应用TaqMan MGB探针检测美澳型核果褐腐病菌

以美澳型核果褐腐病菌的6个菌株以及核果褐腐病菌一个和欧洲种仁果褐腐病菌这两种近似种为研究对象,通过对ITS区序列的比对分析,设计了美澳型核果褐腐病菌的TaqMan MGB实时荧光PCR引物和探针,建立了美澳型核果褐腐病菌的TaqMan MGB实时荧光PCR检测方法。设计了这3种近似种的通用引物和探针,用于检测过程中进行质量控制。

进口智利李子上核果褐腐病菌鉴定

从进口智利李子上分离到一种引起李子果实腐烂的病原真菌，接种李子能引起果实变褐和腐烂。该真菌菌丝在PDA培养基上的生长最适温度为25℃，产孢少，菌落初始为浅灰色，边缘浅裂状，多次传代后逐渐变为浅白色，边缘整齐。分生孢子无色，单孢，柠檬形或卵圆形，大小11．5（9．5～14．7）μm×7．4（5．3～9．2）μm。ITS序列分析结果表明该分离物ITS区序列与GenBank中登录的16株舱laxa序列相似性分别为99．8％～100％，碱基的差异为0～1bp；与21株旭frueticola序列相似性为99．0％～99．2％，碱基的差异为4～5bp；与10株M.fructigena的序列相似性为97．5％～97．7％，碱基的差异为13～14bp。基于ITS序列的系统发育关系分析表明分离物sh675和GenBank中登录的16个M.laxa菌株属于同一个聚类群，相关的Mfructieola和M.fructigena属于另一个聚类群。M.laxa特异性引物ITS1Mix／ITS4Mlx能扩增分离物sh675的菌丝DNA，得到预期的356bp扩增产物。根据该真菌的菌落形态特征、分生孢子形态特征、ITS序列和PCR检测结果，将其鉴定为核果褐腐病菌（Monilinia laxa）。

美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)对嘧菌酯的敏感性

采用孢子萌发法和菌丝生长速率法测定了我国北方地区美澳型核果褐腐菌对嘧菌酯和水杨肟酸（SHAM）的敏感性,从而为测定室内美澳型核果褐腐菌对嘧菌酯的敏感性提供适合的SHAM浓度,并且为监测田间抗药性的发生提供依据。结果表明,当质量浓度为60mg·L-1时,SHAM对43株美澳型核果褐腐菌菌丝的抑制率在-3.09%~52.93%,但同样浓度下,SHAM对32株褐腐菌孢子萌发的抑制率在-0.73%～9.58%,方差分析的结果表明,浓度为60mg·L-1的SHAM对褐腐菌的孢子萌发率无明显抑制作用。嘧菌酯对55株美澳型核果褐腐菌的EC50分布频率呈单峰曲线,EC50值在0.075～0.390mg·L-1,平均值为（0.210±0.072mg·L-1）,可以作为敏感基线。

进境旅客携带的澳大利亚苹果中美澳型核果褐腐病菌的检测与鉴定

南京禄口国际机场口岸从进境旅客携带的澳大利亚苹果中截获疑似褐腐病果。病果表面靠近果肩处有水渍状褐色病斑,经保湿培养后褐色病斑迅速扩展至全果,果实表面出现灰褐色绒状霉层,果实腐烂。对病果进行分离培养、形态学观察、PCR检测及ITS序列分析和致病性测定后,将病菌鉴定为美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)。这是江苏省首次从旅客携带的澳大利亚苹果中截获该检疫性有害生物。

美澳型核果褐腐病菌的检疫鉴定方法

本文根据美澳型核果褐腐病菌的形态学、生物学培养性状和分子生物学等方面的特征,确立了检疫鉴定美澳型核果褐腐病菌的各项技术要求。

美澳型核果褐腐病菌对甲基硫菌灵和啶酰菌胺的敏感性

采用传统检测方法测定了我国北方地区美澳型核果褐腐病菌对常用杀菌剂甲基硫菌灵和新药剂啶酰菌胺的敏感性,并采用12条ISSR引物对不同抗性水平的菌株进行了分析。结果显示:74株菌株中检测出5株对甲基硫菌灵表现高抗、2株表现低抗的菌株;我国抗性菌株的突变位点与美国加州抗性菌株的突变位点相同;啶酰菌胺对来自我国和美国、新西兰、法国的45株美澳型核果褐腐病菌的EC50分布频率呈单峰曲线,EC50在0.059～0.320μg/mL之间,平均值为0.174±0.064μg/mL;基于ISSR分析得到的UPGMA聚类组与菌株的来源地及对甲基硫菌灵的抗性无相关性。

从进境美国樱桃中首次截获美澳型核果褐腐病菌

Monilinia fructicola是我国禁止进境的检疫性真菌有害生物。广州白云机场口岸从美国输华樱桃中截获可疑病果,病果表面有微小的圆形褐色病斑。保湿培养4d后,病斑迅速扩展至全果,并簇生绒状灰白至灰黄色菌落,导致果实腐烂。经对分离物进行形态学观察和ITS序列分析,将病菌鉴定为美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola(Winter)Honey),从进境美国樱桃大宗货物中截获该病菌在我国尚属首次。

基于环介导等温扩增技术快速检测美澳型核果褐腐病菌

本文建立了美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)环介导等温扩增技术,并利用此技术开展了M.fructicola的检测和鉴定。采用M.fructicola SCAR分子标记的MO368特异片段为靶标序列,设计并筛选出M.fructicola的特异性LAMP引物,建立了该病菌快速诊断方法。试验结果表明,仅M.fructicola的菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。检测灵敏度可达到100 pg/μL。利用该方法对无锡机场截获的7份疑似李子褐腐病样本进行检测,结果有3份样品呈LAMP阳性反应。本文建立的M.fructicola LAMP检测方法具有灵敏度高、特异性好,简便易行等优点,为美澳型核果褐腐病菌的快速检测提供了一种新技术。

樱桃褐腐病菌鉴定及生物学特性研究

以贵州樱桃褐腐病果实为试材,根据柯赫氏法则验证所分离病原菌的致病性,结合形态学及分子生物学鉴定病原菌种类并探究其生物学特性,旨在为樱桃褐腐病的科学精准防控提供参考依据。结果表明:分离得到病原菌菌株YTBH10,菌落为灰褐色或灰白色,产生大量灰褐色孢子,呈同心轮状,分生孢子呈链状排列;ITS序列构建系统发育树分析显示该菌株属于链核盘菌属;病原菌回接试验证明其致病性。引起贵州樱桃褐腐病的病原菌是美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola),该病原菌在pH313范围内均能生长,适合中性偏酸性环境,菌丝生长最适温度为25℃。

进境澳大利亚原木夹带物中美澳型核果褐腐病菌的检疫鉴定

从进境澳大利亚原木中发现夹带的桃核上有灰黄色霉层,采用常规PDA平板分离法获得1株菌株TH-1,其后进行生物学性状研究、PCR扩增、序列比对分析及致病性测定。分离菌株在PDA培养基上产孢丰富,呈同心轮纹状,榛子色到灰黄色。分生孢子芽生,链状排列,椭圆形或卵圆形,大小为9.7~15.1μm×6.0~9.0μm。特异性引物产生阳性扩增。经r DNA基因间隔序列(ITS)比对分析,该菌株与GenBank中多个美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)菌株的ITS基因序列同源性达100%。根据ITS序列构建的系统进化树表明,该菌株与其他多株美澳型核果褐腐病菌分离物聚在同一个分支上。致病性测定结果表明菌株TH-1可侵染水蜜桃果实。以上研究结果表明菌株TH-1为美澳型核果褐腐病菌。这是我国口岸首次从进境澳大利亚原木夹带物上截获美澳型核果褐腐病菌。

从进境桃中分离美澳型核果褐腐病菌的检疫鉴定

美澳型核果褐腐病菌寄主广、危害严重,被欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)列入检疫性有害生物名单,并被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。本文通过对截获样品进行形态学与分子生物学方面的深入研究,发现病原分离物可再次侵染桃,并表现出与截获样品相同症状。通过病原形态学观察发现,美澳型核果褐腐病菌在PDA培养基上,菌落呈榛子色,边缘开裂,其上由浓密孢子堆积成同心环状。形态学特征表现为美澳型核果褐腐病菌特征,利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增菌株DNA,在550 bp左右出现特异性条带。实验证明该病原菌即为美澳型核果褐腐病菌。

李褐腐病病原菌的分离和鉴定

从入境李果实(Prunus domestica)上分离到一株丛梗孢属(Monilinia sp.)真菌。综合致病性测定、形态特征和分子生物学鉴定结果,确定引起李褐腐病的病原菌是美澳型核果褐腐病菌[Monilinia fructicola(Winter)Honey]。

“美早”甜樱桃褐腐病病原菌的分离及内生拮抗细菌的筛选鉴定

为明确山东泰安地区"美早"甜樱桃褐腐病的主要病原菌,并进行内生拮抗细菌的筛选鉴定,采集当地具有褐腐病特征的"美早"甜樱桃进行病原菌分离,利用形态学和分子生物学技术鉴定,并将分离的病原菌菌株回接甜樱桃进行致病性验证;针对褐腐病原菌,从健康甜樱桃本身筛选优质拮抗菌株,开展生防研究。结果显示,导致"美早"甜樱桃褐腐病的病原菌为美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola),回接试验表明,与腐败"美早"甜樱桃自然发病特征一致;从健康甜樱桃本身筛选获得内生拮抗细菌X-16,经形态学、生理生化特征以及16S r DNA序列鉴定为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis),抑制率达到(72.27±0.55)%,对拮抗菌X-16的菌悬液、发酵液和发酵上清液进行拮抗效果验证,发酵液和发酵上清液对褐腐病菌具有较好抑制效果,抑制率分别为(71.93±0.18)%和(67.14±0.43)%。结果表明,美澳型核果褐腐病菌为山东泰安地区"美早"甜樱桃褐腐病主要病原菌;该研究筛选出的内生拮抗细菌X-16抑菌效果显著,具有优质生防菌株的潜力。

织金县玛瑙红樱桃褐腐病病原菌的鉴定

近年来,随着农业产业结构调整,织金县依托当地适宜的生态环境,将“玛瑙红”樱桃作为重点发展的特色产业,种植面积不断扩大,为打赢脱贫攻坚注入了强大的动力,然而在快速带动当地经济增长的同时,各种病害的爆发也逐渐阻碍了当地樱桃产业的进一步发展,因而,对织金县樱桃病害的防控需求也显得日益紧迫。褐腐病是引起樱桃果实腐烂的重要病害,为明确织金县“玛瑙红”樱桃褐腐病的主要病原菌,从当地采集具有褐腐病典型特征的叶片样品,在室内进行病原分离,采用形态学观察与分子生物学技术相结合的手段进行鉴定。结果显示,美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)是引发织金县“玛瑙红”樱桃褐腐病的主要病原菌。

进境苹果中3种检疫性真菌三重PCR同步检测方法的建立

苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii)、美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)和丁香疫霉病菌(Phytophthora syringae)是为害多种水果和其他植物的重要检疫性真菌,均能侵染苹果果实导致烂果,并造成严重的经济损失。本研究设计和筛选了3对特异性引物,建立了同步检测3种检疫性真菌的普通PCR和三重PCR方法。设计的引物Bs-368 F/R、M.cola 986F/R和Psy1/Psy2能分别特异性地扩增出B.stevensii、M.fructicola和P.syringae所有供试菌株的DNA,而对相应多个近似种的DNA则无扩增。灵敏度试验结果表明,上述3对引物分别检测B.stevensii、M.fructicola和P.syringae DNA的灵敏度是41.7 pg、47.4 pg和0.375 pg,三重PCR同时检测到3种病菌DNA的灵敏度是4.44 ng。该方法可以满足对进境苹果果实携带的苹果壳色单隔孢溃疡病菌、美澳型核果褐腐病菌和丁香疫霉病菌的快速初筛,加速进境新鲜水果的快检快放。