豌豆核糖体小亚基蛋白S21的cDNA克隆、序列分析及在G2豌豆中的表达研究

以G2豌豆幼苗为材料,构建了滴度为6.5×106pfu的cDNA文库,用同源序列筛选法从该文库中得到一个全长465bp的cDNA。杂交分析认为它是一完整的cDNA序列。DNA序列分析表明,它拥有一个282bp的开放读码框,编码94个氨基酸。计算机同源序列比较发现,它可能编码豌豆核糖体小亚基蛋白S21(RS21-PEA),因为该序列与已知的玉米、水稻S21在氨基酸全序列水平上有32%～35%的同源性,并含有与RNA结合的特征结构域。进化树分析显示S21蛋白可在一定程度上反映生物的进化及遗传变异趋势。

蛋白激酶A抑制剂H-89通过调节核糖体蛋白S6激酶1的磷酸化阻断SP600125诱导的CMK细胞多倍体化

目的研究核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)翻译后修饰在巨核细胞倍体化调控方面的作用。方法 c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125和蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89单独或联合处理CMK原始巨核细胞白血病细胞。碘化丙啶(PI)染色,结合流式细胞术检测DNA的相对量,从而进行DNA倍体分析;Western blot法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)下游靶分子S6K1表达和磷酸化修饰(Thr389和Thr421/Ser424)的变化。使用分子对接和激酶活性检测分析H-89与S6K1结合的关系以及对激酶活性的影响。结果 SP600125以时间和剂量依赖的方式诱导CMK细胞多倍体化,同时,上调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和下调Thr389的磷酸化。H-89不但部分阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化,而且下调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和上调Thr389磷酸化。分子对接和激酶活性分析发现H-89通过占据ATP结合位点,抑制S6K1活性。值得注意的是,H-89和SP600125均抑制PKA的活性,而且两者联合进一步抑制了PKA的活性,表明H-89阻断SP600125诱导CMK多倍体化与其对PKA的作用无关,而与S6K1磷酸化修饰状态的改变有关。结论 H-89通过调节S6K1磷酸化阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化。

p70/p85核糖体蛋白S6激酶1重组真核表达载体的构建及其在人乳腺癌MCF-7细胞内功能的初步鉴定

目的:构建p70核糖体蛋白S6激酶1(p70 ribosomal protein S6 kinase 1,p70 S6K1)及p85 S6K1基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,并鉴定其在人乳腺癌MCF-7细胞内的表达及功能。方法:以pRK7-HA-S6K1为模板,采用PCR扩增出目的基因片段p70 S6K1、p85 S6K1,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,采用PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将重组载体转染MCF-7细胞,24 h后采用Western blotting方法检测细胞内p70 S6K1、p85 S6K1蛋白的表达;同时向转染细胞内加入1 mmol/L H2O2处理36 h,观察p70 S6K1、p85 S6K1蛋白对H2O2诱导的细胞死亡的影响。结果:成功扩增得到p70 S6K1、p85 S6K1基因片段并构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,重组载体经PCR、双酶切鉴定均出现p70 S6K1和p85S6K1预期条带,DNA测序结果显示其全长基因阅读框完整、正确。重组载体在MCF-7细胞中高效表达flag-p70 S6K1和flag-p85S6K1,且p85 S6K1能增强H2O2诱导的细胞死亡。结论:成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,均能在MCF-7细胞中高效表达,且p85 S6K1能够增强H2O2诱导的细胞死亡。

核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)介导SP600125诱导的巨核细胞白血病细胞系多倍体化依赖于细胞分化程度

目的探讨核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)在不同分化程度巨核细胞白血病细胞系多倍体化中的调控作用。方法采用c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125诱导Dami、Meg-01和HEL细胞多倍体化,使用蛋白激酶A抑制剂H-89阻断SP600125药物作用,流式细胞术分析表型(CD41a、CD42a和CD42b)和DNA倍性,Western blot法检测S6K1相关蛋白的表达及磷酸化修饰位点的变化。结果 SP600125诱导多倍体化和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)磷酸化。然而,SP600125诱导多倍体化的程度不同,对Dami细胞作用最强、HEL细胞次之、Meg-01细胞最弱。而且SP600125上调Dami细胞的S6K1Thr421/Ser424磷酸化并下调Thr389磷酸化,仅上调HEL细胞的Thr389磷酸化,对Meg-01细胞的S6K1无影响。虽然H-89下调SP600125诱导的3种细胞系中4E-BP1磷酸化,但只部分阻断Dami细胞多倍体化及下调S6K1 Thr421/Ser424磷酸化和上调Thr389磷酸化。尽管H-89上调Meg-01细胞和HEL细胞的S6K1 Thr389磷酸化,但其对Thr421/Ser424磷酸化无影响,而且也不能阻断两者的多倍体化。表型分析显示3种细胞系处于不同的分化水平,即Dami细胞最高、HEL细胞次之、Meg-01细胞最低。结论SP600125诱导巨核细胞白血病细胞系的多倍体化依赖于不同分化程度的细胞系内S6K1对SP600125诱导磷酸化修饰的应答。

核糖体蛋白S6激酶β1的分子结构和理化性质分析

核糖体蛋白S6激酶β1(Ribosomal protein S6 kinaseβ1,RPS6KB1)是一个有价值的肝癌诊断和预后标志物,也是一个潜在的基因治疗分子靶点,但其致癌机制和预后价值仍未完全阐明。为了全面认识RPS6KB1,本文使用生物信息学手段,对RPS6KB1蛋白的序列同源性、组织表达、亚细胞定位、理化性质、空间结构及蛋白质相互作用网络进行分析。结果表明人RPS6KB1基因编码525个氨基酸组成的多肽,在进化过程中高度保守,属于PKc_like超家族,是酸性不稳定的亲水蛋白,无信号肽和跨膜区域。该蛋白定位于细胞核的可能性最大,主要二级结构为随机卷曲,存在磷酸化、乙酰化和泛素化位点。与RPS6KB1相互作用的蛋白主要是m TOR信号途径相关蛋白、PI3K信号途径相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白以及调控胰岛素水平相关蛋白。本文结果为进一步研究RPS6KB1的功能及致癌机制提供一定的参考。

马铃薯60S核糖体蛋白L28-1基因的生物信息学分析

以马铃薯与青枯菌互作过程中产生的一条EST为实验材料,初步推定该EST表达蛋白可能参与马铃薯青枯病的抗性。通过对这条上调表达的EST核酸构成、氨基酸的构成和该EST编码的可能蛋白质的高级结构进行初步的推理剖析、序列分析,结果表明:该EST的长度为601bp,其中部有429个碱基编码了含143个氨基酸的肽段,该小肽一端是明显的亲水的,一端为显著的疏水的,无信号肽,无二硫键,无膜穿透性,二级结构中含有的无规则卷曲比较多,有多个磷酸化位点,含保守结构域,经分析,与野生种潘那利番茄RPL28-1相似度最高,默示与野生种潘那利番茄RPL28-1拥有大致差不多的构造,发挥出差不多作用。因此以上结果可以为进一步研究该基因编码蛋白的具体功能和在青枯菌与马铃薯互作过程中发挥作用。

S6K1调控的蛋白表达图谱及其对乳腺癌细胞恶性表型的影响

目的:探究核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)所调控的蛋白表达图谱及其对乳腺癌细胞恶性表型的影响。方法:通过cBioPortal和GEPIA数据库分析S6K1基因在乳腺癌组织中的扩增及表达,并评估其表达对乳腺癌患者临床特征的影响;利用小干扰RNA在乳腺癌MCF7细胞中敲降S6K1,通过质谱技术检测S6K1所调控的蛋白表达图谱;采用细胞成球实验探究S6K1表达水平改变对乳腺癌细胞干性的影响;通过细胞迁移实验探究S6K1对乳腺癌细胞迁移能力的影响。结果:S6K1基因在乳腺癌组织中存在高频扩增现象,在浸润性乳腺癌中的扩增率高于非浸润性乳腺癌(P<0.05),且S6K1的高频扩增与患者的不良预后相关(P<0.01);S6K1在乳腺癌组织中的表达水平较癌旁组织高(P<0.01),而S6K1在乳腺癌不同临床分期中表达水平无明显差异(P>0.05)。质谱检测表明敲降S6K1后,乳腺癌MCF7细胞中有251个蛋白表达上调,224个蛋白表达下调;GO通路富集分析表明,差异表达蛋白参与了细胞质翻译、蛋白质稳定、干细胞群体维持、细胞迁移等多个生物学过程相关通路;与对照组相比,成球实验和迁移实验表明敲降S6K1可显著抑制乳腺癌细胞干性表型和迁移能力(P<0.01)。结论:S6K1在乳腺癌细胞中调控多个生物学过程相关蛋白的表达,敲降S6K1明显抑制了乳腺癌细胞的干性和迁移能力,表明S6K1可能成为乳腺癌治疗的新靶点。

宫颈癌组织中S6K1和S6K2的表达及其临床意义

目的探讨宫颈癌组织中核糖体蛋白S6激酶(S6K)1和S6K2的表达及其临床意义。方法经手术切除的宫颈癌组织94例、正常宫颈组织52例及宫颈上皮内瘤样病变(CIN)组织103例(CINⅠ33例、CINⅡ29例、CINⅢ41例),采用免疫组化法检测以上组织中S6K1和S6K2的表达情况,分析两者表达与宫颈癌临床病理参数的关系(年龄、淋巴结转移、分化程度、FIGO分期、脉管瘤栓、深肌层浸润及宫旁浸润),采用单因素分析和多因素分析影响宫颈癌预后的因素。结果宫颈癌组织中S6K1和S6K2阳性表达率均高于正常宫颈组织和CIN组织(P<0.05);正常宫颈组织和CIN组织中S6K1、S6K2阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。S6K1表达与分化程度和FIGO分期均有关(P<0.05),而S6K2表达与淋巴结转移、分化程度、FIGO分期和深肌层浸润均有关(P<0.05);S6K1、S6K2阳性者的5年生存率均低于阴性表达者(P<0.05)。多因素分析发现,淋巴结转移、分化程度、FIGO分期、宫旁浸润及S6K1和S6K2表达为影响宫颈癌预后的独立因素。结论宫颈癌组织中的S6K1和S6K2为高表达,均与分化程度和FIGO分期有关,且S6K1、S6K2阳性者的预后较差,可作为预测预后的影响因素。

食管癌组织中p-4EBP1、p-S6K1表达及意义

目的探讨p-4EBP1和p-S6K1在食管癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组化SP法检测45份食管癌组织及20份正常食管组织中p-4EBP1及p-S6K1表达。结果食管癌组织中p-4EBP1和p-S6K1表达阳性率分别为71.1%和66.7%,正常食管组织中阳性率分别为25.0%和35.0%,P均<0.05;二者在食管癌组织中的表达呈正相关P<0.05(r=0.381)。结论 p-4EBP1和p-S6K1在食管癌发生、发展中起促进作用;二者可作为食管癌诊断、靶向治疗及预后判断的重要生物学标记物。

S6K1沉默对宫颈癌细胞侵袭迁移及相关基因表达的影响

目的探讨RNA干扰核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)对人宫颈癌细胞Hela侵袭迁移及相关基因表达的影响。方法根据文献报道及siRNA设计原则合成靶向S6K1基因的siRNA,以阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体转染对数生长期Hela细胞(沉默组),同时设转染不针对任何基因随机序列的阴性对照组和转染试剂的空白对照组。转染48 h后采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测干扰效率,分别于转染24、48、72 h后采用WST法评价靶向沉默S6K1对Hela细胞增殖的影响,采用Transwell小室法检测经S6K1沉默后对Hela细胞侵袭迁移的影响,采用Western印迹法检测S6K1沉默后Hela细胞中人基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1、TIMP-2的蛋白水平。结果以空白对照组为参照(其S6K1 mRNA水平为1.000),阴性对照组的S6K1 mRNA水平为(1.027±0.034),差异无统计学意义(P>0.05),而沉默组的S6K1 mRNA水平(0.158±0.012)低于其余两组(P<0.05),相对于空白对照组的沉默率为(92.4±3.7)%。与空白对照组和阴性对照组比较,沉默组转染后的增殖率降低,迁移实验和侵袭实验中的穿膜细胞数均降低,MMP-2、MMP-9蛋白水平均降低,而TIMP-1、TIMP-2蛋白水平均升高(P<0.05)。结论 RNA靶向沉默S6K1表达可抑制人宫颈癌Hela细胞侵袭迁移,可能与其抑制MMP-2/9表达及促进TIMP-1/2表达有关。

p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在胃癌组织中的表达及意义

目的探讨磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、p-4EBP1及p-S6K1蛋白的表达水平与胃癌常见临床病理因素的关系。方法选择2014年3月—2016年6月在包头市肿瘤医院行手术切除的60例胃癌患者为观察组,对照组为癌旁组织(肿瘤边缘5 cm处)胃组织40例。采用免疫组化的方法检测60例胃癌组织及40例癌旁胃组织中p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的表达情况。结果 p-mTOR在观察组和对照组的阳性率分别为36.7%和10.0%,p-4EBP1在观察组和对照组的阳性率分别为80.0%和60.0%,p-S6K1在观察组和对照组的阳性率分别为26.7%和10.0%。p-mTOR、p-4EBP1和pS6K1在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在胃癌组织中过度表达可能是胃癌发生的重要机制之一。

基于mTOR/S6K1通路探究CXCR3对糖尿病肾病足细胞损伤、凋亡、自噬的影响

目的 探究趋化因子受体(CXCR)3对糖尿病肾病足细胞损伤、凋亡、自噬的影响及其作用机制。方法 将分化成熟的小鼠肾脏足细胞MPC-5分为对照组,模型组,si-NC组和si-CXCR3组,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞24 h、48 h和72 h细胞活力,流式细胞法检测各组细胞凋亡水平,Western印迹检测细胞凋亡关键蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3表达水平,ELISA法检测各组细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8,肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,qPCR及Western印迹检测各组细胞自噬相关蛋白(beclin)1、人自噬相关蛋白(ATG)5及ATG7表达水平,同时检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/蛋白核糖体S6蛋白激酶(mTOR/S6K1)信号通路关键蛋白的蛋白表达水平及其磷酸化修饰水平。结果 与对照组相比,模型组和si-NC组细胞增殖受到显著抑制,并且随着时间增加抑制能力增强,与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞增殖显著提高(P<0.05);与对照组相比,模型组和si-NC组细胞凋亡均显著增加(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞凋亡显著降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组和si-NC组细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α释放显著增加(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α显著降低,但仍高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,模型组和si-NC组细胞自噬相关蛋白Beclin1、ATG5及ATG7表达水平显著降低,而与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组显著升高(P<0.05);与对照组相比,模型组和si-NC组细胞mTOR、S6K1蛋白表达水平显著升高,其磷酸化修饰也相应增加,而与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞mTOR,S6K1蛋白表达水平显著降低,磷酸化修饰也相应降低(P<0.05)。结论 沉默CXCR3可以提高小鼠肾足组细胞活性,降低细胞凋亡,减少炎症因子释放,对肾足细胞具有保护作用,其机制可能通过增强自噬,调控mTOR/S6K1信号通路活性及磷酸化修饰相关。

S6K1 C端自抑制假底物结构域磷酸化与Akt去磷酸化协同调节SP600125诱导巨核细胞系多倍体化

目的:探讨JNK抑制剂SP600125诱导巨核细胞白血病系多倍体化的调控机制。方法:用SP600125和3种抑制剂(PD184352、U0126和LY294002)处理Dami和CMK细胞,用点突变技术对核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)C端自抑制假底物结构域和疏水基序突变构建的S6K1质粒转染细胞,流式细胞术分析细胞的DNA倍性,Western印迹检测S6K1、MAPK和Akt蛋白的表达及磷酸化修饰位点的变化。结果:当单独使用3种抑制剂时,对Dami和CMK细胞的倍性无影响。当SP600125与3种抑制剂联合时,尽管PD184352下调了p44/42 MAPK在Thr202/Tyr204位点的磷酸化,但其并不抑制SP600125诱导的Dami和CMK细胞的多倍体化;相反,U0126抑制SP600125诱导的Dami和CMK细胞的多倍体化,但并不下调p44/42 MAPK的磷酸化;而LY294002增加Akt的磷酸化,并阻断SP600125诱导的Dami和CMK细胞的多倍体化。这3种抑制剂均在SP600125诱导的多倍体Dami和CMK细胞中部分抑制S6K1的Thr421/Ser424磷酸化,但并不增加S6K1的Thr389磷酸化。转染S6K1突变质粒的Dami细胞,并没有对SP600125诱导的多倍体化产生影响,同时,无论是模拟磷酸化或去磷酸化的Thr389突变均对SP600125诱导的多倍体化无影响,且未显现出与LY294002的协同作用。C端自抑制假底物结构域突变质粒(S6K1-D3E)可以进一步阻断SP600125诱导的已经被LY294002部分阻断的Dami细胞多倍体化。结论:S6K1的C端自抑制假底物结构域磷酸化与Akt去磷酸化协同调节SP600125诱导巨核细胞白血病系的多倍体化。

mTOR-S6K1-Gli1信号通路在小鼠慢性瘙痒中的作用

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-核糖体蛋白S6激酶1-胶质瘤相关癌基因同源蛋白-1(mTOR-S6K1-Gli1)信号通路在慢性瘙痒中的作用。方法:取雄性昆明小鼠40只,分为空白对照组、溶剂对照组、致痒组、致痒+抑制剂组和致痒+抑制剂溶剂组,每组8只。后3组小鼠采用定期反复予恶唑酮溶液(乙醇为溶剂)涂抹腰背部皮肤的方法建立慢性瘙痒模型,溶剂对照组给予乙醇,致痒+抑制剂组和致痒+抑制剂溶剂组除致痒处理外,分别给予GANT61(Gli1抑制剂)溶液和相应溶剂鞘内注射。实验第0、7、9、12、14、16、19天记录涂抹恶唑酮溶液后30 min内小鼠搔抓次数;实验第19天,5组小鼠各取3只处死,取给药处皮肤行HE染色,观察局部病理变化,同时用Western blot法测定脊髓组织Gli1蛋白的表达;取溶剂对照组和致痒组小鼠各3只,采用免疫组化法观察mTOR、S6K1、Gli1蛋白在脊髓组织的定位。结果:与空白对照组和溶剂对照组相比,致痒组小鼠搔抓次数增加(P<0.05),局部皮肤出现广泛炎症细胞浸润,提示建模成功。与致痒组相比,致痒+抑制剂组小鼠搔抓次数减少(P<0.05),皮肤组织炎症细胞减少。与溶剂对照组相比,致痒组脊髓组织Gli1蛋白的表达升高(P<0.05),而致痒+抑制剂组无明显变化(P>0.05)。免疫组化结果显示mTOR、S6K1、Gli1主要表达在致痒组小鼠脊髓背角浅层。结论:mTOR-S6K1-Gli1信号通路可能参与了慢性瘙痒的发生。

mTOR-4EBP1/p70S6K1信号通路在良、恶性胸腔积液中的表达研究

目的探讨雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-真核启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)/核糖体蛋白S6激酶1(p70S6K1)信号通路在良、恶性胸腔积液中的表达情况,为恶性胸腔积液的发生机制及诊疗靶标研究提供新思路、新方法。方法选取恶性胸腔积液作为恶性测定组(44例),良性胸腔积液作为良性对照组(44例),实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测mTOR、4EBP1及p70S6K1mRNA表达情况,Western blot检测mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、4EBP1、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)、p70S6K1及磷酸化p70S6K1(p-p70S6K1)蛋白表达情况。结果RT-qPCR结果显示,恶性测定组中mTOR、4EBP1及p70S6K1 mRNA表达水平明显高于良性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blot结果显示,恶性测定组中p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K1蛋白表达水平明显高于良性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组mTOR、4EBP1、p70S6K1蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论mTOR-4EBP1/p70S6K1信号通路是通过激活mTOR,调节下游4EBP1、p70S6K1靶蛋白的活性,从而调节胸腔积液中恶性肿瘤细胞的表达。

p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌组织中的表达及临床意义

研究p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌组织中的表达及临床意义。选择2015年3月至2017年8月在包头市肿瘤医院进行手术切除的60例乳腺癌组织为观察组,对照组为癌旁组织40例。采用免疫组化方法检测60例乳腺癌组织及40例癌旁组织中p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的表达情况。p-mTOR在观察组和对照组阳性率分别为71.7%和42.5%;p-4EBP1在观察组和对照组阳性率分别为26.7%和10.0%;p-S6K1在观察组和对照组阳性率分别为45.0%和12.5%;p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌组织中的表达水平均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。试验结果表明,p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌组织中过度表达可能是乳腺癌发生发展的重要机制之一。

树豆叶醇提物通过mTOR/S6K1降低T1DM小鼠胰岛素抵抗

目的探究树豆叶醇提物对1型糖尿病(T1DM)小鼠胰岛素抵抗(IR)的影响及相关机制。方法将60只小鼠随机分为对照组、模型组及树豆叶醇提物低、中和高剂量组,每组10只。树豆叶醇提物低、中、高剂量组均用多次小剂量注射脲佐菌霉素(STZ)方法建立小鼠的1型糖尿病(T1DM)模型,T1DM模型建立成功后,分别给予树豆叶醇提物50、100、150 mg·kg^(-1)·d^(-1)及等量羧甲基纤维素钠(CMCNa)灌胃处理,每日1次,连续4周,模型组及对照组于同时间给予等量CMCNa灌胃处理,期间观察各组小鼠一般情况;测定各组小鼠空腹血糖(FPG)、血清胰岛素(INS)水平;以胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)评估β细胞功能;以稳态评估模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);以定量胰岛素敏感性检测指数(QUICKI)评价胰岛素敏感度;实时荧光定量PCR法检测小鼠胰腺组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体S6激酶1(S6K1)mRNA表达;免疫印迹法检测大鼠胰腺组织中mTOR、S6K1通路蛋白表达。结果模型组小鼠皮毛松散,毛色发黄、无光泽,精神萎靡,嗜睡,时常扎堆,活动减弱,反应迟钝,多饮、多食和多尿,尿色偏黄,体质量增加较快;树豆叶醇提物3组大鼠一般情况比模型组小鼠有不同程度改善,其中高剂量组改善最明显。与对照组比较,模型组大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平、胰腺组织中mTOR、S6K1 mRNA及其蛋白水平均升高(P<0.05),HOMA-β和QUICKI水平降低(P<0.05);与模型组比较,树豆叶醇提物3组大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平、胰腺组织中mTOR、S6K1 mRNA及其蛋白水平均降低,HOMA-β和QUICKI水平升高(P<0.05),呈剂量依赖性。结论树豆叶醇提物能够降低T1DM小鼠血糖水平,降低胰岛素抵抗进而增加胰岛素敏感性,可能是通过抑制mTOR/S6K1通路活化实现的。

MST1在帕金森细胞模型中的作用及其机制研究

目的探讨沉默哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)基因对帕金森病中多巴胺能神经元细胞作用的影响。方法培养PC12细胞并诱导分化为神经元,将神经元分为对照组、1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)组、MST1 SiRNA+MPP+组、MST1SiRNA组,转染后培养48 h,采用Western blot法检测神经元细胞MST1、自噬启动蛋白1(ULK1)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)的蛋白表达;采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖试剂盒检测细胞内丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性。结果转染后,MST1 SiRNA组神经元细胞中MST1蛋白表达明显减少(P<0.001)。与对照组相比,MPP+处理后能够明显抑制PC12细胞的增殖(P<0.01),增加MDA含量,抑制SOD、CAT活性并降低GSH含量(P<0.01),增加MST1和ULK1蛋白表达,抑制p-S6K1蛋白表达(P<0.01)。与MPP+组相比,MST1 SiRNA转染后能够有效改善MPP+对PC12细胞增殖的抑制作用(P<0.05),同时降低MDA的含量,增加GSH含量和SOD、GSH、CAT的活性(P<0.01),降低MST1和ULK1的蛋白表达,增加p-S6K1的蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论沉默MST1基因能够抑制氧化应激、促进细胞增殖以及发挥神经元的保护作用。

秦皮乙素经p70S6K/4E-BP1信号通路抑制人结肠癌细胞增殖和迁移的作用机制研究

目的:探讨秦皮乙素经核糖体蛋白S6激酶/4E结合蛋白-1(p70S6K/4E-BP1)信号通路抑制人结肠癌细胞增殖和迁移的作用机制。方法:设HCT116细胞组、氟尿嘧啶组(20μg·ml^-1)、秦皮乙素低(40μg·ml^-1)、高(80μg·ml-1)剂量组,置于CO2培养箱(37℃、5%CO2、2%O2、93%N2)。以上各组每孔设6个平行样,培养72 h。培养结束后,MTT法测定细胞增殖情况,流式细胞仪测定细胞凋亡水平,Transwell Chamber测定迁移水平,RT-PCR法及WEST-BLOT法测定细胞p70S6K、4E-BP1mRNA与蛋白表达水平。结果:氟尿嘧啶组、秦皮乙素低、高剂量组存活率、穿膜数、P70S6K、4E-BP1 mRNA和蛋白水平显著低于HCT116细胞组,细胞凋亡率显著高于HCT116细胞组(P<0.05)。秦皮乙素低、高剂量组存活率、穿膜数、P70S6K、4EBP1 mRNA和蛋白水平显著高于氟尿嘧啶组,细胞凋亡率显著低于氟尿嘧啶组(P<0.05)。秦皮乙素低、高剂量组间各指标差异有统计学意义(P<0.05)。结论:秦皮乙素能抑制结肠癌HCT116细胞增殖、迁移,诱导HCT116细胞凋亡,其机制与秦皮乙素抑制p70S6K、4E-BP1mRNA和蛋白表达有关。

核糖体蛋白S6激酶1基因C19012T多态性与农村超重人群血脂水平相关

目的:研究核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)基因C19012T的单核苷酸多态性(SNP)在中国汉族农村人群中与肥胖的相关性,及C19012T与超重人群和正常体重人群血清HDL-C,LDL-C,TC的关系。方法:根据中国成人超重和肥胖症预防与控制指南,以体质指数(BMI)>24为中国成人超重的界限。在1097例超重和699例体重正常研究对象中应用多聚酶链反应,限制性内切酶酶切进行基因分型,测定血清HDL-C,LDL-C,TC,TG,葡萄糖。结果:SNPC19012T的基因型、等位基因频率分布在超重组和体重正常组中差异无统计学意义(P>0.05);超重组中C19012T基因TT,CT,CC基因型的TC,LDL-C水平分别为(5.9±1.2)、(5.8±1.3)、(5.6±1.1)mmol/L和(3.5±1.0)、(3.3±0.9)、(3.2±0.9)mmol/L,基因型组间比较均差异有统计学意义(P=0.0213,P=0.0141),校正年龄,性别,BMI和其他危险因素(吸烟饮酒等)后仍差异有统计学意义(P=0.0150,P=0.0087)。然而,体重正常组中未发现基因型组间血脂水平变化差异有统计学意义。结论:S6K1基因C19012T基因型及等位基因分布在超重人群和体重正常人群之间差异无统计学意义,C19012T分布与中国农村超重人群血脂水平有关。