人工构建含丙型肝炎病毒核糖体插入位点的双顺反子表达载体

目的:研究丙型肝炎病毒核糖体插入位点启动翻译蛋白质功能,构建双顺反子真核表达载体.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎基因组中核糖体插入位点序列(IRES),定向克隆到pcDNA3-S质粒多克隆酶切位点中。在IRES下游克隆乙型肝炎病毒核心基因,测序鉴定后获得的质粒经脂质体转染hepG2细胞,间接免疫荧光染色和Western-blot检测.结果:在间接免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见已型肝炎病毒S基因和核心基因表达。转染细胞破碎后免疫沉淀检测和图像分析表明,两种基因有相似的表达量。结论:人为截断HCV 5’NTR区17个碱基,并不影响IRES对下游基因蛋白质翻译,为成功构建了含丙型肝炎病毒IRES的双顺反子表达载体打下基础。

pIRES-p16ink4a-hRb1载体的构建及其对骨肉瘤细胞周期的调控

目的应用内部核糖体插入位点(IRES)序列构建单启动子双顺反子穿梭载体pIRES-p16ink4a-hRb1并鉴定,观察其导入骨肉瘤细胞后对细胞周期的调控。方法利用基因工程技术,将p16ink4a与hRb1全长cDNA编码区依次亚克隆至pIRES载体中,质粒构建通过PCR、双酶切与测序鉴定;脂质体转染至p16ink4a表达缺失、hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MG63,G418筛选获得抗性克隆,通过RT-PCR和Western blot法分析外源基因表达;流式细胞术分析细胞周期特异性和细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果成功构建出pIRES-p16ink4a-hRb1载体,外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。与对照组比较,双基因导入组细胞生长抑制率显著上升,细胞周期显著阻滞在G1期,且细胞凋亡率极显著升高。结论pIRES-p16ink4a-hRb1双顺反子穿梭载体的构建与真核细胞导入、目的基因表达成功,为进一步研究p16ink4a与hRb1相互关系在细胞周期调控中的作用奠定了基础。

丙型肝炎病毒研究的新进展

目前病毒性肝炎在我国流行相当广泛,据卫生部资料获悉,6种型别的病毒性肝炎中,甲、戊型肝炎每年发病数占全国病毒性肝炎报告发病数的50%;乙型肝炎病毒携带率为9.75%,其中约1.2万人长期携带乙型肝炎病毒。每年死于乙型肝炎相关的肝病人数约28万例。病毒性肝炎至今发病率居全国传染病之首,严重危害人民健康。本专辑选译自《最新医学》2004年第59卷第9期“ウイルスと肝炎”专辑,详细阐述病毒性肝炎的研究状况及最新进展,内容翔实、有较高的参考价值,本专辑由哈尔滨医科大学姚桢教授主译。

丙型肝炎病毒IRES基因T载体克隆及序列分析

目的构建含丙型肝炎病毒(HCV)核糖体插入位点(IRES)序列的基因克隆,为以后的亚克隆和抑制肝炎病毒作用的研究提供实验材料。方法以含HCV全长基因的质粒为模板,用PCR技术扩增出HCV的IRES序列,将扩增产物IRES基因插入到PMD18T载体后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析。结果经PCR获得355bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段与GeneBank中该基因的序列同源性为99%。结论该实验成功构建了含HCV IRES基因序列的T载体克隆,提示该克隆是用作亚克隆和抑制肝炎病毒研究的理想克隆。