏膜组织(32.79%vs 80.33%,P<0.05),与细胞株的检测结果一致。并且,胃癌中ARNT2的表达水平与肿瘤的分化程度显著相关(P<0.05)。结论 ARNT2在胃癌细胞及组织中低表达,并且其表达水平与胃癌的分化程度相关,提示其可能参与胃癌的发生与发展。