水稻核糖体失活蛋白家族基因OsRIP8的生物信息学与功能分析

核糖体失活蛋白(RIPs)是一种能使真核细胞核糖体功能被抑制的毒蛋白。OsRIP8是属于该家族的一个功能未知基因。为研究该基因生物学功能,通过数据库对其进行生物信息学分析,利用qRT-PCR验证其表达模式,同时构建OsRIP8-RNAi干涉载体并利用农杆菌转化水稻,采用PCR技术鉴定出转基因阳性植株,分析阳性植株的表达和农艺性状,初步揭示该基因的功能。结果表明,水稻OsRIP8蛋白为不稳定亲水蛋白,不含信号肽及完整的跨膜结构域,蛋白结构以α螺旋为主;在OsRIP8基因启动子区域存在着与植物生长发育、生物与非生物胁迫以及植物激素响应有关的元件;OsRIP8基因的共表达基因富集到多种大分子的生物合成与蛋白代谢等途径;qRT-PCR分析结果表明,OsRIP8基因在发育的小穗及抽穗前1 d的花药中优先表达;RNAi干涉后OsRIP8基因的表达下调造成植株花粉育性和结实率显著降低。暗示该基因对水稻小穗的发育具有重要作用,可能参与调控花粉发育过程。

Ⅰ型核糖体失活蛋白(RIPs)抗肿瘤作用的研究进展

目的介绍Ⅰ型核糖体失活蛋白抗肿瘤作用的研究概况及展望。方法总结核糖体失活蛋白抗肿瘤作用及机制。结果Ⅰ型核糖体失活蛋白具有明显的抗肿瘤作用。结论Ⅰ型核糖体失活蛋白是很有发展前景的抗肿瘤植物药。

麻疯树核糖体失活蛋白Curcin和Curcin C的RNA N-糖苷酶活性研究

为探究麻疯树核糖体失活蛋白的RNA N-糖苷酶活性,本研究建立了UPLC-MS/MS方法测定麻疯树核糖体失活蛋白Curcin、Curcin C的体外RNA N-糖苷酶脱嘌呤活性.通过单因素实验得到Curcin与RNA32脱嘌呤反应时,反应的最适条件为37℃、pH=4.2、反应时间为4 h.当Curcin C与RNA32脱嘌呤反应时,反应的最适条件为37℃、pH=3.7、反应时间为8 h.Curcin的K_(m)值为8.231μmol/L,Curcin C的K_(m)值为3.302μmol/L,说明Curcin C与底物的亲和力更大.部分金属离子对CurcinC的酶活性具有促进作用,而对Curcin而言均产生了抑制.腺苷浓度达到250μmol/L时,Curcin C酶活性升高,而对于Curcin没有影响.当酶促反应底物为RNA14和RNA32时,Curcin C蛋白的RNA N-糖苷酶活性都显著高于Curcin,表明Curcin C相较于Curcin更具有抗肿瘤药物开发潜力.

茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因CsRIP1和CsRIP2的克隆与表达分析

【目的】克隆茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因CsRIP1和CsRIP2,探讨CsRIPs基因的组织表达特异性以及假眼小绿叶蝉和机械伤害处理对其表达的影响。【方法】Cs-Ev2(Gen Bank登录号:GH618807)为一受假眼小绿叶蝉取食诱导的茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因的c DNA片段,利用RACE技术克隆该基因的全长c DNA,命名为CsRIP1(Gen Bank登录号:FJ648831)。利用RT-PCR技术从茶树子叶中分离出一个新的Ⅱ型核糖体失活蛋白基因的c DNA序列,命名为CsRIP2(Gen Bank登录号:GU951535)。利用PCR技术克隆CsRIPs的基因组序列。设计基因特异性引物,利用Real-time qRT-PCR技术检测CsRIPs的组织表达特异性,以及在叶片中假眼小绿叶蝉和机械伤害处理对其表达的影响。【结果】CsRIP1和CsRIP2的序列一致性为98%,都含有一个1 713 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸残基,但是它们具有不同的3'非翻译区。CsRIP1和CsRIP2由信号肽序列、1个RIP结构域、链接肽和2个RBL结构域组成。CsRIPs与其他Ⅱ型RIPs具有较高的序列一致性,Ⅱ型RIPs保守的氨基酸残基,包括构成A链N-糖苷酶活性位点的氨基酸残基、B链中形成寡糖链结合位点的氨基酸残基、形成链间和链内二硫键的半胱氨酸残基以及RBL结构域中的Qx W基序,均出现在CsRIPs相应的位置上。系统进化树分析结果显示,同一物种的Ⅱ型RIPs首先聚类合并,2个CsRIP与樟的Ⅱ型RIPs聚为一支。比较CsRIPs的c DNA序列和基因组序列,发现它们的基因组序列不含内含子。CsRIPs基因的表达具有组织特异性,CsRIP1在叶片中的表达水平最高,在子叶中的表达水平最低,而CsRIP2在子叶中的表达水平最高,在叶片中的表达水平最低。在叶片中,CsRIP1和CsRIP2的表达均受假眼小绿叶蝉取食的强烈诱导,并且其表达水平随着取食时间的增加而逐渐增加,取食48 h后,它们的表达水平大约分别是对照的120和100倍。在叶片中,CsRIPs基因的表达也受机械伤害处理的诱导,CsRIP1的转录水平在处理后6 h达到最大值,CsRIP2在处理后6 h表达水平显著升高,12 h达到最大值。【结论】克隆茶树的2个Ⅱ型核糖体失活蛋白基因,它们可能参与茶树的防卫反应,且已发生亚功能化。进一步分析这2个基因的启动子,可以加深对CsRIPs基因转录调控以及RIPs的生物学功能的理解。

滨藜(Atriplex patens)核糖体失活蛋白基因的克隆和分析

为开发利用新疆野生植物滨藜,采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR),从滨藜(Atriplexpatens)叶中克隆核糖体失活蛋白(ribosome inactivating proteins,RIPs)基因的完整读码框ORF片段.序列分析表明,该片段大小为843bp,编码1条长280个氨基酸肽链,其中N端的26个氨基酸是信号肽.滨藜核糖体失活蛋白(ApRIP)属Ⅰ型核糖体失活蛋白.同源性比较分析显示,滨藜RIP与藜科植物藜的核糖体失活蛋白,天花粉蛋白(TCS)和美洲商陆蛋白(PAP)基因序列的同源性分别为82%,41%和55%.氨基酸序列比对和SWISS-MODEL同源模建分析表明,滨藜RIP的3′端氨基酸肽链具有与其它RIP相同的活性中心位点"EAARXKXI".

茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因CsRIPI和CsRIP2的克隆与表达

克隆茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因Cs RIPI和Cs RIP2,能够参与茶树的防卫反应,加深对Cs RIPs基因转录调控以及RIPs的生物学功能理解。以凫早2号的幼苗为实验材料,对茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因Cs RIPI和Cs RIP2进行了研究,其在营养钵生长了2 a,分析了Cs RIP基因克隆与序列、Cs RIP因编码产物的系统进化树、Cs RIP基因在不同组织中的表达等,并对Cs RIP基因编码产物的结构域分析和同源性进行了比较。

麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究

从麻疯树种子中分离纯化出一种核糖体失活蛋白 ,用SDS PAGE测定其相对分子量为 2 8 2kD ,IEF PAGE计算其等点电为 8 5 4左右。体外抑制实验表明 ,麻疯树核糖体失活蛋白对兔网织红细胞裂解液的蛋白质生物合成有较强的抑制活性。当麻疯树核糖体失活蛋白作用于大鼠肝核糖体经苯胺处理后 ,在聚丙烯酰胺的尿素变性胶电泳图上能观察到 4 5 0bp左右的特征性核酸条带 ,证明麻疯树核糖体失活蛋白是一种RNAN 糖苷酶 ,从而首次阐明了麻疯树核糖体失活蛋白失活核糖体的分子机制。

苦瓜籽核糖体失活蛋白的基本性质研究

采用 Affi- Gel亲和层析和 Sephacryl S- 10 0分子筛层析等方法获得苦瓜籽核糖体失活蛋白 (RIP) ,经 SDS- PAGE,PAGE,IEF和 PAS方法分析均表明为单一蛋白着色带或单一糖蛋白着色带 .根据 SDS- PAGE测得表观分子量为 30 0 0 0 ,经 IEF- PAGE结果计算其 PI为 9.0 ,对无细胞系统中蛋白质生物合成抑制活性明显 ,其 IC50 为 5.3× 10 -10 mol/ L左右 .体外生物活性试验结果表明其对人肝癌细胞 ,Vero,SP2 / 0 ,3T3,Kb,Navana,S- 180等肿瘤细胞株和麻疹病毒均表现有不同程度的抑制作用 ,而对完整人胚肺二倍体细胞却毒性极小 .

苦瓜籽核糖体失活蛋白对肝癌H_(22)细胞的抑制作用及其机制

目的探讨苦瓜籽核糖体失活蛋白(苦瓜RIP)对肝癌H22细胞的抑制作用及其机制。方法取60只清洁级ICR雄性小鼠建立H22肝癌皮下移植瘤模型,随机分为阴性对照组(Con组,12只)、苦瓜RIP组(36只)及阳性对照组(CTX组,12只)。普通饲料喂养7 d;Con组予生理盐水,RIP组各12只分别予高、中、低剂量苦瓜RIP(分别为100、50、25 mg/kg),CTX组予环磷酰胺(40 mg/kg)腹腔注射,1次/d,连用12 d。观察各组肿瘤生长情况;分离血清,ELISA法检测血清细胞因子IL-6及TNF-α表达水平。结果苦瓜RIP组及CTX组瘤重明显低于Con组(P均<0.01),苦瓜RIP组抑瘤率与剂量呈正相关(P<0.01);苦瓜RIP组及CTX组IL-6及TNF-α表达明显低于Con组(P均<0.01),表达水平与剂量呈负相关(P<0.05)。结论苦瓜RIP对H22细胞有明显的抑制作用;其机制可能为下调IL-6及TNF-α等细胞因子的表达水平。

苦瓜核糖体失活蛋白诱导HL-60细胞发生凋亡及其分子机制的研究

目的 探讨苦瓜核糖体失活蛋白 (Ribosomalinactivatingprotein ,RIP)诱导HL 60细胞凋亡的活性 ,以及对HL 60细胞Bcl 2、Bax、caspase 3表达变化的影响及其分子机制。方法 以一定浓度苦瓜RIP处理HL 60细胞 2 4～ 72h ,用TUNEL法检测细胞凋亡。运用RT PCR和Westernblot免疫印记法检测Bcl 2、Bax、caspase 3mRNA和蛋白表达的变化。结果 苦瓜RIP在一定作用浓度下可使HL 60细胞发生凋亡 ,且随着作用时间的延长凋亡细胞比例逐渐升高。在此过程中 ,HL 60细胞的caspase 3mRNA的表达及其胞内活性亚单位水平显著升高 (P <0 .0 5 ) ,Bcl 2mRNA表达变化虽不显著 ,但其蛋白水平明显降低 (P <0 .0 5 ) ,与此同时 ,BaxmRNA和蛋白表达均有所上调。结论 在苦瓜RIP诱导的HL 60细胞凋亡中 ,caspase 3发挥了极为重要的作用 ,而Bcl 2和Bax可能通过其表达量的变化。

栝楼籽核糖体失活蛋白的纯化、性质及晶体生长研究

栝楼（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓｋｉｒｉｌｏｗｉ）籽经粉碎抽提、硫酸铵沉淀、阳离子交换及凝胶过滤柱层析等步骤，得到一种单链核糖体失活蛋白－Ｔｒｉｃｈｏｋｉｒｉｎ（ＴＣＫ）．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＩＥＦ显示为单一条带，其分子量为２９ｋＤ，ｐＩ≥９．３，含糖量约为１．７５％．该蛋白对兔网织红细胞裂解液系统的蛋白质合成具较强的抑制活性，ＩＣ５０为６．７×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ．改进了纯化方法，提高了产率，并培养出晶体．

转几丁质酶和核糖体失活蛋白双价基因大豆的获得与抗病性鉴定

以东北地区4个主栽大豆品种为试材,通过农杆菌介导法,将2个抗真菌病基因,即几丁质酶基因和核糖体失活蛋白基因构建在同一植物表达载体上,对受体材料进行遗传转化,获得了经Southern检测同时整合双价基因的T0代转基因大豆植株,转化频率为0.5%。将T0代转基因大豆植株扩繁至T2代,并进行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗性检测,4个株系的抗性均比对照有明显提高。分子生物学验证及RT-PCR检测表明,2个外源基因在4个株系中均进行了转录表达。

阴阳离子交换色谱串联分离纯化苦瓜籽核糖体失活蛋白

将阴阳离子交换色谱柱在灌注色谱工作站上串联,使苦瓜籽粗提液中未被阴离子色谱柱吸附的蛋白质直接在阳离子色谱柱上吸附,用盐线性梯度洗脱从阳离子色谱柱上分离出两个具有抗真菌活性的蛋白。两个抗真菌蛋白经鉴定都达到了电泳纯,相对分子质量均为30000左右,N 端氨基酸序列分别为DVSFRLSGADPRSYGMFI与DVNFDLSTATAK,表明所得到的两种蛋白为苦瓜籽中的2个Ⅰ型核糖体失活蛋白α 苦瓜素(α MMC)和β 苦瓜素(β MMC)。抗菌实验表明,α MMC对香蕉枯萎菌和果腐霉菌均具有较强的抑制作用,β MMC对果腐霉菌有较强的抑制作用,而α MMC和β MMC对白绢菌的抑制活性均不明显。采用串联色谱,α MMC和β MMC的质量回收率分别为13 8%和8 0%。

八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及其生化性质

通过盐溶液抽提、硫酸铵分级沉淀、CM 5 2纤维素阳离子交换层析、反相毛细管液相色谱 (re verse phasecapillaryliquidchromatography ,RP CLC)等步骤 ,从八棱丝瓜籽中分离到 2种单链核糖体失活蛋白luffaculin 1和luffaculin 2 .在SDS PAGE和IEF上均显示为单一条带 ,表观分子量均为 2 8kD ,其等电点分别为 8 86 (luffaculin 1)和 9 0 5 (luffaculin 2 ) .实验表明 ,它们具有RNAN 糖苷酶活性 .蛋白质合成抑制活性测试表明 ,它们对蛋白质合成具较强的抑制作用 .体外抑制肿瘤细胞生长活性检测表明 ,luffaculin 1和luffaculin 2对人白血病细胞株K5 6 2有较强的毒性 ,IC50 分别为 1 1×10 -6mol L和 2 0× 10 -7mol L .

望江南中核糖体失活蛋白新基因CassinⅠ的克隆及特征分析

【目的】克隆在植物抗病虫过程中具有重要作用的核糖体失活蛋白新基因,为该类蛋白基因功能研究和有效利用创造条件。【方法】通过分析多种不同来源的植物核糖体失活蛋白的氨基酸序列,据其保守区域设计1对植物通用简并引物P1和P2,对药用植物望江南基因组进行PCR扩增,获得一种新的RIP基因片段。通过RACE法,获得了其全长cDNA序列-CassinⅠ。【结果】CassinⅠ基因全长为882bp,其推导的氨基酸序列与葫芦科两个代表核糖体失活蛋白β-luffin和Trichosanthin(TCS)的相似性分别为58.2%和34.7%,与GenBank中其它核糖体失活蛋白的序列无显著相似性。多重序列比对发现:CassinⅠ有9个氨基酸残基与TCS的N-糖苷酶活性位点的残基完全相同,另外两个残基发生了变化。所有的活性位点都在P1/P2扩增区段内。【结论】首次在望江南中克隆和报道一种新的核糖体失活蛋白基因,为进一步研究该基因的功能、并应用于作物转基因抗病虫害育种研究奠定了基础。

苦瓜核糖体失活蛋白生物活性与功能研究进展

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs)是一类能够脱去真核细胞28S r RNA内SRL区域的A4342,从而破坏延伸因子与核糖体的结合,将蛋白质的生物合成抑制在延伸阶段的蛋白质家族。RIPs有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型,苦瓜中已发现的α-苦瓜素、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、δ-苦瓜素、ε-苦瓜素、MAP30等,均属于Ⅰ型RIPs。这些RIPs具有抗病毒、抗菌、抗虫害、抑制肿瘤细胞生长等生物学活性,受到了人们的广泛关注。本文从RIPs的分类、生物学活性、功能与应用等方面,对苦瓜中的RIPs进行了综述。

核糖体失活蛋白体内外抗病毒的实验研究

核糖体失活蛋白是一类广泛存在于高等植物细胞内的能抑制核糖体功能的植物蛋白。建立了从苦瓜籽中提纯核糖体失活蛋白的方法,蛋白质电泳结果显示提取液中含有一定量的核糖体失活蛋白。在鸡胚成纤维细胞和鸡胚上进行核糖体灭活蛋白体内外抗马立克病病毒、新城疫病毒和鸡痘病毒试验,结果均表明核糖体灭活蛋白对3种病毒有一定的抑制作用。

单链核糖体失活蛋白的核糖核酸酶活性

以芹菜４．５ＳＲＮＡ为底物，在ｐＨ５．０的条件下，５种纯核糖体失活蛋白：天花粉蛋白、苦瓜子蛋白、肥皂草蛋白、丝瓜素毒蛋白和多花白树毒蛋白均显示出核糖核酸酶活性，放射自显影图显示出它们对ＲＮＡ分子中的各种碱基具有不同的敏感性．

丝瓜核糖体失活蛋白的分离与纯化

采用一种改进的方法，简便快速地从丝瓜（Ｌｕｆｆａｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）籽中得到丝瓜蛋白α和β．它们在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上均呈一区带，其分子量分别为２８０００和２９０００．等电聚焦测定等电点均为１０．它们对无细胞体系蛋白质合成都有强烈的抑制活性，其ＩＤ＿（５０）分别为１０μｇ／Ｌ和５０μｇ／Ｌ，是目前发现的单链核糖体失活蛋白中活性最高的．

苦瓜核糖体失活蛋白的研究

综述了苦瓜核糖体失活蛋白的分离纯化、理化性质、作用机理和方式，并对该蛋白的应用前景作了展望。