新城疫病毒对宿主核糖体蛋白RPL11降解机制的初步研究

本研究使用蛋白标记药物Puromycin标记NDV感染后DF-1细胞新合成的蛋白,发现NDV感染后新蛋白合成量显著下调,而病毒NP蛋白的含量却随感染时间的延长呈增加趋势。为探究NDV的感染对DF-1细胞核糖体大亚基L11蛋白(RPL 11)表达水平的影响,分别收获NDV(MOI 1)感染后不同时间(8 h、16 h、24 h和32 h)和不同剂量NDV(MOI 1、0.1)感染后相同时间的细胞样品,采用western blot、激光共聚焦、荧光定量PCR分别检测内源性RPL 11的蛋白表达和mRNA转录水平。Western blot结果显示NDV感染后核糖体蛋白RPL 11的表达量显著降低,并且与病毒感染时间和感染剂量呈正相关。激光共聚焦结果显示,NDV感染后细胞核与细胞质中的RPL 11荧光信号均明显减弱。但荧光定量PCR结果显示,该基因的转录水平却无明显变化,表明其蛋白表达量的减少发生在翻译后修饰环节。构建重组质粒pFlag-RPL 11转染DF-1细胞24 h后再感染不同剂量NDV(MOI 1、0.1),通过western blot检测外源性RPL 11的表达水平。结果显示外源性RPL 11蛋白的表达量在病毒感染后也呈明显下降趋势,并也与病毒感染剂量呈正相关。在NDV感染(MOI 1)的DF-1细胞培养基中添加泛素蛋白酶体抑制剂MG132,病毒滴度测定结果表明该药物对病毒增殖无明显影响,却能够显著抑制NDV感染后RPL 11蛋白的降解,表明RPL 11的降解依赖泛素蛋白酶体途径。上述结果证实NDV感染细胞后能够引起RPL 11蛋白的泛素化降解,且该降解过程能够被MG132所抑制。本研究为解析NDV感染后宿主细胞内蛋白翻译的变化提供了新的着眼点。

核糖体蛋白rpl15cDNA序列在真骨鱼类系统进化研究中的价值

应用RTPCR,从真骨总目(Teleostei)5目15种鱼类中首次克隆了核糖体大亚基蛋白L15(rpl15,ribosomalproteinL15)的完整cDNA序列。以海鲢形亚组(Elopomorpha)的鳗鲡作为外类群,对这些真骨鱼类的核糖体蛋白L15cDNA序列进行了系统发育分析,结果表明:(1)rpl15基因在真骨鱼类等许多真核生物进化中高度保守;(2)系统树中各物种之间的关系与形态分类一致。rpl15编码区适合于真骨鱼类目以上分类阶元的分子系统学研究。

游仆虫重组核糖体蛋白L11与肽链释放因子的体外相互作用分析

核糖体蛋白L11(ribosome protein L11)是一种高度保守的蛋白质.为研究真核生物的核糖体蛋白L11的功能,从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)大核基因组中克隆到核糖体蛋白L11基因,构建了重组表达质粒pGEX-6p1-L11,通过谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析,纯化了重组融合蛋白GST-L11.Pull down分析显示,八肋游仆虫的核糖体蛋白L11与第一类肽链释放因子eRF1a可以在体外相互作用.这一结果提示,与原核生物一样,低等真核生物的核糖体蛋白L11在肽链终止过程中可能起一定的作用.

青稞核糖体蛋白基因HbRPL19的克隆、序列分析及原核表达

【目的】克隆青稞核糖体蛋白基因HbRPL19,分析其序列特征并在大肠杆菌中诱导目的蛋白,为后续的研究奠定基础。【方法】根据鉴定得到的青稞HbRPL19的序列设计了引物,从青稞叶片的c DNA中扩增得到目的片段,并对目的基因序列进行了测序鉴定和序列分析,同时构建了原核表达载体p ET28a-RPL19,转化入大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。【结果】成功扩增出了青稞核糖体蛋白基因HbRPL19的CDS全长序列,大小为654 bp。根据生物信息学分析的结果,HbRPL19编码的蛋白质含有217个氨基酸,相对分子质量为24.47 KD,理论等电点(p I)为10.42,总平均亲水性(GRAVY)为-0.353,不稳定系数为53.46,存在典型的SH3-like结构域和核糖体蛋白L19结构域。系统进化分析表明,HbRPL19与小麦和山羊草的RPL19具有较近的亲缘关系。蛋白表达结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。【结论】获得了青稞抗寒相关基因HbRPL19的序列和蛋白。

核糖体蛋白RPL41对人卵巢癌A2780细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的研究核糖体蛋白RPL41对人卵巢癌A2780细胞增殖和凋亡的影响,并分析其潜在凋亡机制。方法不同浓度RPL41(0μM、20μM、50μM、100μM)处理A2780细胞,分为对照组和RPL41低、中、高剂量组。采用MTT法检测人卵巢癌A2780细胞活力变化;采用Hoechst染色法检测A2780细胞凋亡情况;采用流式细胞仪检测A2780细胞周期;采用蛋白印记(Western Blot)法检测A2780细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达;采用RNA干扰技术沉默RPL41,分为NC组和si RPL41组,Western Blot检测沉默RPL41后A2780细胞中Bcl-2和Bax的表达。结果与对照组相比,糖体蛋白RPL41可以抑制人卵巢癌A2780细胞的增殖,具有剂量依赖性(P<0.05);RPL41剂量依赖性引起A2780细胞凋亡(P<0.05);RPL41可以显著上调Bax的表达、下调Bcl-2的表达,呈浓度依赖性(P<0.05);沉默RPL41表达后,A2780细胞中Bcl-2的表达较NC组显著上升,Bax的表达较NC组显著下降(P<0.05)。结论RPL41可呈剂量依赖性抑制卵巢癌A2780细胞的增殖,并可能通过上调Bax表达、下调Bcl-2表达,参与细胞程序化死亡机制,导致A2780细胞凋亡。

核糖体蛋白L11及其功能

核糖体蛋白L11(ribosome protein L11)是一种高度保守的蛋白质,是蛋白质合成过程中所必需的。L11由N-末端和C-末端两个结构域组成。L11的N-末端在蛋白质合成中作为分子开关,在多肽链的延伸阶段与延伸因子EF-G相互作用,对EF-G依赖的迁移过程是必需的;在肽链终止阶段与肽链释放因子RF1相互作用,对RF1识别终止密码子UAG的功能是必需的。L11上有一个与噻唑类(thiazole)抗生素结合的靶位点,这种结合会抑制依赖延伸因子的核糖体的活性。

粘虫核糖体蛋白S11基因cDNA的克隆和序列分析

【目的】克隆和鉴定粘虫核糖体蛋白S11(Ribosomal Protein S11,RPS11)基因,为昆虫核糖体蛋白功能的研究提供基础资料。【方法】运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫cDNA为模板,对RPS11基因进行克隆,获得其全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对RPS11基因全长cDNA序列及推测得到的RPS11蛋白氨基酸序列进行分析,构建其系统进化树。【结果】获得的粘虫核糖体蛋白S11基因(RPS11)cDNA序列长度为521 bp,其中包括26 bp的5′非编码区、36 bp的3′非编码区和459 bp的开放阅读框,编码一个由152个氨基酸组成的蛋白,其具有核糖蛋白S17蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫RPS11蛋白的理论分子质量为17.737 9 ku,等电点为10.63,富含6种类型的特定功能位点,与同属夜蛾科的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的RPS11蛋白相似性高达97%。用Neigh-bor-joining(NJ)法构建基于RPS11氨基酸序列的系统发育树,结果显示,粘虫RPS11与烟芽夜蛾(H.virescens)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)等3种鳞翅目昆虫的亲缘关系较近。【结论】成功获得了粘虫RPS11基因全长序列(GenBank登录号为GQ222274),由其编码的核糖体蛋白RPS11属于核糖蛋白S17蛋白家族。

青岛文昌鱼核糖体蛋白AmphiL11基因的克隆和同源性分析

对青岛文昌鱼 18小时神经胚cDNA文库进行测序 ,获得了 5个AmphiL11的EST ,经拼接得到文昌鱼核糖体蛋白AmphiL11的编码完整的cDNA序列并演绎出AmphiL11的氨基酸序列 .通过对AmphiL11蛋白的结构分析及其与人、鼠、鱼等脊椎动物和果蝇、线虫等无脊椎动物及酵母中同种核糖体蛋白的同源性分析 ,发现AmphiL11与脊椎动物核糖体L11蛋白的同源性很高 ,与高等无脊椎动物甚至酵母的同源性也较高 .提示AmphiL11具有较高的进化水平 ,更接近于脊椎动物的核糖体蛋白L11.同时也表明 。

羊驼皮肤中核糖体蛋白L34(RPL34)基因表达的分析

从羊驼皮肤cDNA文库中筛选到RPL34的克隆,经PCR鉴定并测序得知:一种克隆的大小为270 bp(命名为RPL34Ⅰ),另一种克隆的大小为470 bp(命名为RPL34Ⅱ)。序列分析发现,RPL34Ⅰ和Ⅱ在核苷酸水平上,5'UTR区不具有同源性,3'UTR区具有同源性;在氨基酸水平上,部分具有高度同源性;分子进化树分析表明二者具有不同的进化速率。此外,RPL34Ⅰ和Ⅱ对应于不同的转录本。通过以上结果分析,认为RPL34Ⅰ和RPL34Ⅱ二者同时在羊驼皮肤中表达,可能是RPL34的两个剪接体,发挥不同的生物学功能。

八肋游仆虫核糖体蛋白L11的基因克隆与序列分析

以单细胞真核生物八肋游仆虫Euplotes octocarinatus为实验材料,采用PCR、RT-PCR方法克隆了核糖体蛋白L11基因(EoRPL11)。将该序列与GenBank中其他物种的RPL11基因序列进行同源性比对,采用DNAStar软件进行聚类分析。结果显示,成功克隆到游仆虫RPL11基因,大核中该基因全长709bp,开放阅读框(ORF)为531bp,编码176个氨基酸;cDNA序列与大核中ORF序列一致,表明该基因具有转录活性;所推导的氨基酸序列与嗜热四膜虫Tetrahymena thermophila的RPL11同源性最高,为66%。

核糖体蛋白RPL36A siRNA对U937细胞的促增殖、抑凋亡作用

本研究探讨RPL36A基因在急性髓系白血病(AML)病人的表达情况及可能的作用机制。应用RT-PCR检测急性髓系白血病细胞、正常人单个核细胞、U937细胞中RPL36A基因的表达情况;RPL36A siRNA经脂质体介导转入U937细胞,采用MTT法及DNA倍体分析检测细胞增殖,AO/EB、TUNEL、Annexin V/FITV检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blot检测RPL36A基因及蛋白表达水平的变化。结果表明:RPL36A在初治AML细胞和U937细胞中表达明显增高;MTT法及DNA倍体分析发现,U937细胞增殖受到抑制,细胞周期阻滞;AO/EB染色、TUNEL、Annexin V/FITV检测显示,转染RPL36A siRNA的细胞组凋亡率高于对照组;RPL36A siRNA作用可引起U937细胞的RPL36A的mRNA水平的降低和蛋白表达量的下降,且呈时间依赖性(r分别为0.9813和0.9537)。结论:AML细胞高表达RPL36A基因,RPL36A基因的高表达可能促进AML细胞的过度增殖并抑制其凋亡。

人核糖体40S亚基RPS11蛋白的原核表达和纯化

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,属于核糖体蛋白S17p家族,由RPS11基因所编码,主要存在于真核生物中。本研究通过PCR扩增RPS11基因,构建pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11原核表达载体。将重组质粒转入E.coli DH5α,序列测定正确后,将其转入E.coli BL21(DE3),加入IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE分析后,利用亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆RPS11基因,构建了原核表达载体pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE分析证实表达目的蛋白正确。通过Ni-TNA和GSH-Sepharose层析柱获得纯化蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。

核糖体蛋白L12(RPL12)在猪繁殖与呼吸综合征病毒复制中的作用

为研究宿主细胞核糖体蛋白L12(RPL12)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)复制中的作用,本研究通过荧光定量PCR和Western-blotting等方法,检测了PRRSV感染对Marc-145细胞中RPL12表达的影响,以及过表达或敲减RPL12对PRRSV复制的影响。结果显示,PRRSV感染可上调Marc-145细胞中RPL12基因的表达。过表达RPL12可促进PRRSV的复制,而敲减RPL12可抑制PRRSV的复制。通过免疫共沉淀和共聚焦显微镜检测,进一步研究发现RPL12蛋白与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用,并共定位于细胞质中。本研究首次发现了宿主蛋白RPL12能够促进PRRSV复制,并与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用,为进一步研究PRRSV的感染与复制机制以及与宿主的相互作用提供了新的切入点,为抗病毒药物的研发提供了有益的探索。

犬钩虫核糖体蛋白L36及S4A全长cDNA克隆与蛋白特性分析

目的克隆犬钩虫Ancylostoma caninum核糖体蛋白L36(AcaRPL36)及S4A(AcaRPS4A)全长cDNA序列,并对编码的蛋白特性进行分析,探讨它们在研究系统发育中的应用。方法运用3′RACE技术并结合RT-PCR技术先后分别从犬钩虫中克隆核糖体蛋白L36及S4A的部分序列,经拼接后获得全长cDNA序列。用BlastP搜索相似性序列及保守结构域,所获序列在GenBank中登记,并用Neighbor-Joining(NJ)法构建基于RPL36及RPS4氨基酸序列的系统发育树。结果AcaRPL36全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490128)为390 bp,开放阅读框为315 bp,编码104个氨基酸组成的蛋白;AcaRPS4A全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490129)为880 bp,开放阅读框为786bp,编码261个氨基酸组成的蛋白。RPL36及RPS4序列较保守,与Caenorhabditis elegans等的亲缘关系较近的生物,在系统发育树中的遗传距离也较近。结论首次获得犬钩虫RPL36及RPS4A,RPL36和RPS4可能作为分子指标应用于研究生物系统发育。

鲇鱼和斜带石斑鱼核糖体蛋白L15完整cDNA的克隆和序列分析

通过RT PCR和3′ RACE方法,分别从鲇鱼(Silurusasotus)和斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)中克隆了核糖体大亚基蛋白L15(ribosomalproteinL15,RPL15)的完整cDNA,并详细分析了其序列特征.这两种鱼的RPL15蛋白cDNA均包含一个615个核苷酸的完整阅读框,推测分别编码一个204个氨基酸的蛋白.不论是核苷酸序列还是推测的氨基酸序列,这2个序列分别与同属的南方大口鲇和同科的大眼鳜rpl15序列同源性最高,与其他已知的脊椎动物rpl15序列也有较高的同源性.基于这2个序列的编码区和其他鱼类的rpl15编码序列进行分子系统学分析,与传统的形态分类结果是一致的.

猪脑心肌炎病毒3AB蛋白与宿主蛋白RPL11相互作用的鉴定

为了研究与猪脑心肌炎病毒(EMCV)3AB相互作用的宿主蛋白,本实验采用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库,获得6个与EMCV 3AB相互作用的宿主蛋白(RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20和LGALS1),经分析显示这些蛋白分别参与DNA复制、有丝分裂和细胞凋亡等过程;酵母共转化试验与免疫共沉淀试验证实EMCV 3AB和RPL11两者之间存在特异性结合;激光共聚焦试验显示EMCV 3AB与RPL11共同过度表达时,二者共定位在细胞核中,而在EMCV感染状态下,3AB与RPL11主要共定位在细胞质中。另外,EMCV感染HeLa细胞能降低细胞中p53的蛋白水平,但3AB并不直接促进p53蛋白降解,表明EMCV 3AB对RPL11-MDM2-p53通路无影响。本研究发现并证实了RPL11与EMCV 3AB之间的相互作用,为进一步研究RPL11蛋白在EMCV复制中的作用奠定了基础。

色瓦绵羊RPL8基因的组织表达特征及生物信息学分析

【目的】研究色瓦绵羊核糖体蛋白L8基因(RPL8)在各组织部位的表达特征及其潜在功能作用,揭示RPL8基因调控色瓦绵羊产奶质量的分子作用机制,为推进色瓦绵羊的分子遗传育种提供理论依据。【方法】PCR扩增色瓦绵羊RPL8基因,通过ProtParam、ProtScale、SignalP 5.0、TMHMM 2.0等在线软件分析RPL8基因结构特征及潜在功能,并以实时荧光定量PCR检测其在色瓦绵羊各组织中的表达分布情况。【结果】RPL8基因在色瓦绵羊乳腺、肌肉、心脏、肾脏、脾脏、肝脏、小肠、瘤胃和卵巢等9个组织中均有表达,在小肠、乳腺和卵巢中的相对表达量极显著高于其他组织中的相对表达量(P<0.01)。色瓦绵羊RPL8基因编码区(CDS)序列长774 bp,共编码257个氨基酸残基;基于RPL8基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,色瓦绵羊与山羊、牦牛、牛等反刍物种的亲缘关系较近。色瓦绵羊RPL8蛋白相对分子量为28024.66Da,理论等电点(pI)为11.04,是一种稳定的碱性亲水性蛋白,不具有跨膜结构,主要定位于细胞质(占78.3%);色瓦绵羊RPL8蛋白存在15个磷酸化位点[7个丝氨酸(S)位点,8个苏氨酸(T)位点],其二、三级结构中均以无规则卷曲为主。色瓦绵羊RPL8蛋白的互作蛋白均为核糖体蛋白,其同源性高达99.90%,其中,RPS5、RPS16、RPL11、RPS3、RPS18和RPS11属于通用核糖体蛋白家族,RPL13属于真核核糖体蛋白家族。【结论】色瓦绵羊RPL8是一种胞内稳定的碱性亲水性蛋白,具有核糖体蛋白的基本结构特征。RPL8基因在色瓦绵羊各组织中的表达具有普遍性,尤其在乳腺和卵巢中呈高表达,说明RPL8基因除了发挥其家族基本功能作用外,在色瓦绵羊乳腺和卵巢组织中可能还影响乳脂含量与卵泡的周期性发育。

花生核糖体蛋白L29-1(RPL29-1)基因克隆表达分析及载体构建

核糖体蛋白是核糖体的主要组成成分,在细胞内蛋白质生物合成过程中具有重要作用。RPL29-1是核糖体大亚基60S的一个组件。本研究以花生品种日花1号为材料,利用RACE方法成功得到RPL29-1基因的c DNA序列,并获得DNA序列。RPL29-1基因c DNA序列包括186 bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。RPL29-1基因DNA序列含有两个外显子和一个内含子。一级结构分析表明,RPL29-1蛋白质分子量为7 127.02 Da,等电点为10.29。本研究采用荧光定量技术(q RT-PCR)分析了RPL29-1基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,并构建了RPL29-1的过表达载体和反义表达载体,为进一步通过功能分析研究花生RPL29-1基因在抗青枯病中的作用奠定基础。

核糖体蛋白L11与肿瘤抑制

核糖体蛋白L11(ribosomal proteinL11,RPL11)是核糖体60S大亚基的重要组成部分,对于核糖体的组装和合成是必须的。除此之外,研究发现真核生物中的RPL11还参与细胞周期阻滞、细胞凋亡及肿瘤发生等过程的调控。与抑癌蛋白ARF功能相类似,它能够与癌蛋白HDM2相互作用,激活p53抑癌蛋白的活性;与癌蛋白c-Myc相互作用,负反馈调控c-Myc的转录活性。推测RPL11本身可能具有肿瘤抑制功能。本文就RPL11参与调控HDM2-p53和c-Myc这两个与肿瘤密切相关的信号通路的研究进展进行综述。

转录因子Runx1对RPL4启动子的调节作用

目的:儿童白血病细胞全基因组芯片数据聚类分析发现,核糖体蛋白L4(ribosomal protein L4,RPL4)启动子区域具有转录因子Runx1的结合位点TTCATTCT,由此推测Runx1可能与该基因启动子之间存在调控作用。本研究通过观察Runx1蛋白与RPL4启动子之间的相互作用,了解Runx1对RPL4启动子转录活性的影响,探讨其在儿童白血病发生机制中的意义。方法:构建含RPL4启动子及其突变体的荧光素酶报告质粒,与Runx1的表达质粒共转染293T细胞,进行荧光素酶活性分析。结果:Runx1蛋白可使RPL4启动子的转录活性降低(P<0.01);随着Runx1剂量的增加,RPL4启动子的转录水平呈剂量依赖性降低(P<0.01);Runx1蛋白对RPL4启动子的突变体转录活性无调控作用(P>0.05)。结论:Runx1蛋白对RPL4启动子具有转录抑制作用,且具有明显的剂量依赖性;Runx1蛋白通过结合RPL4启动子区域的TTCATTCT位点发挥调控作用。