构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chain fragment variant,scFv)文库,为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠,分离其脾细胞;Trizol法抽提总RNA,反转录成cDNA,PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv文库...构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chain fragment variant,scFv)文库,为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠,分离其脾细胞;Trizol法抽提总RNA,反转录成cDNA,PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv文库。再通过PCR和重叠延伸PCR在scFv文库序列5'端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,3'端添加间隔区序列(T20-V109)、茎环结构构建核糖体展示抗克伦特罗scFv文库。核糖体展示scFv文库与Easy T3载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑取5个阳性克隆双酶切和测序鉴定。结果表明:用于建库材料的免疫小鼠效价为1:128000;成功扩增重链可变区基因大约为360bp和轻链可变区基因大约为330pb;核糖体展示scFv文库基因大约1200bp;库容量达1.75×1013;阳性重组质粒均含有1200bp插入片段;利用IMGT/V-QUEST数据库对单链抗体可变区进行序列分析结果表明,重链可变区和轻链可变区基因均由胚系基因重排得到,且与鼠源胚系基因同源率都达84%以上;氨基酸序列比对结果表明,重链可变区氨基酸序列同源率为37.82%,轻链可变区氨基酸序列同源率为39.09%。其中多样性主要发生在VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。成功构建了大容量抗克伦特罗单链抗体核糖体展示文库。展开更多
目的构建库容量大、多样性好的卵巢癌人源性核糖体展示抗体库。方法从10名卵巢癌患者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增人全套重链可变区基因(variable region of heavychain,V_H)和轻链可变区基因(variable...目的构建库容量大、多样性好的卵巢癌人源性核糖体展示抗体库。方法从10名卵巢癌患者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增人全套重链可变区基因(variable region of heavychain,V_H)和轻链可变区基因(variable region of light chain,V_L),用重叠PCR技术对它们进行拼接,构建卵巢癌人源单链抗体库,并连接T载体转化大肠杆菌,经蓝白筛选,挑选阳性克隆,测序鉴定。结果成功构建卵巢癌人源单链抗体库,库容6.5×10^(13),经测序验证多样性良好。结论成功构建的卵巢癌人源单链抗体库可用于进一步筛选目标抗原,为开发治疗性人源抗体奠定了实验基础。展开更多
文摘构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chain fragment variant,scFv)文库,为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠,分离其脾细胞;Trizol法抽提总RNA,反转录成cDNA,PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv文库。再通过PCR和重叠延伸PCR在scFv文库序列5'端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,3'端添加间隔区序列(T20-V109)、茎环结构构建核糖体展示抗克伦特罗scFv文库。核糖体展示scFv文库与Easy T3载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑取5个阳性克隆双酶切和测序鉴定。结果表明:用于建库材料的免疫小鼠效价为1:128000;成功扩增重链可变区基因大约为360bp和轻链可变区基因大约为330pb;核糖体展示scFv文库基因大约1200bp;库容量达1.75×1013;阳性重组质粒均含有1200bp插入片段;利用IMGT/V-QUEST数据库对单链抗体可变区进行序列分析结果表明,重链可变区和轻链可变区基因均由胚系基因重排得到,且与鼠源胚系基因同源率都达84%以上;氨基酸序列比对结果表明,重链可变区氨基酸序列同源率为37.82%,轻链可变区氨基酸序列同源率为39.09%。其中多样性主要发生在VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。成功构建了大容量抗克伦特罗单链抗体核糖体展示文库。
文摘目的构建库容量大、多样性好的卵巢癌人源性核糖体展示抗体库。方法从10名卵巢癌患者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增人全套重链可变区基因(variable region of heavychain,V_H)和轻链可变区基因(variable region of light chain,V_L),用重叠PCR技术对它们进行拼接,构建卵巢癌人源单链抗体库,并连接T载体转化大肠杆菌,经蓝白筛选,挑选阳性克隆,测序鉴定。结果成功构建卵巢癌人源单链抗体库,库容6.5×10^(13),经测序验证多样性良好。结论成功构建的卵巢癌人源单链抗体库可用于进一步筛选目标抗原,为开发治疗性人源抗体奠定了实验基础。