核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的调控

目的:探讨核糖体S6激酶(p90RSK)调节肝星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原表达的作用.方法:将设计的p90RSK特异性siRNA克隆至真核表达载体pAV-U6+27中,构建p90RSK的RNA干扰真核表达载体pAV-RSKi.将构建的pAV-RSKi通过脂质体瞬时转染HSC-T6,分别采用实时定量聚合酶链式反应和Western Blot方法检测细胞的p90RSK和Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达.将p90RSK的真核表达质粒(pMT2-RSK1)和pAV-RSKi分别与Ⅰ型胶原启动子荧光素酶报告基因质粒(pGL3-COL1A1)共转染原代HSC,48h后检测细胞的荧光素酶活性.结果:构建的pAV-RSKi能够有效抑制HSC-T6中p90RSK mRNA和蛋白表达,与对照组相比较分别减少了(70.20±4.04)%和(89.10±5.26)%(P<0.01).HSC-T6中Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白的表达,与对照组相比较分别减少(61.80±3.96)%和(98.50±7.01)%(P<0.01).各组转染pMT2-RSK1,pAV-RSKi和空载质粒的HSC中,Ⅰ型胶原启动子活性之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论:p90RSK参与了HSC中胶原的表达调控,可能成为肝纤维治疗的新靶点.

Vk3对宫颈癌Hela细胞mTOR信号转导蛋白基因表达的影响

目的:观察维生素K3(Vk3)对Hela细胞雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其底物p70S6激酶(p70S6K)α1、α2、β1、β2和细胞周期素D1(cyclinD1)mRNA表达的变化及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对mTOR及其底物的影响,探讨mTOR信号转导蛋白在人宫颈癌的发生、发展过程中的作用。方法:实验分为对照组(Con)、Vk3处理组(Vk3)、Vk3与NAC联合作用(Vk3+NAC)组及NAC单独应用组(NAC),MTT法检测各组Hela细胞存活率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组Hela细胞中mTOR、p70S6K-α1、p70S6K-α2、p70S6K-β1、p70S6K-β2及cyclinD1mRNA表达。结果:与Con组比较,Vk3组Hela细胞存活率显著降低(P<0.01),mTOR、p70S6K-α1、p70S6K-α2、p70S6K-β1、p70S6K-β2及cyclin D1 mRNA表达量均明显下降(P<0.05);而与Vk3组比较,Vk3+NAC组Hela细胞存活率显著增加(P<0.01),上述指标mRNA表达量均明显增加(P<0.05)。结论:Vk3通过其氧化应激作用抑制Hela细胞的增殖,其机制与降低mTOR信号转导蛋白及cyclinD1的基因表达有关。

核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响

目的 探讨核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对db/db小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响及机制.方法 采用随机数字表法将24只9周龄健康雄性db/db小鼠（体质量44.5～48.2 g）随机分至对照组（n1=12）和实验组（n=12）,实验组小鼠尾静脉注射核糖体蛋白S6激酶1短发夹RNA重组基因腺病毒,对照组尾静脉注射含U6启动子空载体腺病毒.注射病毒后第6天,对照组和实验组采用随机数字表进一步分为进食组（n=6）及空腹组（n=6）.在进食和空腹状态处死小鼠,提取肝脏,应用Western blot法观测胰岛素受体底物-1和胰岛素受体底物-2蛋白表达水平.提取肝脏总RNA,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测糖异生基因mRNA表达水平.经尾静脉取血,采用酶联免疫吸附法测定胰岛素水平,采用比色法检测游离脂肪酸、甘油三酯、总胆固醇水平.组间比较采用单因素方差分析.结果 与对照组相比,进食及空腹状态时,实验组胰岛素受体底物-1、胰岛素受体底物-2蛋白表达均增加.在空腹状态下,实验组与对照组相比,糖异生基因过氧化酶体增殖物受体共激活因子1α（分别为0.072±0.024和0.028±0.012）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（分别为23.8±4.0和12.3±2.4）、葡萄糖6磷酸酶（分别为3.0±0.8和1.5±0.4）mRNA表达均下降（F值分别为7.58、5.76、9.15,均P＜0.01）.对照组和实验组胰岛素水平无显著差异（t=1.26,P＞0.05）.空腹及进食状态下,实验组胆固醇水平低于对照组（F=15.48,P＜0.01）.与空腹对照组相比,空腹实验组游离脂肪酸降低（t=2.56,P＜0.05）.结论 db/db小鼠肝脏核糖体蛋白S6激酶1基因沉默后,空腹糖异生和血清游离脂肪酸水平下降,胰岛素受体底物-1和胰岛素受体底物-2蛋白表达增加,提示营养过剩条件下核糖体蛋白S6激酶1可能在肝脏胰岛素抵抗中发挥重要作用.

mTOR/P70S6K信号通路在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨m TOR/P70S6K信号通路在宫颈癌组织中的表达水平及其相关临床诊断、治疗意义。方法收集2012年1月—2014年1月手术切除或进行活检的正常宫颈组织65例,宫颈癌组织、癌旁组织各85例,提取组织中的mRNA,应用RT-PCR的方法来检测3种组织中m TOR和P70S6K mRNA的表达水平,并进行分析。结果宫颈癌组织中m TOR、P70S6K mRNA的表达明显高于癌旁组织及正常组织(P<0.05),m TOR、P70S6K mRNA水平在宫颈癌组织、癌旁组织及正常组织中均呈正相关(P<0.05)。结论 m TOR信号通路在宫颈癌组织中处于活化状态,其在宫颈癌的发生发展以及向其他部位转移中具有重要作用,是一个诊断和治疗的分子靶点。

RSK4在甲状腺乳头状癌组织中的表达及与临床病理因素的关系

目的探讨核糖体蛋白激酶A6(RSK4)在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达及其与临床病理因素的关系。方法 收集200例PTC(A组)和对应的癌旁组织(B组),40例甲状腺良性结节(C组)及其结节旁组织(D组)新鲜标本,提取相应RNA,并逆转录成cDNA,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RSK4的表达量,并分析其与PTC患者临床病理因素的关系。结果 A组中RSK4表达量显著低于B组( Z =-9.658, P <0.01)和C组( Z =-5.648, P <0.01),但C组RSK4表达量与D组比较差异无显著性( P >0.05)。肿瘤直径>1 cm的PTC组织中RSK4表达量显著低于≤1 cm组( Z =-3.528, P <0.01),有包膜侵犯的PTC组织中RSK4表达量显著低于无包膜侵犯组( Z =-2.822, P <0.01)。结论 RSK4在PTC组织中低表达,且与肿瘤大小、包膜侵犯相关,可能成为PTC诊断和预后评估的潜在生物标志物。

蟾蜍令灵对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤中P70S6K表达的影响

背景食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,近年研究发现,核糖体蛋白S6激酶(P70S6K)与其发生密切相关。笔者前期的研究表明,蟾蜍令灵(Bufalin)有明显的抗肿瘤作用。目的探讨Bufalin对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤中P70S6K表达的影响。方法 Nu/Nu健康裸鼠36只,雌雄各半,采用随机数字表法分为4组,每组9只,即对照组(0.9%氯化钠溶液)、Bufalin低剂量(0.5 mg/kg,BL)组、Bufalin中剂量(1.0 mg/kg,BM)组、Bufalin高剂量(1.5 mg/kg,BH)组。观察经Bufalin治疗后裸鼠肿瘤生长情况;反转录PCR(RT-PCR)法检测裸鼠原位移植瘤中P70S6K mRNA的表达,Western blotting及免疫组化法检测裸鼠原位移植瘤中P70S6K和p-P70S6K相对表达量。结果 4组治疗前及治疗后第1天裸鼠体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4组治疗前肿瘤体积比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后第15天肿瘤体积比较,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后第15天,BM组、BH组肿瘤体积均低于BL组和对照组(P<0.05)。3组肿瘤抑制率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。4组P70S6K mRNA及P70S6K相对表达量比较,差异无统计学意义(F=0.634、0.119,P>0.05)。4组p-P70S6K相对表达量比较,差异有统计学意义(F=233.005,P<0.05)。结论 Bufalin对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤具有抑制作用;Bufalin可以下调P70S6K的磷酸化水平,而P70S6K则不受影响,提示Bufalin可能通过抑制P70S6K活化而发挥作用。

1,25(OH)_2D_3对人肾小球系膜细胞增殖及mTOR/p70s6K表达的影响

目的：探讨1,25-二羟基维生素D3[1,25（OH）2D3]对人肾小球系膜细胞增殖的影响及其在肾小球系膜细胞调控中对mTOR/p70s6K信号通路的作用。方法体外培养人肾小球系膜细胞，取传代培养至3～7代细胞分为4组：正常对照组（加含5%胎牛血清DMEM培养基），VD组[加1,25（OH）2D310-8 mol/L]，R组（加雷帕霉素5 mg/L），R＋VD组[加雷帕霉素5 mg/L及1,25（OH）2D310-8 mol/L]，干预48 h。采用细胞增殖与活性检测试剂盒CCK-8检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期时相分布，免疫荧光法检测细胞中mTOR、p70s6K的表达情况。结果正常对照组、VD组、R组、R＋VD组：（1）吸光度值（A450）依次降低，组间多重比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；抑制率（IR）依次升高。（2）G1期细胞比例依次增加，S期、G2/M期依次减少，增殖指数（PI）依次降低，除R组与VD组比较差异无统计学意义外，其余组间多重比较差异均有统计学意义。（3）系膜细胞中mTOR、p70s6K蛋白表达强度均依次降低，除R组与VD组比较差异无统计学意义外，其余组间多重比较差异均有统计学意义。结论1,25（OH）2D3可显著抑制人系膜细胞增殖，且其可能通过抑制mTOR/p70s6K信号通路调控肾小球系膜细胞增殖。

PI3K/Akt/mTOR/p70^(S6K)信号通路在肝纤维化发生发展中的作用

PI3K/Akt/m TOR/p70S6K是细胞生命活动的重要信号通路,在促进细胞生长、增殖、侵袭、抗凋亡及促进血管生成中具有重要作用。简述了PI3K/Akt/m TOR/p70S6K信号通路作用于肝星状细胞(HSC)而对肝纤维化发生发展产生的作用,分析表明阻断该信号通路中任一靶点均能抑制HSC活化、增殖,促进HSC凋亡,抑制HSC分泌细胞外基质和延缓肝纤维化进程,阻断该通路有望成为肝纤维化的治疗策略。

miR-181b影响ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化形成的自噬调节机制

目的探讨微小RNA 181b(miR-181b)是否通过调节自噬相关靶蛋白参与动脉粥样硬化发展。方法通过颈总动脉套环诱导ApoE^(-/-)小鼠颈动脉粥样硬化斑块形成。通过尾静脉注射miR-181b慢病毒载体构建其过表达(miR-181bOE)及低表达(miR-181bKD)模型。检测血浆中脂质水平,苏木精-伊红染色对动脉粥样硬化斑块大小和体积进行定量,Western Blot检测自噬相关蛋白的表达。结果各组ApoE^(-/-)小鼠血浆中总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平均无显著差异(P>0.05)。MiR-181bKD和miR-181bOE分别显著减少和增加颈动脉斑块面积和体积(F=118.95~322.03,P<0.05)。MiR-181bOE可下调微管相关蛋白1轻链3膜结合型(LC3-Ⅱ)的表达,上调核糖体蛋白质S6激酶类70-kDa(p70S6K)表达,抑制自噬体形成;相反,miR-181bKD可上调LC3-Ⅱ的表达,下调p70S6K表达,促进自噬体形成。差异均有显著性(F=107.38~398.13,P<0.05)。结论抑制miR-181b可能通过下调p70S6K表达增加自噬活性,延缓颈动脉粥样硬化斑块的形成。

辛伐他汀对2型糖尿病认知功能障碍的保护作用及其机制研究

背景 2型糖尿病(T2DM)是常见的代谢紊乱性内分泌疾病,以高血糖为特征,长期高血糖状态可引起认知功能损害,表现为记忆和学习障碍、定向障碍、执行力障碍等。与T2DM常见并发症相比,关于中枢神经系统并发症的研究较少。目的观察辛伐他汀对T2DM大鼠学习记忆能力的影响,探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)信号通路在辛伐他汀改善认知功能中的作用。方法于2016年9月采用随机数字表法将120只健康雄性SD大鼠分为对照组(40只)、糖尿病组(40只)和辛伐他汀组(40只),糖尿病组和辛伐他汀组采用腹腔注射链脲佐菌素分别成功制备T2DM大鼠模型38、37只;辛伐他汀组大鼠采用辛伐他汀灌胃,对照组和糖尿病组大鼠灌胃等体积0.9%氯化钠溶液。饲养至32周行Morris水迷宫实验评估大鼠的记忆能力;显微镜下观察各组大鼠海马组织结构的改变,行Western blotting对mTOR、p70S6K、tau、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)表达水平进行分析。结果糖尿病组和辛伐他汀组大鼠空腹血糖均高于对照组,体质量均低于对照组(P<0.01)。糖尿病组和辛伐他汀组第2、3、4、5天的逃避潜伏期均长于对照组(P<0.05);辛伐他汀组第2、3、4、5天的逃避潜伏期均短于糖尿病组(P<0.05)。显微镜观察显示,糖尿病组海马神经元数量减少,且排列紊乱,细胞膜皱褶,胞核缺失,细胞器减少;辛伐他汀组海马神经元细胞结构大致正常,数量略减少。糖尿病组和辛伐他汀组的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau均高于对照组(P<0.01);辛伐他汀组的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau均低于糖尿病组(P<0.01)。糖尿病组和辛伐他汀组的MDA/β-actin、GSH/β-actin均高于对照组(P<0.01);辛伐他汀组的MDA/β-actin、GSH/β-actin均低于糖尿病组(P<0.01)。结论辛伐他汀能够改善T2DM大鼠认知功能,可能与mTOR/p70S6K信号通路的抑制和氧化应激产物生成减少有关。

HBV感染免疫耐受期产妇与正常产妇脐带血浆细胞样树突状细胞中PI3K、mTOR、p70S6K、IFNα的表达情况分析

目的比较HBV感染免疫耐受期产妇脐带血与正常产妇脐带血浆细胞样树突状细胞(pDC)中PI3K、mTOR、p70S6K、IFNα表达的差异。方法选取湖南中医药大学第一附属医院产科住院部2017年10月-2020年1月HBV感染免疫耐受期产妇20例(乙型肝炎组)及正常产妇10例(正常组)。分离培养脐带血pDC,在培养的第7天加入CpG-A,24 h后分别收集细胞及上清液,real-time PCR检测pDC PI3K、mTOR、p70S6K mRNA的表达,Western Blot技术检测pDC PI3K、mTOR、p70S6K蛋白表达,ELISA法检测pDC培养上清IFNα水平。计量资料采用两独立样本t检验。结果乙型肝炎组HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDC PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表达水平显著低于正常产妇组(t值分别为-81.04、-63.07、-34.55,P值均<0.001);乙型肝炎组HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDC PI3K、mTOR、p70S6K蛋白表达水平亦显著低于正常产妇组(t值分别为-8.13、-7.75、-6.71,P值均<0.001);乙型肝炎组HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDC培养上清IFNα表达水平显著低于正常产妇组(t=-15.88,P<0.05)。结论HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDC的PI3K、mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表达水平及IFNα水平减少,pDC功能受到抑制。

p70S6K、EGFR、PI3Kp110β在胃癌组织中的表达及临床意义

目的探讨p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷脂酰肌醇-3激酶亚单位110β(PI3Kp110β)在胃癌组织中的表达水平及相关临床意义。方法选取2015年4月至2020年4月病理科系统中经病理确诊为胃癌的患者为胃癌组,选择同期检查确诊为浅表性胃炎患者为对照组,每组30例。采用免疫组织化学方法检测两组p70S6K、EGFR、PI3Kp110β的表达水平,采用χ^(2)检验比较两组间p70S6K、EGFR、PI3Kp110β的表达情况,并分析其在胃癌组中不同分化程度、肿瘤TNM分期、是否累及浆膜层患者的差异。结果p70S6K在胃癌组和对照组中的高表达分别为24例(80.0%)、10例(33.3%),EGFR在胃癌组和对照组中的高表达分别为20例(66.7%)、7例(23.3%),PI3Kp110β在胃癌组和对照组的高表达分别为22例(73.3%)、11例(36.7%),胃癌组的p70S6K、EGFR、PI3Kp110β的高表达率均显著高于对照组,差异有统计学意义(χ^(2)值分别为13.303、11.380、8.148,P值均<0.01)。胃癌组中,低分化患者p70S6K、EGFR、PI3Kp110β的高表达率分别为87.5%、90.0%、86.4%,明显高于中高分化患者,差异有统计学意义(χ^(2)值分别为7.873、5.868、4.802,P值均<0.05);肿瘤TNM分期中,Ⅲ~Ⅳ期p70S6K、EGFR、PI3Kp110β的高表达率分别为70.8%、75.0%、72.7%,明显高于Ⅰ~Ⅱ期,差异有统计学意义(χ^(2)值分别为11.429、8.213、9.075,P值均<0.05),肿瘤累及浆膜层患者的p70S6K、EGFR、PI3Kp110β的高表达率分别为79.2%、85.0%、81.8%,明显高于未累及浆膜层患者,差异有统计学意义(χ^(2)值分别为7.163、5.568、8.523,P值均<0.05)。结论p70S6K、EGFR、PI3Kp110β在胃癌组织中高表达可能是胃癌发生及发展的重要标志。

p70S6K1及4E-BP1蛋白在结直肠癌中的作用

磷脂酰肌醇激酶3-蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在结直肠癌的发生、发展中发挥重要的作用。mTORC1下游靶点是核糖体 S6蛋白激酶1（p70S6K1）和真核翻译起始因子-4E结合蛋白1（4EBP1），两者在蛋白质合成中起主要的调节作用。结直肠癌中 p70S6K1及4EBP1的异常表达成为关注的焦点。

磷酸化流式技术评估肝移植后P70S6激酶活性的意义

目的 探讨应用流式磷酸化技术检测肝移植受体外周血CD3＋细胞的mTOR通路下游P70S6激酶的磷酸化水平及价值.方法 选取自2008年10月至2013年10月首都医科大学附属北京朝阳医院肝移植患者84例,其中以西罗莫司为主要免疫抑制剂方案的26例（西罗莫司组）,以他克莫司为主要免疫抑制剂方案的35例（他克莫司组）,以环孢素A为主要免疫抑制剂方案的23例（环孢素A组）.检测各组患者CD3＋细胞P70S6激酶磷酸化水平,分析西罗莫司组P70S6激酶磷酸化水平与血药浓度的相关性.同时检测3例健康人P70S6激酸磷酸化程度的个体内差异和个体间差异.结果 健康人P70S6激酶磷酸化个体内差异的变异度范围为3.5％ ～ 5.6％,个体间差异变异度为18.9％ ～22.5％.西罗莫司组CD3＋细胞P70S6激酶磷酸化（28.9±10.5）显著性低于健康对照组（57.2±8.4,P＜0.001）,他克莫司组（42.5±14.1,P＜0.001）和环孢素A组（51.4±10.9,P＜0.00l）.健康对照组的P70S6激酶活性（57.2±8.4）显著性高于他克莫司组（42.5±14.1,P＜0.01）和环孢素A组（51.4±10.9,P＜0.05）.在西罗莫司组,P70S6激酶磷酸化与血药浓度无关（r=-0.18,P=0.39）.结论 磷酸流式技术可以通过检测P70S6激酶磷酸化评估mTOR的抑制程度,检测P70S6激酶磷酸化水平可以为个性化免疫治疗提供更好的依据.

指联素对子宫内膜癌细胞AMPK／mTOR／S6K1信号通路及胰岛素增敏的影响

目的 探讨脂联素对子宫内膜癌HEC-1B细胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）／哺乳类雷帕霉索靶蛋白（mTOR）／核糖体蛋白s6激酶1（S6K1）信号通路及胰岛素增敏效应的影响。方法实验分为4组：脂联素组（Ad组，加入20μg／ml的脂联素作用30min）；抑制剂组（加入10μmol／L的AMPK抑制剂——复合物C作用30min）；脂联素＋抑制剂组（Ad＋抑制剂组，10μmol／L复合物C预处理30min后，再加人20μg／ml脂联素作用30min）；对照组（仅加入无血清DMEM培养基）。（1）荧光定量PCR技术及蛋白印迹法检测HEC-1B细胞中脂联素受体（AdipoR）1、AdipoR2 mRNA和蛋白的表达水平。（2）以不同浓度（分别为2．5、5、10、20μg／ml）脂联素作用于HEC-1B细胞30min，增敏实验时再加50nmol／L胰岛素作用5min；以20μg／ml脂联素作用于HEC-1B细胞不同时间（分别为15、30、45、60min），增敏实验时再加50nmol／L胰岛素作用5min。蛋白印迹法检测HEC-1B细胞中AMPK、mTOR、S6K1蛋白活化水平以及胰岛素受体底物1（IRS1）酪氨酸磷酸化水平。（3）活细胞计数（CCK-8）法检测4组HEC-1B细胞的增殖能力，体外穿膜实验检测4组HEC-1B细胞的迁移能力。结果（1）在HEC-1B细胞中，AdipoR1 mRNA及蛋白的表达水平分别为8．50±0．09、0．91±0．03，明显高于AdipoR2 mRNA及蛋白（分别为1．00±0．00、0.69±0．03；P〈0．05）。（2）脂联素以时间、浓度依赖方式诱导HEC-1B细胞中AMPK蛋白活化水平增高但抑制mTOR、S6K1蛋白活化水平（P〈0．05），且脂联素浓度为20μg／ml、作用时间为30min时，AMPK蛋白的活化水平均达到峰值。脂联素以浓度依赖方式诱导IRS1酪氨酸磷酸化水平增高（P〈0.05）。（3）Ad组HEC．1B细胞增殖的抑制率为（0．68±0．34）％，Ad＋抑制剂组为（0．24±0．04）％，两组比较，差异有统计学意义（t=17．88，P〈0.05）。Ad组穿膜细胞数为（77±8）个，Ad＋抑制剂组为（132±13）个，两组比较，差异有统计学意义（t=-7．34，P〈0．05）。结论脂联素通过AMPK／mTOR／s6K1信号通路发挥抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖的效应，并通过调控AMPK／s6K1／IRs1信号通路增加HEC-1B细胞对胰岛素的敏感性。

高与低表达RSK4基因人乳腺癌细胞株的筛选及鉴定

目的:探讨核糖体S6激酶4(RSK4)抑癌基因在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、T47D、Bcap37和MCF-7中的表达,并筛选出高和低表达RSK4基因的乳腺癌细胞。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法从mRNA和蛋白水平检测RSK4在MDA-MB-231、T47D、Bcap-37和MCF-7 4种乳腺癌细胞株中的表达。结果:人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、T47D、Bcap37和MCF-7中均有RSK4基因表达,其中,MCF-7细胞RSK4表达水平最高,为表达量最低的MDA-MB-231细胞的2.9倍,MCF-7细胞RSK4蛋白表达水平也最高,与其他3种细胞株相比,差异有统计学意义,P<0.001。RT-PCR法和蛋白质印迹法检测结果一致,具有高度相关性,r=0.766,P<0.001。结论:人乳腺癌细胞株MCF-7为高表达RSK4基因的细胞,MDA-MB-231细胞为低表达RSK4基因的细胞,两者均可作为人乳腺癌细胞中研究RSK4基因的实验材料。

RSK2沉默对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响

目的:探讨RSK2在肝细胞癌(HCC)中的表达与化疗药物耐药的关系。方法:将HepG2细胞分为RSK2干扰组(PGCsi3.0-RSK2 siRNA转染细胞),5-FU处理组(10μg/mL 5-FU处理细胞24 h),5-FU处理+RSK2干扰组及空白对照组,采用MTT方法检测各组细胞增殖情况;用Western blot方法检测5-FU处理组和5-FU处理+RSK2干扰组细胞RSK2,c-Jun,Bcl-2,LKB1蛋白表达。结果:与空白对照组比较,沉默RSK2蛋白与5-FU干预均可明显抑制HepG2细胞增殖(均P<0.05),且其联合作用大于两者单独的作用(均P<0.05);与RSK2干扰组比较,5-FU处理+RSK2干扰组细胞RSK2,c-Jun,Bcl-2表达上调,LKB1表达下调(均P<0.05)。结论:抑制RSK2表达可以增强肝癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性,机制作用可能与其调节c-Jun,Bcl-2,LKB1蛋白的表达有关。

二十碳五烯酸激活PI3K/mTOR/p70S6K通路改善快速老化小鼠肌肉功能

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)通路介导二十碳五烯酸(EPA)对快速老化小鼠肌肉功能的作用。方法将40只SAMP8小鼠随机分为模型组、抑制剂组、EPA组、抑制剂+EPA组,各10只,另取8只正常老化SAMR1小鼠作为对照组。抑制剂组给予PI3K抑制剂LY2940027.5 mg·kg^(-1)灌胃,EPA组给予EPA 70 mg·kg^(-1)灌胃,抑制剂+EPA组给予LY294002+EPA灌胃,模型组和对照组灌胃等体积生理盐水,干预8周。检测小鼠肌肉力量强度,计算小鼠肌肉湿重与睾丸周围脂肪湿重变化。HE染色观察小鼠骨骼肌组织病理变化,评估肌纤维横截面积。Western blot法和qRT-PCR法检测小鼠骨骼肌中PI3K、mTOR、p70S6K蛋白及mRNA表达水平。结果与对照组相比,模型组小鼠抓力小,疲劳耐受时间短,肌肉和睾丸周围脂肪湿重轻,骨骼肌中磷酸化PI3K(p-PI3K)、p-mTOR、p-p70S6K蛋白相对表达量低(P<0.05)。与模型组比较,抑制剂组小鼠抓力更小,疲劳耐受时间更短,肌肉湿重、睾丸周围脂肪湿重更轻,骨骼肌中p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K蛋白相对表达量更低(P<0.05);EPA组和抑制剂+EPA组小鼠抓力增大,疲劳耐受时间较长,肌肉湿重、睾丸周围脂肪湿重较重,骨骼肌中p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K蛋白相对表达量上调(P<0.05)。与对照组比较,模型组、抑制剂组肌纤维横截面积明显缩小,细胞核内移明显,抑制剂+EPA组肌纤维横截面积与细胞核内移有所改善,EPA组改善更明显。结论EPA可能是通过激活PI3K/mTOR/p70S6K信号通路改善快速老化小鼠的肌肉功能。

Prkaa2对肾小管上皮细胞纤维化的调控作用及Prkaa2和Rps6ka1间的关系研究

目的探讨腺苷酸活化蛋白激酶亚基α2(protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2,Prkaa2)与核糖体蛋白S6激酶A1(ribosomal protein S6 kinase A1,Rps6ka1)的关系及Prkaa2对转化生长因子β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤维化的影响。方法用重组蛋白TGF-β1诱导NRK-52e细胞制备纤维化的细胞模型。采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质印迹法检测大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52e细胞(对照组)和10 ng/ml TGF-β1诱导12、24、36 h的NRK-52e细胞中Prkaa2的表达水平。于NRK-52e贴壁生长达30%时加入Prkaa2低表达慢病毒,转染72 h后收集细胞,并于Prkka2低表达慢病毒组及Prkaa2空病毒组中用qRT-PCR检测Prkaa2敲减效率。设立TGF-β1诱导、Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导3个实验组,同时以正常未作任何处理的NRK-52e细胞系为对照组。通过蛋白质印迹法检测Prkaa1、Prkaa2、α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、E钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase9,Caspase9)和p53基因(p53)的表达。从Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组中分别选取3个生物学重复样本,通过Affymetrix基因表达谱芯片测序结果筛选差异表达的基因。然后,在Prkaa2RNAi+TGF-β1、Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导2个实验组中验证Prkaa2、Rps6ka1的表达。结果qRT-PCR及蛋白印迹检测结果显示,TGF-β1诱导12 h时NRK-52e细胞中Prkaa2的mRNA和蛋白的相对表达量分别为1.368±0.083和1.311±0.007,与对照组1.000±0.123和1.159±0.009相比,差异有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR实验结果显示Prkaa2空病毒组相对表达量为1.042±0.302,较Prkaa2低表达慢病毒组为0.171±0.165,Prkaa2 mRNA表达下调,差异具有统计学意义(P=0.023)。蛋白质印迹法检测结果显示,TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为2.89±0.04,较对照组3.82±0.03下调,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1.04±0.04,较对照组1.06±0.05未见明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);TGF-β1诱导组α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为3.60±0.03、1.07±0.07、1.81±0.02、1.17±0.04、0.62±0.01,均较对照组2.95±0.04、0.74±0.03、1.00±0.04、0.77±0.05、0.37±0.01上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为3.57±0.03,较空病毒+TGF-β1诱导组3.04±0.15上调,差异有统计学意义(P<0.05);Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1.03±0.05,较空病毒+TGF-β1诱导组1.05±0.06未见明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组Prkaa2、α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为0.54±0.02、3.21±0.07、0.44±0.03、1.16±0.08、0.94±0.03、0.44±0.03,均较空病毒+TGF-β1诱导组0.89±0.01、3.49±0.06、0.98±0.07、1.87±0.02、1.21±0.04、0.65±0.03下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。Affymetrix基因表达谱芯片测序结果显示核糖体蛋白S6激酶A1(ribosomal protein S6 kinase A1,Rps6ka1)下调。蛋白质印迹法和qRT-PCR验证结果提示,Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组Rps6ka1表达相对表达量为0.60±0.02、0.590±0.026,较Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组1.15±0.04、1.003±0.080下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Prkaa2与Rps6ka1存在正向调控关系,抑制Prkaa2可以改善TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。

脊髓mTOR/S6K1/Gli1信号通路在小鼠慢性吗啡耐受中的作用

目的评价脊髓哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)/Gli1信号通路在小鼠慢性吗啡耐受中的作用。方法健康雄性昆明小鼠,8~10周龄,体重23~25 g。实验Ⅰ取小鼠50只,采用随机数字表法分为2组:生理盐水组(S组,n=10)和吗啡组(M组,n=40)。M组和S组分别皮下注射吗啡和生理盐水10 mg/kg,2次/d,连续7 d。于给药前1 d和每天最后1次给药后30 min测定热痛阈,计算最大镇痛效应百分比(MPE)。M组于给药后1、3、5和7 d热痛阈测定结束后、S组于最后1次热痛阈测定结束后随机处死10只小鼠,取脊髓组织。实验Ⅱ取小鼠40只,采用随机数字表法分为4组(n=10):KU-0063794+吗啡组(KU+M组)、二甲基亚砜(DMSO)+吗啡组(DM+M组)、吗啡+KU-0063794组(M+KU组)和吗啡+二甲基亚砜组(M+DM组)。4组皮下注射吗啡10 mg/kg,2次/d,连续7 d。于第1~3天每天吗啡注射前30 min时,KU+M组腹腔注射mTOR特异性抑制剂KU-0063794200μl(1μg/μl),DM+M组腹腔注射10%DMSO 200μl,2次/d;于第5~7天每天吗啡注射前30 min时,M+KU组腹腔注射KU-0063794200μl(1μg/μl),M+DM组腹腔注射10%DMSO 200μl,2次/d。于吗啡注射前1 d和每天最后1次给药后30 min测定热痛阈,计算MPE。最后1次热痛阈测定结束后处死大鼠,取脊髓组织。采用Western blot法检测脊髓mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1和Gli1的表达水平。结果实验Ⅰ与S组比较,M组给药后各时点MPE升高,给药后第3、5和7天时脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调(P<0.05),mTOR和S6K1表达差异无统计学意义(P>0.05)。实验Ⅱ与DM+M组比较,KU+M组注射吗啡后第3~7天时MPE降低,脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调(P<0.05),mTOR和S6K1表达差异无统计学意义(P>0.05);与M+DM组比较,M+KU组注射吗啡后第6和7天时MPE升高,脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调(P<0.05),mTOR和S6K1表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论脊髓mTOR/S6K1/Gli1信号通路参与了小鼠慢性吗啡耐受的形成和维持。