核糖体S6蛋白激酶4基因在多种肿瘤中的表达及其生物信息学分析

目的探讨在不同肿瘤细胞中核糖体S6蛋白激酶4(ribosomal protein S6 kinase 4,RSK4)的表达谱是否存在差异,以及预测可能存在的蛋白亚型及其生物学特性。方法提取神经胶质瘤细胞GL261、卵巢癌细胞ID8、乳腺癌细胞4T1和168FARN、结肠癌细胞mc38和CT26、胃癌细胞MFC和肺癌细胞LLC1的RNA,采用RT-PCR技术检测RSK4的表达及其剪接异构体,生物信息学分析RSK4的生物学特征及其功能。结果RT-PCR结果显示在GL261、4T1、mc38、CT26、MFC和LLC1中均表达RSK4,且不同的肿瘤细胞中表达了多个剪接异构体,开放阅读框分析RSK4可能至少编码11个蛋白亚型;二级结构分析显示,这些剪接异构体编码的蛋白亚型均由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,且保守结构域均相同;蛋白互作网络富集分析显示,RSK4主要通过mTOR信号通路和突触持续增强等信号通路在核质和胞浆中发挥激酶的活性。结论RSK4在不同的肿瘤细胞中存在不同的表达谱,可能产生多种氮端不同的蛋白异构体,能够通过多种信号通路参与不同的生物学途径。

日本沼虾核糖体蛋白S3a基因cDNA的克隆、表达及其在卵巢发育中的功能初探

为了探究日本沼虾(Macrobrachium nipponense)核糖体蛋白S3a(MnRPS3a)在其卵巢发育中的功能,利用cDNA末端快速扩增(RACE)-PCR技术获得了MnRPS3a基因的全长cDNA序列,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫荧光(IF)技术分别进行了该基因的表达模式和蛋白定位分析。结果显示,MnRPS3a基因cDNA全长902 bp,共编码266个氨基酸;MnRPS3a与墨吉对虾(Fenneropenaeus merguiensis)RPS3a氨基酸序列相似性最高,进化上的亲缘关系也最近;在不同组织中,MnRPS3a基因在肌肉中的表达量最高;在不同发育阶段卵巢中,MnRPS3a基因在Ⅰ期卵巢中的表达量最高;注射5-羟色胺(5-HT)能诱导日本沼虾卵巢MnRPS3a和卵黄蛋白原(Vg)基因表达升高,而注射多巴胺(DA)则抑制这2个基因表达。MnRPS3a蛋白主要定位于日本沼虾Ⅰ期和Ⅱ期卵巢的滤泡细胞、Ⅲ期和Ⅳ期卵巢卵母细胞的细胞质中。结果表明MnRPS3a可能在日本沼虾卵巢发育调控中发挥重要的作用。

人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的:扩增人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR,以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法:采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列,利用DNA重组技术构建正、反义真核表达载体,经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR,筛选正、反义基因稳定转染细胞,RNA斑点杂交法检测正、反义稳定转染细胞mRNA水平的变化。结果:从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA,RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列,并经测序证实;目的基因按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),并经酶切鉴定证实;经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞,反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞,G418筛选获得稳定转染细胞;RNA斑点杂交试验证实:正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调,反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调。结论:成功克隆了人RPS13编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体。在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞株,正义转染细胞中RPS13mRNA表达明显增加,反义转染细胞中表达明显受抑。

E．coli核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制λN基因表达的分子机制

本文利用ＰＣＲ方法克隆了Ｅ．ｃｏｌｉＴ８３依赖链霉素（ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｓｍ＾ｄ）菌株中编码突变的核糖体蛋白质Ｓ１２的ｒｐｓＬ＾ｄ基因，并进行了ＤＮＡ序列分析，发现第４２位密码子由编码赖氨酸（Ｌｙｓ，Ｋ）的ＡＡＡ变为编码谷氨酰胺（Ｇｌｎ，Ｑ）的ＣＡＡ。依据Ｇａｒｎｉｅｒ原理预测了突变对Ｓ１２蛋白质二级结构形成趋势的影响，结果表明。

人核糖体蛋白S13编码基因的克隆及其正反义真核表达载体的构建

目的 :克隆人核糖体蛋白S13(RPS13)cDNA片编码区全长序列 ,构建其正、反义真核表达载体 ,以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法 :采用RT -PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列 ,DNA重组技术构建其正、反义真核表达载体。结果 :RT -PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列 ,经DNA序列分析 ,证实与文献报道的人RPS13编码区序列一致。目的基因分别按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3 1(+) ,并经酶切鉴定证实。结论 :成功克隆了人RPS13编码区全长基因序列 ,并构建了正。

家蝇核糖体蛋白S18基因的克隆及表达模式研究

旨为证实核糖体蛋白S18(Ribosomal protein S18,RPS18)基因在家蝇体内的表达稳定性。从构建家蝇幼虫c DNA文库中筛选到核糖体蛋白S18基因,以c DNA为模板,通过PCR扩增,获得RPS18基因完整编码序列(登录号:KT006855),运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建p ET28a/RPS18重组质粒,转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化,制备多克隆抗体并进行抗血清特异性分析。应用RT-PCR、q PCR及Western-blot从转录、翻译水平上分析RPS18基因在家蝇不同发育时期和三龄幼虫不同组织中的表达情况。结果表明,RPS18基因ORF全长459 bp,编码152个氨基酸,理论分子量为17 590.5 Da,等电点为10.48;将构建的重组质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,纯化得到RPS18蛋白;将该纯化蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体,His单抗鉴定及抗血清特异性分析显示,其均可见单一条带;RT-PCR、q PCR及Westernblot分析表明,RPS18基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均能够稳定表达;综合分析表明,该基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均保持较好的表达稳定性。

基于S7核糖体蛋白基因部分序列的10种石鲈科鱼类的系统发育关系

分析了石鲈科4属10种鱼类S7核糖体蛋白基因内含子1部分序列特征,采用MP法和NJ法构建系统发育树。结果表明,在分子系统树上,10种石鲈科(Haemulidae)鱼类共组成两大类群,其中髭鲷属(Hapalogenys)鱼类和胡椒鲷属(Plectorhynchus)鱼类聚成一类群,石鲈属(Pomadasys)鱼类和仿石鲈属(Haemulon)鱼类聚成一类群,两类群再聚成一支,10种石鲈科鱼类构成单一分支类群。髭鲷属鱼类跟胡椒鲷属鱼类的亲缘关系较近。基于遗传距离分析表明,相对于石鲈属,髭鲷属鱼类跟仿石鲈属鱼类的遗传距离较小。因此,研究结果支持髭鲷属的分类地位是介于胡椒鲷属和仿石鲈属之间,未能从石鲈科中独立出来形成髭鲷科(Hapalogeniidae)。

S7核糖体蛋白基因片段序列变异与花鲈属鱼类系统发育研究

对中国和日本海域花鲈属的3个种:花鲈(Lateolabrax maculatus)、鲈鱼(L. japoni-cus)和高体鲈(L. latus)的S7核糖体蛋白基因片段序列进行了扩增和序列测定,分析比较了3个种23个个体间的序列差异。在456bp的S7核糖体蛋白基因片段中,3个高体鲈个体中出现了3种单倍型,种内个体间有2个碱基差异;7个花鲈个体中出现了7种单倍型,种内个体间有21个碱基差异;13个鲈鱼个体中出现了12种单倍型,种内个体间有22个碱基差异。结果表明,花鲈属S7核糖体蛋白基因片段序列具有丰富的遗传信息,在亲缘关系较近的物种间也存在显著的序列差异,基于S7核糖体蛋白基因片段序列的NJ和ME系统树经1000次重复抽样检验后得到相似结果,表明S7基因内含子2是适合于研究分子系统发育的分子标记。利用Modeltest选取最佳核苷酸替代模型构建的NJ树表明:花鲈属鱼类由高体鲈分化,花鲈与鲈鱼的亲缘关系很近,而与高体鲈的亲缘关系较远。

球毛壳菌60S核糖体蛋白L10a基因克隆与特性分析

用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)XP_322380和赤霉菌(G ibberella zeae)PH-1(EAA76971)的60S核糖体蛋白L10 a基因(60S ribosom al prote in L10 a,RPL10 a)蛋白序列对球毛壳菌(Chaetom ium globosum)ESTs序列数据库进行tB lastn检索,获得了球毛壳菌RPL10 a cDNA序列。cDNA序列长765 bp,开放阅读框654 bp,编码217个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为23.9 kD。B lastP分析表明该基因氨基酸序列与粗糙脉胞菌相似最高为89%;与玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)相似性最低为78%。cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY669070,AAT74578)。

基于S7核糖体蛋白基因部分序列的7种金线鱼属鱼类分子系统进化关系

测定了7种金线鱼属(Nemipterus)及2种锥齿鲷属(Pentapus)鱼类S7核糖体蛋白基因(S7基因)内含子1部分序列,以二线眶棘鲈(Scolopsis bilineatus)做为外类群初步探讨了其分子进化关系。测序所得S7部分序列为734-746 bp,序列比对后得到同源序列743 bp。其中保守位点386个,变异位点351个,简约性信息位点289个。A+T含量(54.1%)高于G+C含量(45.9%)。基于Kimura 2-Parameter模型计算出7种金线鱼的遗传距离为0.042-0.294。S7序列存在大量碱基插入与缺失,其中日本金线鱼(Nemipterus japonicus)与苏门答腊金线鱼(N.mesoprion)在第167、182、474、608、662 bp位置,金线鱼(N.virgatus)与印度洋金线鱼(N.bipunctatus)第227、332、401、604 bp的位置具有相同的碱基插入缺失特征,且具有种类特异性。最后利用最大似然法(ML)与贝叶斯分析(BI)构建分子系统进化树,7种金线鱼聚在一起,其中日本金线鱼与苏门答腊金线鱼聚为一支,金线鱼、深水金线鱼和印度洋金线鱼聚成一支。结论认为需要结合多方面的形态与分子证据,才能进一步明确金线鱼属鱼类的系统进化关系。

S7核糖体蛋白基因序列变异与亚科鱼类的单系性研究

使用分子生物学的方法对亚科鱼类的单系性进行了探讨。通过PCR方法 ,获得了 13种鲤科鱼类S7核糖体蛋白基因第 1内含子序列 ,其中包括 6种亚科鱼类。使用MEGA软件中的Neighbor Joining法和Most Parsimony法分别构建分支系统图。研究结果显示目前所确认的亚科鱼类实际上没有形成单系类群。其中属、波鱼属和低线属位于系统树基部 ,显示出原始性。而由细鲫属、马口鱼属和属构成的类群相对于亚科中的原始种类起源较晚 ,可能和较晚起源的东亚鲤科类群之间有更为密切的关系。

柞蚕核糖体蛋白基因S3a的克隆及表达分析

核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%～99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。

巴西橡胶树核糖体蛋白S5基因的克隆及生物信息学分析

核糖体蛋白S5是核糖体蛋白家族的重要成员,在核糖体中发挥重要作用。利用本实验室获得的部分序列设计引物,采用3'-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得一个核糖体蛋白S5基因的完整阅读框,该基因编码209个氨基酸的多肽,含有一个典型的真核生物核糖体蛋白S5结构域。在HbRPS5氨基酸序列中没有预测到跨膜区和信号肽,二级结构分析表明HbRPS5属于混合型蛋白。对14个RPS5系统进化分析表明,巴西橡胶树的RPS5基因在进化上具有保守性,与植物类拟南芥的RPS5基因亲缘关系最近,而与人和酵母等亲缘关系相对较远。该基因的克隆和生物信息学分析为深入研究其功能奠定了基础。

基于S7核糖体蛋白基因部分序列的石鲈属鱼类分子系统进化关系

基于核DNA分子标记S7核糖体蛋白基因内含子1部分序列对分布于南海及美洲,非洲,大洋洲等周边海区的石鲈属鱼类11种,结合石鲈亚科其他属如仿石鲈属,异孔石鲈属,八带石鲈属及锯鳃石鲈属等21种鱼类的系统进化关系进行了研究分析。利用最大简约法以及贝叶斯法构建了系统进化树。进化树上,石鲈属的种类并没有形成一个单系,除了大斑石鲈,断斑石鲈等6种石鲈属鱼类聚成一石鲈属的分支外,其他石鲈属种类都位于进化树的不同位置。侧扁石鲈与八带石鲈聚在一起,大棘石鲈与异孔石鲈属聚在一起。红海石鲈与纵带石鲈与仿石鲈属的种类关系较近,佩氏石鲈最先分化出来,位于整个石鲈亚科分支基部。该分类关系与其各自的地理分布情况有着一定的联系。

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因(TaRPL8),探索其应用前景。方法用RT-PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPL8基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPL8基因可在大肠埃希菌BL21/DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。

粘虫核糖体蛋白S11基因cDNA的克隆和序列分析

【目的】克隆和鉴定粘虫核糖体蛋白S11(Ribosomal Protein S11,RPS11)基因,为昆虫核糖体蛋白功能的研究提供基础资料。【方法】运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫cDNA为模板,对RPS11基因进行克隆,获得其全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对RPS11基因全长cDNA序列及推测得到的RPS11蛋白氨基酸序列进行分析,构建其系统进化树。【结果】获得的粘虫核糖体蛋白S11基因(RPS11)cDNA序列长度为521 bp,其中包括26 bp的5′非编码区、36 bp的3′非编码区和459 bp的开放阅读框,编码一个由152个氨基酸组成的蛋白,其具有核糖蛋白S17蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫RPS11蛋白的理论分子质量为17.737 9 ku,等电点为10.63,富含6种类型的特定功能位点,与同属夜蛾科的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的RPS11蛋白相似性高达97%。用Neigh-bor-joining(NJ)法构建基于RPS11氨基酸序列的系统发育树,结果显示,粘虫RPS11与烟芽夜蛾(H.virescens)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)等3种鳞翅目昆虫的亲缘关系较近。【结论】成功获得了粘虫RPS11基因全长序列(GenBank登录号为GQ222274),由其编码的核糖体蛋白RPS11属于核糖蛋白S17蛋白家族。

绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的5个cDNA及其下游非编码区

通过3'RACE克隆策略获得绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)核糖体失活蛋白(ribosome-inac-tivating protein,RIP)Gynostemmin的5个cDNA序列gynostemminⅠ￣Ⅴ及其下游非编码区(3'untranslatedregion,3'UTR)。它们的编码区长度除gynostemminⅡ为825bp外,其余均为831bp。其下游非编码区的长度分别为279、174、170、161和171bp。在3'UTR中,gynostemminⅠ比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件,其mRNA的稳定性可能因此受到影响。

细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究(一)──应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)

目的：应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)。方法：将S3a cDNA序列插入到pGEX-4T-2质粒中，制备GST/S3a融合蛋白及其抗体。结果：S3a cDNA序列在Xho I位点上插入到pGEX-4T-2质粒中，形成重组的pGEX-4T-2/S3a质粒。结论：pGEX-4T-2质粒编码GST蛋白基因，在IPTG的诱导下可以表达GST/S3a融合蛋白。为下一步实验奠定了基础。

巴西橡胶树核糖体蛋白S6基因的克隆及生物信息学分析

核糖体蛋白S6是核糖体蛋白家族的重要成员,在核糖体中发挥重要作用。利用农业部橡胶生物学重点开放实验室获得的部分序列设计引物,采用3-′RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得一个核糖体蛋白S6基因的完整阅读框,该基因编码249个氨基酸的多肽,含有一个典型的真核生物核糖体蛋白S6结构域。在HbRPS6氨基酸序列中没有预测到跨膜区和信号肽,二级结构分析表明:HbRPS6属于混合型蛋白。对10个RPS6系统进化分析表明:巴西橡胶树的RPS6基因在进化上具有保守性,与植物类玉米的RPS5基因亲缘关系最近,而与动物和酵母的亲缘关系相对较远。该基因的克隆和生物信息学分析为深入研究其功能奠定了基础。

泛素—核糖体蛋白S27a基因的克隆、测序及其原核GST融合表达和纯化

目的:克隆泛素—核糖体蛋白S27a基因并在大肠杆菌细胞内高效表达,并纯化该蛋白。方法:从HL-60细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得泛素/核糖体蛋白S27a的编码区cDNA,将HindⅢ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的GST融合表达载体pGEXGST构建为融合表达质粒pGEXGST-S27a,转化感受态的大肠杆菌JM109实现质粒的扩增与纯化,经DNA测序确证后再转化感受态表达菌BL21,表达并纯化出融合蛋白。结果:(1)PCR扩增获得长约560bp的泛素—核糖体蛋白S27a基因片段。(2)SDS-PAGE证明,泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白的分子量为43kDa。(3)通过过柱法纯化出泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白。结论:成功克隆出泛素-核糖体蛋白S27a的基因,并在表达菌BL21中可见GST融合表达,并纯化出该融合蛋白,为进一步研究其功能获得了候选蛋白分子。