核桃谷蛋白多肽及其肽锌螯合物的分离纯化、鉴定与结合位点分析

为提高核桃的附加值,以核桃粕为原料,将核桃谷蛋白多肽与锌进行螯合,利用扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱、X射线衍射光谱等分析手段表征多肽与锌离子的螯合特征,并通过超滤、凝胶柱层析、液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术筛选出与锌结合能力较高的肽段,结合分子对接技术探究二者的具体结合位点和结合能力。结果表明,核桃谷蛋白多肽与锌离子发生了螯合反应,螯合前后多肽的表面微观结构和结晶程度均有显著差异;经超滤、凝胶柱层析分离后,F41组分螯合能力最强,为(117.43±1.99)mg/g;LC-MS/MS结合虚拟筛选得到5条无毒无潜在致敏性且具有潜在生物活性的肽段;利用分子对接技术模拟分析肽锌螯合物的结合过程,发现五肽Phe-Asp-Ala-Asp-Phe(FDADF)可与锌离子形成结构稳定的复合物,通过配位键、氢键和疏水相互作用结合,结合能最低,为-7.27 kcal/mol,结合位点主要为天冬氨酸侧链的羧基氧原子(Asp4:O-Zn)。本研究可为肽锌螯合物的开发应用提供理论依据。

菌酶协同固态发酵核桃谷蛋白制备抑菌肽

核桃粕作为榨油副产物常被用作饲料或丢弃,造成大量优质蛋白资源的浪费。本文为高值化利用核桃粕资源,以其中含量最高的谷蛋白为原料,采用枯草芽孢杆菌和碱性蛋白酶协同固态发酵法制备核桃谷蛋白抑菌肽。以多肽含量和抑菌圈直径作为评价指标,进行单因素实验和响应面试验优化最佳菌酶协同固态发酵工艺参数。对制备的谷蛋白抑菌肽热稳定性进行探究。结果显示,单因素实验表明谷蛋白抑菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用。响应面试验下最佳发酵工艺参数为:接种量5%,料液比1:1.5,发酵温度43℃,发酵时间3 d,加酶量400 U/g。最佳工艺条件下多肽含量达到26.35±1.29 mg/g,对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为15.50±1.53 mm。通过差示扫描量热仪(Differential Scanning Calorimeter,DSC)分析可得,谷蛋白抑菌肽比谷蛋白具有更高的热稳定性。研究表明通过菌酶协同固态发酵核桃谷蛋白制备的抑菌肽具有良好的抑菌效果且结构相对稳定。

酶解法制备核桃谷蛋白-1 ACE抑制肽的工艺优化

为获得优质的核桃蛋白血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备原料及优化其制备工艺,采用连续提取法从脱脂核桃粕中依次分离出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-25种组分蛋白,测定5种组分蛋白的占比及ACE抑制率,以ACE抑制率最大的组分蛋白作为原料采用酶解法制备ACE抑制肽,在筛选出最适酶解用酶基础上,采用单因素试验与响应面试验优化酶解制备核桃蛋白ACE抑制肽的工艺。结果表明:5种组分蛋白中谷蛋白-1占比仅次于谷蛋白-2,且其ACE抑制率最高,以核桃谷蛋白-1为原料,在筛选出胃蛋白酶作为酶解用酶基础上,经工艺优化得到最优的酶解法制备核桃谷蛋白-1 ACE抑制肽的工艺条件为酶解温度46℃、酶解时间6 h、酶用量4.2%(以底物质量计)、酶解pH 1.6,在该条件下所得核桃谷蛋白-1酶解液的ACE抑制率为(50.08±2.34)%。因此,核桃谷蛋白-1经胃蛋白酶酶解可生产ACE抑制活性较高的核桃多肽。

谷氨酰胺转氨酶改性核桃谷蛋白的结构表征分析

核桃榨油后会产生大量的核桃饼粕副产物,而副产物中含有人体所需的优质性蛋白常被充当饲料或直接填埋处理,对于环境的污染较为严重。采用谷氨酰胺转氨酶对核桃饼粕中的谷蛋白进行改性处理,通过改变谷蛋白的分子构象,使核桃蛋白的功能特性得以改变。经过改性处理,得到改性后的核桃谷蛋白溶解性提升了0.97倍;由光谱学测定分析得知,经谷氨酰胺转氨酶改性后蛋白的微观性结构发生变化,为核桃蛋白功能性产品的开发以及在食药中的应用提供相应的分析依据。

糖基化修饰对核桃谷蛋白结构和功能特性的影响

核桃经制油后会残留大量核桃饼粕,而饼粕中含有的大量优质性蛋白因蛋白功能性较差常被当作饲料或废弃物。鉴于核桃蛋白本身所具有的功能特性,采用糖基化方法对核桃饼粕蛋白中占比70%左右的谷蛋白进行改性处理,以此改变核桃蛋白的二、三级结构,从而改善核桃饼粕蛋白的功能特性。通过糖基化处理,得到改性后核桃谷蛋白的溶解性分别提升了4.38、2.40和4.58倍,持水性分别提升了0.18、0.95和1.13倍,起泡与起泡稳定性平均提高了27.50%与5.39%。由光谱学测定分析得知,改性后蛋白的微观性结构发生变化,改研究为核桃蛋白功能性产品的开发以及在食品、医药中的应用提供相应的分析依据。

化学改性对核桃谷蛋白结构表征及功能特性的影响

采用化学(酰基化与磷酸化)方法对核桃蛋白中占70%以上的谷蛋白进行改性处理.核桃谷蛋白经改性后酰化蛋白和磷酸化蛋白溶解度分别提升了3.61倍和4.49倍,持水性提升了1.97倍和1.55倍,持油性略有降低,乳化性及起泡性总体变化不大.由光谱学分析可知,蛋白的二级以及三级结构发生了一定的变化,因此导致了蛋白功能特性的改变,这也为核桃蛋白功能特性改变提供了相应的分析依据.

基于酶解法制备核桃谷蛋白-2肽及其与锌螯合的影响

为研究核桃粕中各蛋白组分的锌离子螯合活性,从核桃粕中筛选出具有锌离子螯合活性的蛋白,并探讨螯合温度、螯合时间、螯合pH值和肽锌质量比对螯合能力的影响。从核桃粕中逐步分离提取出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2,并对比5种蛋白组分的含量及其酶解物与锌离子的螯合能力,最终选择螯合能力较强的核桃谷蛋白-2作为最适合的原料,占比为51.32%。将核桃谷蛋白-2经中性蛋白酶水解后,在螯合时间30 min、螯合pH值5.50、螯合温度52℃、肽与锌质量比2∶1时,获得的核桃谷蛋白-2肽锌螯合物的螯合能力和螯合物得率均最佳,分别为104.98 mg/g和70.53%。