脓毒血症早晚期肝细胞核被膜NTPase活性及poly(A)^+mRNA核浆转运的变化

目的和方法 :在盲肠结扎穿孔脓毒血症大鼠模型上 ,研究早晚期脓毒血症肝细胞核被膜核苷三磷酸酶 (NT Pase)活性及 poly(A) +mRNA核浆转运的变化。结果 :脓毒血症早期NTPase活性增加而晚期活性降低 ,即早期Vmax与对照组比增加 6 2 % (ATP ,P <0 .0 5 )和 18% (GTP ,P <0 .0 5 ) ;晚期Vmax下降 2 6 % (ATP ,P <0 .0 5 )和5 6 % (GTP ,P <0 .0 5 )。脓毒血症仅晚期NTPase底物亲和力降低 ,即晚期Km与对照组比分别升高 2 6 % (ATP ,P<0 .0 5 )和 37% (GTP ,P <0 .0 5 )。脓毒血症早期 poly(A) +mRNA核浆转运速率增加而晚期降低 ,即早期组 10min转运速率较对照组增加 2 7% (ATP ,P <0 .0 5 )和 30 % (GTP ,P <0 .0 5 ) ;晚期组降低 2 1% (P <0 .0 1)和 35 % (P <0 .0 1)。结论 :脓毒血症肝细胞核膜NTPase活性呈早期升高、晚期下降的双相变化与肝细胞核被膜 poly(A) +mR NA核浆转运速率的早、晚期变化相平行 ,同时与脓毒血症血糖浓度的早、晚期变化相关。

阻滞eIF-4E对乙酰肝素酶mRNA核浆转运及其表达的影响

目的 :确定结肠癌LS 1 74T细胞中过量表达的真核细胞起始因子 4E(eukaryoticinitiationfactor 4E ,eIF 4E)是否影响乙酰肝素酶 (heparanase)mRNA的核浆转运 ,并改变乙酰肝素酶表达水平 .方法 :脂质体包裹与eIF 4EmRNA翻译起始点互补的asODN转染人大肠腺癌细胞LS 1 74T .使用Westernblot,RT PCR方法分别检测eIF 4E被阻抑后其转录和翻译水平的改变 .乙酰肝素酶mRNA在细胞内核浆分布水平采用Northernblot检测 ,其蛋白表达采用Westernblot检测 .结果 :asODN转染显著抑制eIF 4E基因和蛋白表达 .伴随eIF 4E被阻抑 ,Northernblot结果显示更多乙酰肝素酶mRNA滞留在细胞核 ,且其蛋白表达量也下降 .结论 :阻抑eIF 4E可影响LS 1 74T细胞乙酰肝素酶mRNA核浆转运 ,并降低乙酰肝素酶蛋白表达 .

小G蛋白Ran介导的核浆转运

小G蛋白Ran作为一个信号分子家族,具有介导核浆转运,调控有丝分裂纺锤体的形成,有丝分裂后期核膜的重组,DNA复制的起始,细胞周期等功能。Ran小G蛋白对核浆转运的研究主要集中在:核浆转运过程中有哪些蛋白质及信号分子的参与,在生物学和相关疾病中的应用等。本文总结了Ran小G蛋白及其效应分子在核浆转运方面的研究内容,并简要阐述了小G蛋白Ran介导的核浆转运异常与相关疾病的发生。

Kap与Ran-GTP在核浆转运中的作用

生物大分子 (cargo)的核浆转运是由一些转运因子介导的 ,这些因子包括 Kap- α、Kap- β、Ran- GTP及其调节蛋白等。本文阐述了在核浆转运过程中 ,各因子之间的相互作用及其结构变化 ,并提出

重症肌无力患者胸腺组织核胞浆转运蛋白α-5的表达研究

目的探讨核胞浆转运蛋白α-5(karyopherin alpha-5,KPNA5)在重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者胸腺组织中的表达情况。方法分别利用荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)和免疫组化染色方法,检测MG组20例患者与对照组10名受试者胸腺组织中KPNA 5 mRNA和蛋白分子的表达。结果MG组和对照组胸腺组织中,KPNA 5 mRNA的表达水平分别为(0.71±0.08)和(0.57±0.02),两者之间的差异有统计学意义(P<0.05);KPNA 5蛋白阳性细胞均数分别为(8.99±0.49)和(5.88±0.69),差异有统计学意义(P<0.05)。结论KPNA 5分子在MG胸腺组织中表达增高,可能参与了MG的发生,是MG相关基因。

几种核受体核浆穿梭与调控机制

许多核受体属于核转录因子,它们在胞浆合成后快速地转运入核,同时还能够在核浆之间穿梭以行使其特定的生物学功能。核受体的核浆转运主要通过核膜上的核孔复合体,依靠运输载体Importins和Exportins介导以及Ran-GDP提供能量。现对糖皮质激素受体(GR)、雄激素受体(AR)和雌激素受体(ER)等核受体在核浆穿梭转运和调控机制等方面的研究进展进行综述,同时也介绍我们实验室最近发现的视黄素X受体(RXR)核浆穿梭转运的新功能。

核转运蛋白α2 通过ERK 信号通路调控乳腺癌细胞生物学行为的研究

背景与目的:核转运蛋白α2(KPNA2)异常表达能增强乳腺癌细胞迁移和侵袭能力,导致肺转移风险,并与乳腺癌患者不良预后相关。本研究进一步分析KPNA2在乳腺癌细胞中的表达情况,并探讨其对乳腺癌细胞生物学行为影响的相关机制。方法:用免疫组化检测62例乳腺癌患者癌组织与癌旁组织标本中KPNA2的表达。将两种人乳腺癌细胞株(MDA-MB-453、MCF-7)分为阴性对照组(转染空白质粒)、KPNA2敲低组(转染KPNA2 siRNA)、ERK抑制剂组(ERK抑制剂U0126处理)、联合组(转染KPNA2 siRNA联合U0126处理)。各组细胞处理48 h后,分别用qRT-PCR与Western blot检测KPNA2 mRNA与蛋白表达,并分别用MTT法、流式细胞术、Transwell实验、Western blot检测细胞增殖、凋亡、侵袭能力,以及ERK1/2通路与凋亡相关蛋白表达的变化。结果:免疫组化结果显示,KPNA2蛋白在乳腺癌组织中表达水平高于癌旁组织(2.48±0.39 vs.1.28±0.22,P<0.05)。qRT-PCR与Western blot结果显示,两种乳腺癌细胞株的阴性对照组和ERK抑制剂组的KPNA2 mRNA及蛋白表达水平均无明显差异(均P>0.05),而KPNA2敲低组和联合组KPNA2 mRNA和蛋白表达下调(均P<0.05)。功能实验结果显示,与各自的阴性对照组比较,ERK抑制剂组、KPNA2敲低组和联合组的细胞增殖率降低、凋亡率升高、细胞侵袭能力减弱,其中联合组各项变化最为明显(均P<0.05)。Western blot结果显示,与各自的阴性对照组比较,ERK抑制剂组、KPNA2敲低组和联合组磷酸化ERK1/2、裂解的胱天蛋白酶3蛋白表达均下调,且联合组两者的下调程度最为明显(均P<0.05)。结论:乳腺癌组织中KPNA2表达水平升高,其增强乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的作用可能与活化ERK信号通路有关,KPNA2有望作为乳腺癌药物开发的新靶点。

Nrf2-ARE通路抑制作用研究展望

转录因子红细胞系-2p45(NF-E2)相关因子-2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)通过上调解毒酶和抗氧化酶基因的表达,为人体提供防御系统。然而,Nrf2表达过高,不但对肿瘤形成和生长起促进作用,而且可增强肿瘤细胞的耐药性。

低表达Nrf2增敏奥沙利铂抗H460细胞增殖作用

目的:建立Nrf2低表达的H460细胞株,可增敏奥沙利铂对肿瘤细胞的抗增殖作用,同时为Nrf2-ARE信号通路的研究提供便捷途径。方法:H460细胞转染pRS-hNrf2后经过筛选得到多个单克隆细胞株,通过Western blotting和GSH含量的检测方法分析各细胞株中Nrf2及其调控基因的表达以及GSH含量的变化,用MTS法检测细胞株对抗癌药物的敏感性。结果:H460细胞转染pRS-hNrf2后筛选建立Nrf2低表达的稳定细胞株H460-C9和H460-C13,与对照组相比其GSH含量均有显著降低(PC9=0.00249,PC13=0.03944);同时,MTS检测表明,抗癌药物奥沙利铂和阿霉素的抗细胞增殖作用在H460-C9和H460-C13细胞株中明显增强。结论:成功建立Nrf2低表达的H460-C9和H460-C13细胞株,与对照组细胞株相比,低表达Nrf2可增敏奥沙利铂对肿瘤细胞的抗增殖作用。

稳定表达Keap1的H460-N5细胞株的建立及增敏抗肿瘤药物作用的研究

目的:建立野生型Keap1过表达的H460细胞株降表达Nrf2,检测Nrf2-ARE信号通路对肿瘤细胞耐药性的影响。方法:H460细胞转染mKeap1-pEGFP后经过长期筛选得到稳定表达Keap1蛋白质的细胞株,通过Western blotting和荧光定量PCR的方法进行检测;并通过多次继代培养,细胞株H460-N5稳定表达mKeap1,Nrf2及其调控基因均显著降表达;用MTS法检测抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对细胞增殖抑制率。结果:H460细胞转染mKeap1-pEGFP后筛选建立Nrf2降表达的稳定细胞株H460-N5。MTS数据显示,与对照组相比,抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对H460-N5细胞的抗增殖作用更显著。当奥沙利铂和依托泊苷分别在93μmol/L和100μmol/L浓度作用于对照组细胞株H460-N0时,药物作用接近半数抑制率(IC50);而在H460-N5细胞株中,两种抗癌药物的IC50分别为42μmol/L和30μmol/L。阿霉素对H460-N0细胞的IC50>3 mg/L,而对H460-N5细胞的IC50约为2 mg/L。结论:Keap1过表达的H460-N5细胞Nrf2及调控基因显著降低并增敏抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对肿瘤细胞的增殖抑制作用。

转录抑制剂DRB和α-Amanitin对A549细胞中Nrf2定位影响的研究

目的:利用细胞核亚细胞器结构的一些特异性蛋白质SC35、核孔复合体(nuclear porecomplex,NPC)、RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)及Y12等标记亚细胞器,探讨转录抑制剂5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole(DRB)与α-Amanitin对人非小细胞肺癌A549细胞中Nrf2的表达与定位的影响。方法:①50 mg/L DRB和2.5 mg/Lα-Amanitin分别作用于A549细胞1 h和6 h后,Western blotting检测Nrf2及其相关蛋白的表达变化。②50 mg/L DRB和2.5 mg/Lα-Amanitin分别处理A549细胞1 h,利用免疫荧光细胞技术检测Nrf2、SC35、NPC、RNAPolⅡ、Y12形态结构的变化,并研究Nrf2定位的变化。结果:①与对照组相比,DRB和α-Amanitin作用1 h后,Nrf2及其调控的下游基因HO-1、AKR1C和NQO1的蛋白质表达变化不明显,但6 h作用后,这些蛋白质的表达明显降低。②激光共聚焦显微镜观察显示,细胞经DRB和α-Amanitin处理1 h后,SC35的荧光强度明显增强,PolⅡ的荧光强度减弱,而Nrf2的定位无明显改变;NPC、Y12的表达无明显变化,且与Nrf2无共定位现象。结论:DRB和α-Amanitin能抑制Nrf2及其HO-1、AKR1C和NQO1的表达,但是对Nrf2的定位没有显著影响。

tBHQ和Sulforaphane对Caco2细胞Nrf2-ARE信号通路的影响

目的:研究抗氧化性诱导剂(激活剂)叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)和莱菔硫烷[1-异硫氰酸-(4R,S)-(甲基亚磺酰基)丁烷](sulforaphane,SFN)对人结肠癌细胞株Caco2的Nrf2-ARE信号通路的影响。方法:选取不同的时间点,分别用20μmol/L tBHQ和5μmol/L SFN处理Caco2细胞,从蛋白质水平、mRNA水平和蛋白质定位3个方面,分别用Westernblotting、real-time PCR和免疫荧光染色(immunoflourescence staining,IF)方法来检测Nrf2以及其调控基因AKR1C1和NQO1(Western blotting,real-time PCR)表达的变化。结果:细胞核中Nrf2基因表达的最佳时间点为加药诱导后8 h,细胞质中Nrf2调控基因AKR1C1和NQO1表达的最佳时间点为加药诱导后16 h。tBHQ的诱导作用在撤去之后仍能持续4 h。结论:本研究使用激活剂tBHQ和SFN对Caco2细胞的Nrf2-ARE信号通路进行诱导,取得了最佳的诱导时间点,并研究了撤去tBHQ后持续诱导时间,为今后在肿瘤化学预防研究中,筛选合适的激活剂及其剂量和使用次数提供了重要依据,也为研究Nrf2-ARE信号通路的抑制剂提供了重要信息。

Nrf2/ARE通路在消化道肿瘤预防中的研究进展

转录因子红细胞系-2 p45(NF-E2)相关因子-2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)通过与抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element)结合,调控一系列二相解毒酶和抗氧化酶基因的表达,从而保护机体免受化学致癌剂的伤害,大量研究证明Nrf2对预防肿瘤发生起重要的作用。目前,肠癌、胃癌、食管癌等消化道肿瘤是我国高发癌症类型,服用天然或人工合成的Nrf2激活剂有可能是防止此类疾病发生的有效措施。文中基于动物模型和临床的研究报道,综述了Nrf2/ARE通路在消化道肿瘤化学预防中的最新进展。

ABCG2-SiRNA转染前后Hep-2细胞系侧群细胞含量变化的研究

目的探讨腺苷三磷酸结合区转运蛋白G超家族成员-2(ABCG2)基因失活前后hep-2细胞系中侧群细胞含量的差别。方法体外培养hep-2细胞,应用荧光染料Hoechst33342让对数期hep-2细胞进行染色,对照组加入荧光染料Hoechst33342及MDRI(多重耐药基因multiple drug resistance)抑制剂维拉帕米,流式细胞仪检测SP细胞亚群含量;ABCG2-SiRNA转染hep-2细胞系后,应用荧光染料Hoechst33342对转染后细胞进行染色,对照组加入荧光染料Hoechst33342及维拉帕米,流式细胞仪检测SP细胞亚群含量,比较转染前后SP细胞亚群含量变化。结果 ABCG2-SiRNA转染前hep-2细胞Hoechst33342组SP细胞含量(3.15±0.32)%,Hoechst33342+维拉帕米组SP细胞含量(0.4±0.11)%;ABCG2-SiRNA转染后hep-2细胞Ho-echst33342组SP细胞含量(1.15±0.22)%,Hoechst33342+维拉帕米组SP细胞含量(0.0±0.09)%,转染后SP细胞亚群含量明显降低(P<0.05)。结论 ABCG2基因在喉癌SP细胞的发生发展过程中起重要作用,可能成为喉癌靶向治疗的潜在靶点。

Kapβ2介导的hnRNPA2/B1核转位与七氟烷脑神经毒性的关系:细胞实验

目的采用细胞实验评价核转运蛋白β2(Kapβ2)介导的核不均一性核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)核转位与七氟烷脑神经毒性的关系。方法采用小鼠海马细胞系HT_(2)2细胞,以2×10^(5/)孔和1×10^(6)/孔的密度接种于共聚焦培养皿和六孔培养板,采用随机数字表法分为4组(n=12):携带绿色荧光蛋白(GFP)空载腺病毒转染的对照组(GFP-C组)、携带GFP空载腺病毒转染的七氟烷组(GFP-Sev组)、Kapβ2基因过表达腺病毒转染的对照组(Kapβ2-C组)和Kapβ2基因过表达腺病毒转染的七氟烷组(Kapβ2-Sev组)。细胞常规培养48 h后,转染携带GFP的空载腺病毒(GFP-C组和GFP-Sev组)和Kapβ2基因过表达的腺病毒(Kapβ2-C组和Kapβ2-Sev组)。转染48 h后GFP-C组和Kapβ2-C组继续常规培养48 h;GFP-Sev组和Kapβ2-Sev组采用3%七氟烷孵育3 h,随后常规培养48 h。采用Western blot法测定细胞Kapβ2、突触素(SYP)、突触后密度蛋白95(PSD95)、hnRNPA2/B1表达,并计算hnRNPA2/B1核质比。采用免疫荧光实验进行hnRNPA2/B1亚细胞定位。结果与GFP-C组比较,GFP-Sev组SYP、PSD95表达下调,hnRNPA2/B1核质比降低,细胞质hnRNPA2/B1表达上调,Kapβ2-C组Kapβ2表达上调(P<0.05);与Kapβ2-C组比较,Kapβ2-Sev组SYP、PSD95表达下调,hnRNPA2/B1核质比降低,细胞质hnRNPA2/B1表达上调(P<0.05);与GFP-Sev组比较,Kapβ2-Sev组Kapβ2、SYP、PSD95表达上调,hnRNPA2/B1核质比升高,细胞质hnRNPA2/B1表达下调(P<0.05)。结论Kapβ2介导的hnRNPA2/B1核转位可能是七氟烷脑神经毒性的内源性保护机制。

ABCG2转运蛋白的研究进展

ABCG2转运蛋白是与肿瘤多药耐药有关的新的药物排出泵,具有抑制消化道吸收某些外源性物质,参与形成胎盘屏障等生理功能。通过研究ABCG2转运蛋白的功能及其转运机制,寻找低毒有效的ABCG2调节剂是提高化学治疗疗效的重要方法。研究ABCG2基因多态性对于改善药物疗效,提高药物的生物利用度,避免和降低药物的不良反应,指导临床抗肿瘤个体化治疗具有重要意义。近年来关于ABCG2转运蛋白的研究取得了较大的进展,本文综述了相关领域的研究结果。

酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B促肿瘤机制的体外研究

目的:探讨酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B(acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32B,ANP32B)促进肿瘤发生、发展的分子机制,为其可能作为治疗靶点提供理论依据。方法:利用免疫沉淀联合质谱技术寻找和验证ANP32B相互作用蛋白;免疫荧光技术检测ANP32B和核浆转运蛋白α6(karyopherinα6,KPNA6)在细胞内的定位;采用短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)沉默KPNA6的表达;行GST-pulldown实验明确ANP32B与KPNA6直接结合及相互作用的区域。结果:通过免疫沉淀和质谱鉴定发现,ANP32B与KPNA6间存在相互作用,两者的结合不依赖ANP32B N端1~161氨基酸序列。体外GST-pulldown实验证实,KPNA6与ANP32B间存在直接的相互作用,且两者结合依赖ANP32B的核定位信号。利用sh RNA抑制KPNA6的表达后,并不影响ANP32B的核内定位。结论:ANP32B通过核定位信号序列与KPNA6结合,两者在细胞核中有明显的共定位,而敲除KPNA6并不影响ANP32B的核内定位。

小G蛋白Ran的研究进展

真核细胞中含量最丰富的小G蛋白Ran(Ras relatednuclearprotein) ,具有与其所属的Ras家族其它成员不同的生化特点。其活性主要受到Ran的鸟苷酸交换因子 (RanGEF)RCC1(regulatorofchromosomecondensation 1) ,GTP酶激活蛋白 (GTPase activatingprotein ,GAP)以及Ran结合蛋白 (Ranbindingprotein ,RanBP)的调节。Ran主要参与了物质的核浆转运 ,此外在RNA出核、RNA合成、加工及细胞周期调控中也起到一定作用 ,并且是LPS活化基因的产物。

动脉粥样硬化患者血清微小RNA-181b的异常表达及其作用

目的 观察动脉粥样硬化患者血清中微小RNA-181b（miR-181b）的表达情况,以及miR-181b对人血管内皮细胞核内转移蛋白-α3（Importin-α3）表达和血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响,探讨miR-181b在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用.方法 选取2012年11月至2013年6月在上海交通大学医学院附属第三人民医院就诊的经外周动脉超声检查诊断为动脉粥样斑块形成的50例患者为动脉粥样硬化组,平均年龄（78.1±8.9）岁;同时入选50名健康成人为对照组,平均年龄（72.5±10.7）岁.采集患者外周血,采用带茎环结构的实时定量PCR方法检测其血清中miR-181b 的表达水平;经Targetscan和Pitar靶基因预测数据库预测核质转运受体Importin-α3为miR-181b的靶基因,体外实验采用Western blot检测miR-181b对人血管内皮细胞Importin-α3表达的影响;采用双荧光素酶报告基因检测证实Importin-α3为miR-181b的直接靶基因;CCK8法和Transwell小室试验检测miR-181b对人血管平滑肌细胞增殖、迁移能力的影响.结果 与正常组比较,动脉粥样硬化组血清中miR-181b的表达水平较低（31.69±0.96比82.28±5.95,P＜0.05）;Western-blot和双荧光素酶报告实验证实Importin-α3为miR-181b的直接靶基因;增高miR-181b的表达使得人血管平滑肌细胞的增殖（1.57±0.18比2.66±0.16,P＜0.05）和迁移能力（8.7±1.1比21.4±2.3,P＜0.05）明显降低;抑制miR-181b的表达则获得相反的效果（增殖：2.88±0.09比2.04±0.11,P ＜0.05;迁移：15.2±1.5比8.4±1.3,P＜0.05）.结论 动脉粥样硬化患者血清中miR-181b表达水平低于正常人,miR-181b可能通过阻断血管内皮细胞中核因子-κB信号途径和通过抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移起到抗动脉粥样硬化的作用.

Oct-4、SOX2和KPNA2在三阴性乳腺癌中的表达及其临床意义

目的:探讨三阴性乳腺癌(TNBC)组织中Oct-4、SOX2和KPNA2的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化方法检测Oct-4、SOX2和KPNA2在30例TNBC和30例非TNBC患者癌组织中的表达,分析三者的表达与TNBC患者临床病理因素及预后的关系。结果:与非TNBC组织比较,TNBC组织中Oct-4的阳性表达率(86.7%vs.73.3%,P<0.05)和SOX2的阳性表达率(90.0%vs.70.0%,P<0.05)均明显升高,KPNA2的阳性表达率无统计学差异(P>0.05)。在TNBC组织中,Oct-4、SOX2和KPNA2彼此间的表达均呈正相关(Oct-4和SOX2:r=0.680,P<0.0001;Oct-4和KPNA2:r=0.581,P=0.0008;SOX2和KPNA2:r=0.770,P<0.0001)。在TNBC患者中,Oct-4的表达与年龄、组织学分级、淋巴结转移和TNM分期均有关,SOX2的表达与淋巴结转移和TNM分期有关,KPNA2的表达与淋巴结转移有关(均P<0.05);Oct-4、SOX2、KPNA2阳性表达患者生存率明显低于各自阴性表达患者(均P<0.01)。结论:Oct-4、SOX2在TNBC组织中表达均增加,且两者可能与KPNA2共同参与了TNBC的恶性进展。