水稻核糖体失活蛋白家族基因OsRIP8的生物信息学与功能分析

核糖体失活蛋白(RIPs)是一种能使真核细胞核糖体功能被抑制的毒蛋白。OsRIP8是属于该家族的一个功能未知基因。为研究该基因生物学功能,通过数据库对其进行生物信息学分析,利用qRT-PCR验证其表达模式,同时构建OsRIP8-RNAi干涉载体并利用农杆菌转化水稻,采用PCR技术鉴定出转基因阳性植株,分析阳性植株的表达和农艺性状,初步揭示该基因的功能。结果表明,水稻OsRIP8蛋白为不稳定亲水蛋白,不含信号肽及完整的跨膜结构域,蛋白结构以α螺旋为主;在OsRIP8基因启动子区域存在着与植物生长发育、生物与非生物胁迫以及植物激素响应有关的元件;OsRIP8基因的共表达基因富集到多种大分子的生物合成与蛋白代谢等途径;qRT-PCR分析结果表明,OsRIP8基因在发育的小穗及抽穗前1 d的花药中优先表达;RNAi干涉后OsRIP8基因的表达下调造成植株花粉育性和结实率显著降低。暗示该基因对水稻小穗的发育具有重要作用,可能参与调控花粉发育过程。

茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因CsRIP1和CsRIP2的克隆与表达分析

【目的】克隆茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因CsRIP1和CsRIP2,探讨CsRIPs基因的组织表达特异性以及假眼小绿叶蝉和机械伤害处理对其表达的影响。【方法】Cs-Ev2(Gen Bank登录号:GH618807)为一受假眼小绿叶蝉取食诱导的茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因的c DNA片段,利用RACE技术克隆该基因的全长c DNA,命名为CsRIP1(Gen Bank登录号:FJ648831)。利用RT-PCR技术从茶树子叶中分离出一个新的Ⅱ型核糖体失活蛋白基因的c DNA序列,命名为CsRIP2(Gen Bank登录号:GU951535)。利用PCR技术克隆CsRIPs的基因组序列。设计基因特异性引物,利用Real-time qRT-PCR技术检测CsRIPs的组织表达特异性,以及在叶片中假眼小绿叶蝉和机械伤害处理对其表达的影响。【结果】CsRIP1和CsRIP2的序列一致性为98%,都含有一个1 713 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸残基,但是它们具有不同的3'非翻译区。CsRIP1和CsRIP2由信号肽序列、1个RIP结构域、链接肽和2个RBL结构域组成。CsRIPs与其他Ⅱ型RIPs具有较高的序列一致性,Ⅱ型RIPs保守的氨基酸残基,包括构成A链N-糖苷酶活性位点的氨基酸残基、B链中形成寡糖链结合位点的氨基酸残基、形成链间和链内二硫键的半胱氨酸残基以及RBL结构域中的Qx W基序,均出现在CsRIPs相应的位置上。系统进化树分析结果显示,同一物种的Ⅱ型RIPs首先聚类合并,2个CsRIP与樟的Ⅱ型RIPs聚为一支。比较CsRIPs的c DNA序列和基因组序列,发现它们的基因组序列不含内含子。CsRIPs基因的表达具有组织特异性,CsRIP1在叶片中的表达水平最高,在子叶中的表达水平最低,而CsRIP2在子叶中的表达水平最高,在叶片中的表达水平最低。在叶片中,CsRIP1和CsRIP2的表达均受假眼小绿叶蝉取食的强烈诱导,并且其表达水平随着取食时间的增加而逐渐增加,取食48 h后,它们的表达水平大约分别是对照的120和100倍。在叶片中,CsRIPs基因的表达也受机械伤害处理的诱导,CsRIP1的转录水平在处理后6 h达到最大值,CsRIP2在处理后6 h表达水平显著升高,12 h达到最大值。【结论】克隆茶树的2个Ⅱ型核糖体失活蛋白基因,它们可能参与茶树的防卫反应,且已发生亚功能化。进一步分析这2个基因的启动子,可以加深对CsRIPs基因转录调控以及RIPs的生物学功能的理解。

滨藜(Atriplex patens)核糖体失活蛋白基因的克隆和分析

为开发利用新疆野生植物滨藜,采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR),从滨藜(Atriplexpatens)叶中克隆核糖体失活蛋白(ribosome inactivating proteins,RIPs)基因的完整读码框ORF片段.序列分析表明,该片段大小为843bp,编码1条长280个氨基酸肽链,其中N端的26个氨基酸是信号肽.滨藜核糖体失活蛋白(ApRIP)属Ⅰ型核糖体失活蛋白.同源性比较分析显示,滨藜RIP与藜科植物藜的核糖体失活蛋白,天花粉蛋白(TCS)和美洲商陆蛋白(PAP)基因序列的同源性分别为82%,41%和55%.氨基酸序列比对和SWISS-MODEL同源模建分析表明,滨藜RIP的3′端氨基酸肽链具有与其它RIP相同的活性中心位点"EAARXKXI".

茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因CsRIPI和CsRIP2的克隆与表达

克隆茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因Cs RIPI和Cs RIP2,能够参与茶树的防卫反应,加深对Cs RIPs基因转录调控以及RIPs的生物学功能理解。以凫早2号的幼苗为实验材料,对茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因Cs RIPI和Cs RIP2进行了研究,其在营养钵生长了2 a,分析了Cs RIP基因克隆与序列、Cs RIP因编码产物的系统进化树、Cs RIP基因在不同组织中的表达等,并对Cs RIP基因编码产物的结构域分析和同源性进行了比较。

转几丁质酶和核糖体失活蛋白双价基因大豆的获得与抗病性鉴定

以东北地区4个主栽大豆品种为试材,通过农杆菌介导法,将2个抗真菌病基因,即几丁质酶基因和核糖体失活蛋白基因构建在同一植物表达载体上,对受体材料进行遗传转化,获得了经Southern检测同时整合双价基因的T0代转基因大豆植株,转化频率为0.5%。将T0代转基因大豆植株扩繁至T2代,并进行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗性检测,4个株系的抗性均比对照有明显提高。分子生物学验证及RT-PCR检测表明,2个外源基因在4个株系中均进行了转录表达。

望江南中核糖体失活蛋白新基因CassinⅠ的克隆及特征分析

【目的】克隆在植物抗病虫过程中具有重要作用的核糖体失活蛋白新基因,为该类蛋白基因功能研究和有效利用创造条件。【方法】通过分析多种不同来源的植物核糖体失活蛋白的氨基酸序列,据其保守区域设计1对植物通用简并引物P1和P2,对药用植物望江南基因组进行PCR扩增,获得一种新的RIP基因片段。通过RACE法,获得了其全长cDNA序列-CassinⅠ。【结果】CassinⅠ基因全长为882bp,其推导的氨基酸序列与葫芦科两个代表核糖体失活蛋白β-luffin和Trichosanthin(TCS)的相似性分别为58.2%和34.7%,与GenBank中其它核糖体失活蛋白的序列无显著相似性。多重序列比对发现:CassinⅠ有9个氨基酸残基与TCS的N-糖苷酶活性位点的残基完全相同,另外两个残基发生了变化。所有的活性位点都在P1/P2扩增区段内。【结论】首次在望江南中克隆和报道一种新的核糖体失活蛋白基因,为进一步研究该基因的功能、并应用于作物转基因抗病虫害育种研究奠定了基础。

麻疯树核糖体失活蛋白Curcin和Curcin C的RNA N-糖苷酶活性研究

为探究麻疯树核糖体失活蛋白的RNA N-糖苷酶活性,本研究建立了UPLC-MS/MS方法测定麻疯树核糖体失活蛋白Curcin、Curcin C的体外RNA N-糖苷酶脱嘌呤活性.通过单因素实验得到Curcin与RNA32脱嘌呤反应时,反应的最适条件为37℃、pH=4.2、反应时间为4 h.当Curcin C与RNA32脱嘌呤反应时,反应的最适条件为37℃、pH=3.7、反应时间为8 h.Curcin的K_(m)值为8.231μmol/L,Curcin C的K_(m)值为3.302μmol/L,说明Curcin C与底物的亲和力更大.部分金属离子对CurcinC的酶活性具有促进作用,而对Curcin而言均产生了抑制.腺苷浓度达到250μmol/L时,Curcin C酶活性升高,而对于Curcin没有影响.当酶促反应底物为RNA14和RNA32时,Curcin C蛋白的RNA N-糖苷酶活性都显著高于Curcin,表明Curcin C相较于Curcin更具有抗肿瘤药物开发潜力.

抗病虫基因新资源:绞股蓝核糖体失活蛋白基因

核糖体失活蛋白 (ribosome inactivatingprotein ,RIP)具有广谱的抗植物病毒活性和抵抗多种植物病原真菌以及农业害虫的活性 ,在植物保护上具有广阔的应用前景。从传统中草药绞股蓝中分离的 13个核糖体失活蛋白基因序列 ,基因序列登录代码为 :AY0 75 115 ,AY1346 16 - 7,AY2 7910 4 - 7,AY2 792 18- 2 0 ,AY16 0 76 7- 9,为培育抗病虫作物新品种提供了新资源。

繁缕核糖体失活蛋白基因克隆及序列分析

采用同源克隆结合RACE法,克隆了繁缕核糖体失活蛋白的全长cDNA,命名为q3(GenBank accession GQ870262)。序列分析结果表明,q3的开放阅读框(ORF)长780 bp,编码259个氨基酸。序列G+C含量为41.5%,与大部分Ⅰ型RIP基因相近。q3编码的蛋白质命名为Q3,理论分子量为28.16 kD,pI为9.44,均与Ⅰ型核糖体失活蛋白相近;包含由23个氨基酸组成的信号肽。功能结构域分析发现,该蛋白含有3个蛋白激酶磷酸化位点、4个络氨酸蛋白激酶磷酸化位点和7个N-肉豆蔻酰化位点。三级结构预测发现,有35.52%的氨基酸残基参与了α螺旋,24.32%的氨基酸残基组成延伸链,40.15%的氨基酸残基随机缠绕其中。基于繁缕及其近缘种核糖体失活蛋白的氨基酸序列构建的系统发育树显示,其结构与经典分类结果基本一致。

化学与酶促相结合合成并克隆核糖体失活蛋白Gelonin基因

利用已知 Gelonin的氨基酸序列 ,逆向推算出整个基因的碱基序列 ,根据 E.coli的密码子偏爱性和后续基因克隆的需要 ,通过沉默突变设计相应的酶切位点和碱基序列 ,将整个基因分为四段 ,每个片段约1 75～ 2 2 0 bp,每一个片段中的互补链从 5′末端用化学合成 1 0 0～ 1 2 0的碱基单链 ,其中两个链的 3′末端有 2 0个互补碱基 .利用 T4 DNA聚合酶酶促添补成双链 DNA,用分子克隆技术 ,分别构建重组子 ,然后再构建成含整个 Gelonin基因的表达载体 p ET-gel进行表达 ,经诱导后 ,获得了一个 2 80 0 0的重组蛋白 。

不同基因型苦瓜种子发育过程中核糖体失活蛋白的累积变化

【目的】研究不同基因型苦瓜核糖体失活蛋白(RIPs)在种子发育过程中的累积规律,为苦瓜RIPs的进一步利用提供理论依据。【方法】选取3个不同组群苦瓜品种为材料,对不同发育时期种子的盐溶性蛋白提取物进行SDS-PAGE分析。【结果】3个苦瓜品种种子的盐溶性蛋白组分存在明显差异,其中以分子量为20.0～29.0kDa的蛋白质差异最为明显;29.0kDa分子量的蛋白质在长大果型材料MC1及密瘤小果型材料MC11中的表达量比野生型材料MC18略高。3个苦瓜材料的29.0kDa蛋白质在种子不同发育时期的表达量无明显差异,然而,在不同栽培季节其表达量差异显著。【结论】不同类型苦瓜材料种子中的RIPs含量变化在种子发育不同时期没有明显差异,而成熟种子具有产量高、易采收和贮藏等优点,是作为RIPs生产原材料采收的适宜时期;由于不同类型苦瓜的种子产量潜力有较大差异,因此,选择RIPs含量高且种子产量高的材料作为RIPs生产的品种较为适宜。

6个植物核糖体失活蛋白新基因片段的克隆及特征分析

通过分析多种不同来源的植物RIPs的氨基酸序列,据其保守区域设计1对植物通用简并引物P1、P2,对基因组进行PCR扩增,分别从海芋Araceae macrorrhiza、烟草Nicotiana tobaccum、剑麻Agavaccae aga-ve、望江南Cassia occidentalis、那坡指天蕉Musaspp.(BB)、邻水野蕉Musaspp.(AA)中获得1个基因片段。BLAST分析表明:它们推导的氨基酸序列只与多种不同来源的RIPs有相似性。其中,与葫芦科2个代表RIP相应区段的相似性最高,与-βluffin基因的相似性分别为97.2%、98.5%、97.9%、89.4%、97.9%、97.2%,与天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的相似性分别为63.6%、64.5%、64.1%、60.8%、64.8%、和63.6%。多重序列比对发现:6个序列中分别有10、9、11、11、9、10个残基氨基酸与TCS的N-糖苷酶活性位点的残基完全相同,只是残基位置不一致,仅有个别残基发生了变化。所有的N-糖苷酶活性位点都在P1/P2扩增区段内。

三角梅核糖体失活蛋白在转基因番茄中的功能

根据已报道的三角梅(Bougainvillea spectabilis Willd)的核糖体失活蛋白(RIP)基因序列,以厦门本地艳紫三角梅(B. glabra Choisy cv. Sanderiana)为材料,通过RT-PCR技术扩增到其RIP成熟蛋白的基因序列BouM并成功转化番茄.经检测,BouM转基因番茄对蚜虫、蚂蚁及番茄灰霉菌都有很好的抗性作用,显示了其在植物抗病抗虫中的应用前景.但是同时转基因番茄对小白鼠的生长有一定的抑制作用,因此将其作为植物抗病虫基因利用时,其生物安全性也是一个值得重视的问题.

绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的5个cDNA及其下游非编码区

通过3'RACE克隆策略获得绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)核糖体失活蛋白(ribosome-inac-tivating protein,RIP)Gynostemmin的5个cDNA序列gynostemminⅠ￣Ⅴ及其下游非编码区(3'untranslatedregion,3'UTR)。它们的编码区长度除gynostemminⅡ为825bp外,其余均为831bp。其下游非编码区的长度分别为279、174、170、161和171bp。在3'UTR中,gynostemminⅠ比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件,其mRNA的稳定性可能因此受到影响。

丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin-a原核表达载体的构建

目的探讨丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin-a原核表达载体的构建方法。方法从Pubmed中查到Luffin-a的mRNA全序列,用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜种子中克隆Luffin-a基因,T-A克隆后鉴定核苷酸序列,构建原核表达载体pET-15b(+)-Luffin-a,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达;SDS-PAGE鉴定Luffin-a表达产物。结果克隆出Luffin-a基因,IPTG诱导后大肠杆菌培养液和超声破碎的菌体沉淀中都有Luffin-a表达产物。结论本研究成功构建了Luffin-a原核表达载体。

转望江南核糖体失活蛋白基因cassin烟草及其对烟草花叶病毒的抗性

通过构建植物表达载体,由农杆菌介导,将望江南核糖体失活蛋白基因cassuin转入烟草。PCR和Southern blot杂交结果证明:外源基因已经以单拷贝整合到烟草基因组内,并且在后代发生遗传分离。RT-PCR和Northern blot杂交结果显示:外源基因可以正常转录。用不同浓度的TMV机械摩擦接种转基因T_1、T_2代各3个自交株系,以非转基因烟草为阴性对照,实验结果表明转基因烟草对TMV表现出不同程度的抗性。

Ⅰ型核糖体失活蛋白(RIPs)抗肿瘤作用的研究进展

目的介绍Ⅰ型核糖体失活蛋白抗肿瘤作用的研究概况及展望。方法总结核糖体失活蛋白抗肿瘤作用及机制。结果Ⅰ型核糖体失活蛋白具有明显的抗肿瘤作用。结论Ⅰ型核糖体失活蛋白是很有发展前景的抗肿瘤植物药。

核糖体失活蛋白及其抗病毒转基因研究

综述了几种常见核糖体失活蛋白在植物抗病毒基因工程中的研究,并对核糖体失活蛋白的发展前景进行了展望。

丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a基因的克隆和表达

目的:从丝瓜籽中克隆HIV整合酶抑制剂luffin-a基因,并构建其表达载体。方法:根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因,T-A克隆后鉴定核苷酸序列。构建表达载体pET-44a(+)-luffin-a,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达。用透析法对包含体复性;SDS-PAGE鉴定luffin-a表达产物,用MTT法分析其生物学活性。结果:克隆的luffin-a基因与国外报道的核苷酸序列同源性为99.73%,其所编码的氨基酸序列完全一致。经SDS-PAGE分析:luffin-a主要存在于包含体中。MTT法测定:复性后蛋白具有与蓖麻毒素A链相似的细胞毒性。结论:本研究成功地构建了luffin-a的表达系统,所表达蛋白经复性后具有生物学活性。

被子植物中核糖体失活蛋白基因家族分子进化研究

利用34种具有全基因组数据的代表植物,通过生物信息分析方法,深入挖掘和分析不同植物类群基因组中RIPs基因家族的成员构成,推测其可能的扩增方式和功能分化,并探讨了该基因家族在植物中的总体进化趋势.采用BLAST和HMMsearch两种检索方法共鉴定出79个RIPs基因家族成员;通过序列比对和系统进化树的构建,发现RIPs在单双子叶中存在双起源,RIPs在两者分化之前就已存在.它们可能为适应复杂的环境而出现在早期陆生植物中,随后在长期进化过程中不断发生谱系的扩张和拷贝丢失,最后通过功能分化在不同植物中保留下来,其在被子植物进化的过程中有物种特异性的重复.