姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡过程中核磷蛋白的表达与定位变化

目的探讨核磷蛋白NPM在癌细胞诱导凋亡过程中在细胞内、细胞核基质上的定位与表达变化,以及NPM与凋亡调控相关蛋白的关系,探索其在凋亡调控中的作用。方法在姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡的基础上,以亚细胞蛋白质组学方法分析NPM在核基质中的存在与变化,并以免疫印迹法杂交实验进行确证;激光扫描共焦显微镜观察NPM在EC9706细胞凋亡过程中的定位与变化,以及NPM与Bax、Bcl-2等基因产物的共定位关系。结果 NPM存在于EC9706细胞核基质蛋白组分中,并在姜黄素处理后表达下调。NPM在EC9706细胞凋亡过程中发生显著的胞质-核之间的穿梭定位变化,并与Bax、Bcl-2等蛋白具有共定位关系,且共定位区域发生了变化。结论 NPM是一种核基质结合蛋白,在EC9706细胞凋亡中的表达与定位变化,及其与凋亡调控蛋白的共定位关系提示,它在EC9706细胞凋亡调控中具有重要作用。

黄芩苷和核磷蛋白基因沉默对人皮肤鳞癌细胞增殖的影响

目的观察黄芩苷及小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默核磷蛋白(nucleophosmin,NPM)基因对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖活性及细胞周期的影响。方法针对NPM信使RNA(messenger RNA,mRNA)序列设计合成特异性siRNA,转染A431细胞,并加入50 mg/L黄芩苷孵育;采用细胞增殖/毒性检测试剂盒(cell countingkit-8,CCK-8)法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果黄芩苷孵育可使细胞增殖活性降低(P<0.05),发生S期阻滞;NPM基因沉默可明显增强黄芩苷的作用。结论黄芩苷可抑制皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖生长,其机制可能与调控NPM基因表达有关。

核磷蛋白A型突变体对髓性白血病细胞系增殖的影响

目的研究核磷蛋白A型突变体基因转染对人髓性白血病细胞系体外增殖的影响。方法构建含核磷蛋白A型突变基因(NPM-mA)的真核表达质粒pEGFPC1-NPM-mA,选择NPM-mA阴性、抑癌基因p14ARF有无缺失的两株人髓性白血病细胞KG-1a和K562作为靶细胞,将pEGFPC1-NPM-mA重组质粒和pEGFPC1空质粒分别转染白血病细胞,以未转染组为对照。用RT-PCR和免疫组化来分析转染细胞目的基因mRNA和蛋白质的表达。采用台盼蓝拒染法计数活细胞,绘制转染前后生长曲线,观察细胞体外生长的改变。结果转染后的两种白血病细胞株表达NPM-mA mRNA,胞浆内NPM-mA蛋白阳性,符合NPM突变蛋白胞质移位的特点。细胞生长曲线显示,转染NPM-mA质粒的KG-1a细胞较空质粒转染和未转染组细胞生长速度明显加快,而转染NPM-mA质粒的K562细胞则较对照组细胞生长明显受抑制(P<0.05)。结论NPM-mA基因稳定转染可影响白血病细胞的增殖活性,在无ARF缺失时NPM-mA突变体可促进白血病细胞体外生长。

鼻咽癌组织中核磷蛋白表达水平与患者疗效的关系

目的:探讨核磷蛋白(nucleophosmin,NPM、B23、NO38或NPM1)在鼻咽癌活检组织中的表达水平与增殖指数和患者个体化治疗后疗效的关系。方法:随机选取中山大学肿瘤防治中心2001年1月1日至2003年12月31日期间收治的157例初诊鼻咽癌患者的治疗前活检蜡块,用免疫组织化学法检测鼻咽癌活检组织中NPM1和Ki67的表达,并结合相应临床病理资料,应用统计学方法对结果进行分析。结果:NPM1的表达水平与Ki67的表达水平呈正相关(r=0.445,P<0.01),与淋巴结分期呈负相关(N0,N1,N2和N3;r=-0.235,P<0.01),但与原发灶分期(T1,T2,T3和T4;r=0.006,P>0.05)和临床分期(r=-0.74,P>0.05)无相关性。NPM1表达水平与有淋巴结转移组治疗后淋巴结情况呈负相关(r=-0.196,P<0.05),与无淋巴结转移组治疗后原发灶情况呈负相关(r=-0.349,P<0.05)。NPM1表达水平与预后无明显相关性。结论:NPM1在鼻咽癌组织中高表达并与Ki67的表达水平呈正相关,NPM1有促进细胞增殖的作用且可能作为一个评估个体化治疗疗效的评价指标。

胱氨酸对MCAO模型鼠海马CA1区神经干细胞核磷蛋白表达的影响

目的:研究胱氨酸(CYS)对大鼠MCAO模型再灌注后海马CA1区神经干细胞凋亡相关蛋白核磷蛋白(NPM)表达水平的影响,探讨CYS保护细胞的机制。方法:线栓法制备MCAO模型,104只大鼠随机分为假手术组8只,MCAO组与MCAO+CYS治疗组各按时间点随机分为6个亚组,每亚组8只。MCAO+CYS治疗组给予CYS(0.15mg/g),腹腔注射;MCAO组与假手术组给予生理盐水(1mL/d),腹腔注射;TUNEL染色方法检测海马CA1区的神经干细胞的凋亡水平,免疫组织化学染色方法检测NPM表达水平的变化。结果:MCAO组与MCAO+CYS治疗组海马CA1区TUNEL阳性细胞数目增加,MCAO组增加显著。假手术组海马CA1区NPM的表达有一定的数量,MCAO组表达数量增加,MCAO+CYS治疗组显著增强。结论:大鼠海马CA1区核磷蛋白可受大脑中动脉阻塞急性缺血缺氧的作用而表达水平增加,应用胱氨酸治疗大大增加核磷蛋白的表达。

核磷蛋白的生物学功能及其与肿瘤发生的关系

核磷蛋白(NPM)是一种多功能蛋白质,参与核糖体的生物合成,控制中心体复制,具有分子伴侣作用,并通过多种信号通路调节细胞增殖和凋亡。人体内NPM的突变、其所在的5号染色体发生异位和该染色体上某些部位的缺失与若干种人类肿瘤的发生发展密切相关。

核磷蛋白小分子抑制剂NSC348884对肝癌细胞HepG2的体外抑制作用

目的探讨核磷蛋白小分子抑制剂NSC348884对肝癌细胞HepG2体外生长的抑制作用及其作用机制。方法应用核磷蛋白小分子抑制剂NSC348884处理HepG2细胞,噻唑蓝法检测HepG2细胞增殖的变化,蛋白印迹检测核磷蛋白寡聚物和单体表达变化,流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡率的变化。结果 HepG2细胞经NSC348884作用4 d后,药物浓度在1～10μmol/L时明显抑制HepG2细胞的增殖(P<0.05),半数抑制浓度为1.4μmol/L;药物作用24 h后,核磷蛋白寡聚物表达水平明显降低,而单体表达水平明显升高(P<0.05);经1μmol/L、2μmol/L NSC348884处理后,HepG2细胞24 h凋亡率分别为(13.770±0.335)%、(19.021±0.237)%,高于对照组的(6.950±0.207)%(P<0.05)。结论 NSC348884能促进HepG2细胞核磷蛋白寡聚物向单体的转化,从而抑制肝癌HepG2细胞的体外生长。

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建高效抑制核磷蛋白NPM1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰载体。方法:以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体pll3.7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其与慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HT1080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果:酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HT1080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPM1的表达显著降低。结论:构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPM1的表达,为NPM1功能的研究提供了有力工具。

猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B23.1基因的引物,利用RT-PCR技术扩增了N基因和Vero E6细胞的B23.1基因的cDNA,分别克隆到真核表达载体pAcGFP1-C1和pDsRed2-N1,获得重组质粒pAcGFP1-C1/N和pDsRed2-N1/B23.1,共转染Vero E6细胞。【结果】Western blots分析表明这些融合蛋白在转染的Vero E6细胞中表达;共聚焦显微镜技术分析表明在共转染Vero E6细胞中猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6细胞核磷蛋白B23.1发生共定位。【结论】为进一步鉴定PEDV N蛋白中核仁定位信号和N蛋白核仁定位机制提供可靠依据。

新城疫病毒基质蛋白与禽细胞核磷蛋白B23.1在HEK-293T细胞中的相互作用

【目的】探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白和禽细胞核磷蛋白B23.1在HEK-293T细胞中的相互作用。【方法】分别参照GenBank中NDV JS/5/05/Go株全基因序列(JN631747)和禽细胞核磷蛋白B23.1基因序列(NM_205267),设计、合成扩增M基因和B23.1基因的引物,利用RT-PCR扩增出M基因和DF1细胞的B23.1基因,分别克隆至真核表达载体获得重组表达质粒pEGFP-M、pCMV-HA-M和pDsRed-B23.1;将pEGFP-M和pDsRed-B23.1共转染HEK-293T细胞,利用荧光显微镜观察M蛋白与B23.1蛋白的共定位;利用免疫共沉淀(Co-IP)技术进一步验证两种蛋白的相互作用。【结果】Western blot结果表明构建的重组质粒在转染的HEK-293T细胞中正确表达;荧光显微镜观察显示M蛋白与B23.1蛋白在核仁具有共定位特征;Co-IP进一步证实两者能发生相互作用。【结论】NDV M蛋白与禽细胞核磷蛋白B23.1存在相互作用,M蛋白可能通过与B23.1蛋白的相互作用进入核仁。

核磷蛋白在肝癌细胞多药耐药中的作用

目的探讨核磷蛋白（NPM）在肝癌细胞多药耐药中的作用及其机制。方法通过质粒转染建立稳定的高表达NPM的肝癌细胞株：HepG2／NPM和SMMC7721／NPM细胞株，通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞对化疗药物的半数抑制浓度（IC50）值；划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力；Westernblot和实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR）检测各基因的蛋白和mRNA表达。结果与亲本细胞比较，NPM高表达的细胞对化疗药物的耐药性增加，阿霉素（ADM：8．31±0．89比0．38±0．13，P=0．000；14．84±1．61比1．69±0．31，P=0．001），顺铂（DDP：4．23±1．18比1．33±0．29，P=0．047；8．42±0．85比3．03±0．55，P：0．000），5-氟尿嘧啶（5-Fu：20．75±1．02比7．97±0．97，P=0．001；16．28±1．64比5．85±1．04，P=0．000），细胞的迁移和侵袭能力增强，且多药耐药基因1（MDR-1：3．85±0．67比0．97±0．22，P=0．043；4．33±0．77比1．04±0．27，P=0．021），多药耐药相关蛋白1（MRP-1：3．76±1．04比1．01±0．21，P=0．033；4．75±0．88比1．01±0．17，P=0．028）及P．糖蛋白（P-gP：2．06±0．27比1．04±0．19，P=0．000；3．47±0．93比1．02±0．17，P=0．000）的表达均增加。结论NPM可以增强肝癌细胞对化疗药物的耐药性以及迁移和侵袭能力，其机制可能与上调MDR-1／P-gP信号通路的表达相关。

核磷蛋白与肿瘤的发生

核磷蛋白(nucleophosmin,NPM)是一个具有多种功能的重要蛋白,定位于核仁,可在胞核与胞浆之间快速穿梭。NPM基因在多种人类肿瘤中过表达,因此被公认为肿瘤标志物和癌基因。后来研究发现NPM也具有抑制肿瘤的功能,它的缺失、突变甚至重排与多种肿瘤的发生密切相关。这表明NPM的作用及其机制非常复杂,可能通过多种机制调控肿瘤的发生。

酸性核磷蛋白32A表达在结直肠癌肝转移中的临床意义

为探讨酸性核磷蛋白32A(ANP32A)的表达与结直肠癌肝转移的相关性,选取本院收治的结直肠癌162例。其中肝转移35例设为转移组,无肝转移127例设为无转移组。采用免疫组织化学SP法检测ANP32A在结直肠癌与癌旁组织中的表达水平,分析ANP32A表达与结直肠癌肝转移的相关性。结果显示,癌组织中ANP32A阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05),肝转移组ANP32A阳性表达率高于无肝转移组(P<0.05)。单因素分析显示肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度、淋巴结转移、CEA、CA199和ANP32A高表达与结直肠癌肝转移密切相关(P<0.05),多因素Logistic回归分析显示区域淋巴结转移、CEA、CA199和ANP32A表达为结直肠癌肝转移的独立危险因素(P<0.05)。结果表明,ANP32A在结直肠癌组织中呈高表达,与结直肠癌肝转移密切相关。

肝肠钙黏连蛋白与核磷蛋白在胃腺癌中的表达及其相关性分析

目的探讨肝肠钙黏连蛋白（LI-cadherin）及核磷蛋白（NPM）在胃腺癌组织中的表达、与胃腺癌生物学行为的关系以及2种蛋白的相关性。方法采用免疫组化S-P法，检测肝肠钙黏连蛋白及核磷蛋白在60例胃腺癌组织中的表达，并分析其与肿瘤生物学行为的关系。结果肝肠钙黏连蛋白与核磷蛋白在胃腺癌组织中的阳性率分别为51．67％和76．67％，两种蛋白表达呈正相关（r=0．798，P〈0．05）；肝肠钙黏连蛋白的表达与胃腺癌的分化程度及淋巴结转移有关（P〈0．05），而核磷蛋白的表达与胃腺癌的分化程度及TNM分期有关（P〈0．05），二者均与性别、年龄无关（P〉0．05）。结论胃腺癌的发生与肝肠钙黏连蛋白和核磷蛋白的高表达有关，二者在胃腺癌中表达的一致性，提示核磷蛋白可能为1种较为可靠的检测胃腺癌发生及发展的分子标记物。

核磷蛋白基因突变与急性髓系白血病研究进展

核磷蛋白（NPM）是位于核仁颗粒区的一种多功能核仁磷酸化蛋白质，能穿梭于核仁、核质和胞质之间，在细胞的生命活动中发挥重要作用，并可通过多种信号通路调节细胞增殖和凋亡，参与多种肿瘤的发生。

酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员A对心肌细胞肥大的影响及机制研究

目的探讨酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员A(Anp32a)对心肌细胞肥大的作用及机制。方法通过挖掘数据库小鼠心脏假手术组及主动脉缩窄手术组芯片数据,进行差异基因分析。选取8~10周龄小鼠,随机分为模型组和假手术组(n=7或8),终末取材提取心脏组织RNA检测Anp32amRNA表达水平。构建Anp32a敲低(AdshAnp32a),Anp32a过表达(AdAnp32a)及其相应的对照组AdshRNA,AdGFP腺病毒并转染H9C2心肌细胞,以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激H9C2心肌细胞诱导心肌细胞肥大,提取细胞RNA通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测心肌肥厚指标[心房利钠肽(AnP),脑利钠肽(Bnp),β-肌球蛋白重链(β-Mhc)]表达变化,并通过心肌细胞骨架蛋白(α-actinin)的免疫荧光染色观察Anp32a对心肌细胞大小的影响。机制研究方面,通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测Anp32a在调节心肌肥厚过程中涉及的信号通路的变化。结果 Anp32a在心肌肥厚模型中表达下调。AngⅡ刺激细胞,免疫荧光染色检测AdAnp32a组细胞明显较其对照组(AdGFP)减小,而AdshAnp32a组心肌细胞与其对照组(AdshRNA)相比显著增大。qPCR检测显示AdAnp32a组心肌肥厚基因(Anp、Bnp、β-Mhc)的mRNA表达降低,而AdshAnp32a组表达则相反。Western blot检测发现Anp32a能够抑制AngII诱导的Akt蛋白磷酸化水平的升高。结论 Anp32a通过AKT信号通路抑制心肌细胞肥大,可作为防治心肌肥厚及心力衰竭的潜在治疗靶点。

核磷蛋白在大肠癌发生发展中的表达及意义

目的:探讨核磷蛋白在大肠良、恶性肿瘤组织中的表达及其临床意义。方法:应用免疫组织化学方法检测核磷蛋白在大肠腺瘤、大肠腺癌和癌旁正常组织中的表达情况。结果:核磷蛋白在大肠腺瘤、腺癌中阳性率分别为70.83%,76.92%;与癌旁正常组织阳性率38.46%比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。大肠腺癌核磷蛋白阳性率与腺瘤伴轻、中度不典型增生核磷蛋白阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05),而与腺瘤伴重度不典型增生核磷蛋白阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。大肠癌组核磷蛋白表达强度与肿瘤Dukes分期、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05)。结论:核磷蛋白在大肠腺瘤和大肠癌中均表达,其参与大肠癌发生的早期阶段,并在大肠癌发展中发挥一定作用;检测核磷蛋白的表达情况可能对大肠癌早期诊断、指导治疗、改善预后有一定价值。

核磷蛋白1与Runt相关转录因子1基因共突变对非急性早幼粒细胞白血病型急性髓系白血病患者化疗疗效及预后的影响

目的探讨核磷蛋白1(NPM1)与Runt相关转录因子1(RUNX1)基因共突变对非急性早幼粒细胞白血病(M3)型急性髓系白血病(AML)患者化疗疗效及预后的影响。方法纳入120例非M3型AML患者,收集其一般临床资料(性别、年龄、AML类型、骨髓幼稚细胞数量)、初诊时血常规结果[WBC计数、中性粒细胞(NEU)计数、淋巴细胞(LYM)计数]及化疗疗效。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测患者NPM1与RUNX1基因表达情况,根据基因突变检测情况将120例患者分别分为NPM1基因突变型组(33例)和NPM1基因野生型组(87例)、RUNX1基因突变型组(26例)和RUNX1基因野生型组(94例)、NPM1与RUNX1基因共突变型组(23例)和NPM1与RUNX1基因野生型组(97例)。比较不同NPM1与RUNX1基因型组患者一般临床资料、初诊时血常规结果及化疗疗效。采用Kaplan-Meier生存分析评估NPM1和RUNX1基因与非M3型AML患者预后的相关性。采用多因素logistic分析探讨影响非M3型AML患者化疗预后的因素。结果与正常核型患者相比,异常核型患者NPM1基因突变与RUNX1基因突变比例均较高(P<0.05)。NPM1基因野生型组与NPM1基因突变型组、RUNX1基因野生型组与RUNX1基因突变型组、NPM1与RUNX1基因野生型组与NPM1与RUNX1基因突变型组患者性别、年龄、AML类型及初诊血常规中WBC、NEU、LYM计数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。NPM1基因突变型组患者化疗有效率效显著高于NPM1基因野生型组,NPM1与RUNX1基因共突变组患者化疗有效率显著高于NPM1与RUNX1基因野生型组(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,随访2年NPM1与RUNX1基因共突变患者总生存期(OS)长于NPM1与RUNX1基因野生型,而NPM1或RUNX1基因单突变患者OS介于前两者之间(P<0.05)。多因素logistic分析结果显示,骨髓幼稚细胞数量是接受化疗的非M3型AML患者化疗后2年生存率的危险因素(P=0.018),而NPM1与RUNX1基因共突变是其保护因素(P=0.026)。结论NPM1与RUNX1基因共突变的非M3型AML患者化疗疗效及预后较佳。

核磷蛋白与肿瘤的发生

核磷蛋白（NPM，也称作B23、N038或Numatrin）是主要的核仁磷酸化蛋白，它参与核糖体的生物合成，控制中心体复制，具有分子伴侣作用，并可通过多种信号通路调节细胞增殖和凋亡，参与多种肿瘤的发生。

核磷蛋白C末端基因突变与急性髓系白血病

核磷蛋白（Nucleophosmin，NPM）是多功能蛋白质，能在胞核-胞质之间运输，主要定位于核仁。NPM基因突变在正常核型的AML出现频率为40％～50％，突变NPM异常定位于白血病细胞的胞质。NPMC末端第288位和第390位（或只有第290位）色氨酸的缺失和核输出信号的产生导致胞质NPM聚集。伴有NPM基因突变的AML具有在成人和女性出现率较高，累及多个细胞系，同时伴发FLT3／ITD突变，CD34阴性等特点。免疫组化的方法可以检测到NPM基因突变所产生的胞质NPM，是研究伴有NPM基因突变的AML的有效方法。存在NPM基因突变但不具有FLT3／ITD突变的患者预后较好。由于NPM基因突变出现率高且较稳定，使之可能成为监测正常核型AML微小残留病灶新的分子标志。