家蝇核糖体蛋白S18基因的克隆及表达模式研究

旨为证实核糖体蛋白S18(Ribosomal protein S18,RPS18)基因在家蝇体内的表达稳定性。从构建家蝇幼虫c DNA文库中筛选到核糖体蛋白S18基因,以c DNA为模板,通过PCR扩增,获得RPS18基因完整编码序列(登录号:KT006855),运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建p ET28a/RPS18重组质粒,转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化,制备多克隆抗体并进行抗血清特异性分析。应用RT-PCR、q PCR及Western-blot从转录、翻译水平上分析RPS18基因在家蝇不同发育时期和三龄幼虫不同组织中的表达情况。结果表明,RPS18基因ORF全长459 bp,编码152个氨基酸,理论分子量为17 590.5 Da,等电点为10.48;将构建的重组质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,纯化得到RPS18蛋白;将该纯化蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体,His单抗鉴定及抗血清特异性分析显示,其均可见单一条带;RT-PCR、q PCR及Westernblot分析表明,RPS18基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均能够稳定表达;综合分析表明,该基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均保持较好的表达稳定性。

胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因(18S rDNA)扩增及序列变异初步研究

采用PCR扩增、文库构建、限制性片段长度多态性分析、序列分析和系统学分析等方法,初步研究了夏季胶州湾上层海水浮游桡足类核糖体小亚基RNA基因(18SrDNA)约1.5kb片段的序列变异。从浮游生物混合DNA中选择性扩增桡足类18SrDNA,建立桡足类18SrDNA变异类型文库,并从文库中随机挑选的30个克隆进行分析。结果表明,VspI限制性内切酶能将这些克隆分成频率分别为0.17、0.23和0.6的3种操作分类单元(OTUs),遗传多样性指数达到0.95。3条OTU代表克隆序列与甲壳纲桡足亚纲核苷酸差异数在75.4—97.8之间,而与其他亚纲的差异都高于100。3条OTU代表克隆序列均属于桡足亚纲,其中,AY437861和AY437862属于哲水蚤目。3条OTU代表克隆序列可分为2个高变异区和3个相对保守区,其GC%分别为47.37%、48.16%和48.57%。研究结果表明,混合DNA提取方法简单,设计的引物可选择性地扩增浮游桡足类18SrDNA,根据18SrDNA序列序列变异描述浮游桡足类多样性是可行的。研究结果也为在浮游桡足类分类中引入18SrDNA序列奠定了基础。

血吸虫种株间18S小亚基单位核糖体核酸基因的同源性及其PCR法检测单个尾蚴的敏感性

目的探索日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫18S小亚基单位核糖体核酸基因(18S-rRNA)序列的同源性及采用该基因建立PCR法检测水体中低密度血吸虫尾蚴的可能性。方法提取日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫基因组DNA,采用PCR方法检测上述基因组中同一目的DNA片段,比较其同源性;分别以经沸水加热处理、氨水处理及NaOH、HCl、乙醇沉淀处理和未经处理的单个尾蚴标本为模板,采用PCR法扩增,比较对单个尾蚴的检出率。结果以日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株和曼氏血吸虫基因组DNA为模板,均能扩增出长度为469bp的DNA片段。经氨水处理和NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的单个尾蚴标本,PCR方法均能扩增到目的基因。在未经处理或沸水加热处理的单个尾蚴标本中,仅有50%标本能扩增到目的基因。结论血吸虫不同种株间18S-rRNA基因具有广泛同源性。经氨水处理或NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的标本,采用PCR法对低密度尾蚴的检出率高于未经处理或经沸水加热处理的标本。

多头带绦虫湖南分离株核糖体18S基因系统进化分析

为阐明多头带绦虫湖南分离株核糖体小亚基(18S rRNA)基因序列的遗传变异情况,并用18S序列构建多头带绦虫与其他带科绦虫的种群遗传关系。利用PCR技术扩增多头带绦虫的18S基因,应用Clustal X1.81程序对序列进行比对,再利用Mega4.0程序进行NJ法绘制种系发育树。结果显示:所获得的18S基因序列长度一致,均为1 080 bp,基因序列存在一定的遗传差异。种系发育分析结果显示,所有的多头带绦虫分离株与已知多头带绦虫位于同一分支。多头带绦虫18S基因序列种内相对保守,种间差异较大,可以作为种间遗传变异研究的标记,从而为多头带绦虫的群体遗传研究奠定基础。

运用核糖体18S rRNA基因序列鉴别两种红藻

Chondus crispus（皱波角叉菜）和Mastocarpus stellatus是2种形态特征和生境极为相似的红藻，依据外部形态特征很难将它们鉴别开来。本研究测定和分析了这2种红藻的核糖体18SrRNA基因全序列，结果表明：M．stellatus的18SrRNA基因序列长度和A，T，G，C4种碱基的含量与C．crispus差异甚小，但核苷酸差异率达到了2．75％，远超过角叉菜属种内和种间的水平（0．00％～0．45％）。另外，根据该基因序列构建的系统进化树也能清楚的将C．crispus和M．stellatus区别开来，表明核糖体18SrRNA基因可从种的分类水平上对这2种红藻进行分子鉴定，具有广阔的分类学应用前景。

约氏疟原虫孢子增殖特异18S核糖体DNA部分序列及其检测应用

目的 测定约氏疟原虫 By2 6 5株 S型 18S r DNA序列 ,并用于蚊体内疟原虫的分子检测。 方法 根据伯氏疟原虫 S型 18S r DNA序列 ,合成一对保守区引物 ,从感染约氏疟原虫 7d后的斯氏按蚊中肠组织逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)扩增约氏疟原虫 S型 18S r RNA片段并测序 ,据此序列合成约氏疟原虫 S型 18S r D-NA种型特异引物 ,与保守的逆转录引物配伍 ,对感染后 1～ 7d蚊体内约氏疟原虫 S型 18S r RNA表达量进行RT- PCR检测。 结果 扩增的约氏疟原虫 S型 18S r DNA片段长度为 92 0 bp,与伯氏疟原虫 S型和约氏疟原虫A型的同源性分别为 95 .3%和 94.0 %。 RT- PCR检测结果显示卵囊密度与扩增带强度明显一致 ,且敏感性高于解剖镜检方法。感染后 3d即可检出蚊体内疟原虫 ,而此时卵囊在光镜下尚难识别。 结论 测定了约氏疟原虫S型 18S r DNA的部分序列 ,将其作为分子指标 ,可早期、敏感、特异和半定量检测蚊体内感染的疟原虫。

胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因序列变异分析

设计了桡足类特异引物,从胶州湾浮游生物混合DNA中选择性扩增了浮游桡足类18S核糖体RNA基因片段,建立了该基因片段变异类型文库。从文库中随机选择83个克隆,对所含的18S核糖体RNA基因片段进行了V .spI和BshNIRFLP分析,发现5种操作分类单元(OTU) ,并对这些OTU的代表克隆进行了测序。分析发现获得的克隆均属于桡足亚纲。根据各OTU覆盖的克隆数计算的胶州湾浮游桡足类遗传多样性指数为0 .96。特定基因序列分析能提供易整合、易比较的多样性数据,也是建立浮游生物群落结构分子生物学剖分方法的基础和形态分类的补充。

白背飞虱18S核糖体基因克隆及系统发育

以白背飞虱Sogatella furcifera长翅雌虫为材料,提取其基因组DNA,以已知的半翅目昆虫18S rDNA全序列和白背飞虱18S rDNA部分序列为参考,通过PCR扩增出白背飞虱18S rDNA的未知部分序列,最后通过拼接,首次得到了白背飞虱18S rDNA的全长序列,长度为1 891 bp,碱基组成比例均衡,分别为:24.1%A;23.7%C;27.7%G;24.5%T。将此全长序列与分属6个目(半翅目、双翅目、膜翅目、直翅目、鞘翅目、等翅目)昆虫的18S rDNA序列进行比较,一共发现有4个保守区域,其中第二个区域发生插入或缺失的情况最少。以18S rDNA第二保守区域进行系统发育分析,发现原同翅目昆虫多数均与半翅目昆虫菜蝽亲缘关系较近,但原同翅目飞虱科昆虫,如白背飞虱、褐飞虱则与半翅目昆虫菜蝽的亲缘关系较远,表明近年来将原同翅目昆虫全部划归为半翅目还有待商榷之处。

犬钩虫核糖体蛋白L36及S4A全长cDNA克隆与蛋白特性分析

目的克隆犬钩虫Ancylostoma caninum核糖体蛋白L36(AcaRPL36)及S4A(AcaRPS4A)全长cDNA序列,并对编码的蛋白特性进行分析,探讨它们在研究系统发育中的应用。方法运用3′RACE技术并结合RT-PCR技术先后分别从犬钩虫中克隆核糖体蛋白L36及S4A的部分序列,经拼接后获得全长cDNA序列。用BlastP搜索相似性序列及保守结构域,所获序列在GenBank中登记,并用Neighbor-Joining(NJ)法构建基于RPL36及RPS4氨基酸序列的系统发育树。结果AcaRPL36全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490128)为390 bp,开放阅读框为315 bp,编码104个氨基酸组成的蛋白;AcaRPS4A全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490129)为880 bp,开放阅读框为786bp,编码261个氨基酸组成的蛋白。RPL36及RPS4序列较保守,与Caenorhabditis elegans等的亲缘关系较近的生物,在系统发育树中的遗传距离也较近。结论首次获得犬钩虫RPL36及RPS4A,RPL36和RPS4可能作为分子指标应用于研究生物系统发育。

血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平联合检测对急性重症胰腺炎患者预后的预测价值

目的探究入院时血清饥饿素(Ghrelin)、S100钙结合蛋白A12(S100A12)、白介素18(IL-18)水平与急性重症胰腺炎(ASP)严重程度的相关性及其联合检测对ASP患者预后的预测价值。方法选取2022年5月至2023年5月郑州大学第一附属医院收治的90例ASP患者设为重症组,另选取同一时段收治的90例非重症急性胰腺炎(AP)患者设为非重症组。比较两组患者入院时的血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平、严重程度评分(BISAP评分、APACHEⅡ评分),采用Pearson相关性分析法分析重症组患者入院时血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平与严重程度评分的相关性。重症组患者随访30 d,根据预后情况分为生存亚组62例和死亡亚组28例,比较两亚组患者入院时的血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析入院时血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平联合检测对ASP患者预后的预测价值。结果重症组患者入院时的血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平,BISAP、APACHEⅡ评分分别为(642.87±53.61)ng/mL、(364.25±46.59)ng/mL、(47.38±5.41)μg/L、(4.63±0.68)分、(10.17±1.06)分,明显高于非重症组的(437.29±38.24)ng/m L、(197.68±31.67)ng/m L、(20.15±3.36)μg/L、(1.97±0.45)分、(4.35±0.89)分,差异均有统计学意义(P<0.05);Pearson相关性分析结果显示,重症组患者入院时的血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平与BISAP、APACHEⅡ评分呈正相关(P<0.05);死亡亚组患者入院时的血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平分别为(708.29±72.39)ng/mL、(428.95±52.61)ng/mL、(55.26±7.20)μg/L,明显高于生存亚组的(613.33±48.51)ng/mL、(335.03±41.38)ng/mL、(43.82±5.19)μg/L,差异均有统计学意义(P<0.05);ROC曲线分析结果显示,入院时血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平联合检测预测ASP患者死亡的曲线下面积(AUC)为0.859,高于血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平单独检测的0.724、0.729、0.716(P<0.05)。结论ASP患者入院时血清Ghrelin、S100A12、IL-18水平明显升高,与病情严重程度密切相关,其联合检测对ASP患者预后具有较高的预测效能,可作为早期评估ASP患者病情严重程度及预后的血清学标志物,为临床早期评估ASP患者病情和预后判断提供参考依据。

核糖体蛋白S26的研究进展

核糖体蛋白(ribosomal proteins,RPs)不仅在细胞内参与合成蛋白质,还具有多种核糖体外功能。核糖体蛋白S26(RPS26)位于核糖体小亚基,其功能障碍与多种疾病密切相关。近年来,有关RPS26的研究主要在参与核糖体装配等核糖体功能方面,以及参与无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)、直接或间接调控重要的抑癌基因p53表达等核糖体外功能方面。多篇报道证实RPS26基因突变可引起戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfan anemia,DBA),而RPS26基因与Ⅰ型糖尿病的关系仍有争议。探索RPS26参与NMD机制在DBA发生中的作用有助于深入认识DBA发病机理,同时也可为完善SMaRT(spliceosome-mediated mRNA trans-splicing)技术等基因疗法提供帮助。此外,RPS26在癌症中的作用也值得进一步探索。

血清高迁移率族蛋白B1白细胞介素-18和-23 S100B及同型半胱氨酸和神经肽Y水平检测对缺血性脑卒中预后的影响

目的观察缺血性脑卒中患者血清高迁移族蛋白B1、白细胞介素-18和23、S100B蛋白、同型半胱氨酸以及神经肽Y水平的变化情况,分析其对预后的影响,为临床治疗提供帮助和指导。方法对我院2010-10—2013-04神经内科收治的100例新发缺血性脑卒中患者进行回顾性分析,通过荧光偏振免疫分析法等检测方法观察NPY、S100B蛋白、IL-18、IL-23、HMGB1以及Hcy水平与预后的相关性。结果 NPY、S100B蛋白、IL-18、IL-23水平随着病情进展,呈逐渐增加趋势,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。HMGB1以及Hcy指标水平变化同样也反映缺血性脑卒中患者的预后情况,且均能作为疾病死亡的独立危险因素,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论随着缺血性脑卒中患者的血清高迁移族蛋白B1、白细胞介素-18和23、S100B蛋白、同型半胱氨酸以及神经肽Y指标水平的恶化,病情程度越严重,预后越差,加强上述指标的检测,可较好评估患者的预后情况。

大鼠心肌组织中microRNA和18S rRNA的降解与死亡时间的相关性

目的探讨大鼠死后心肌组织中microRNA和18S rRNA的含量变化与死亡时间的关系。方法将SD大鼠断颈处死后置于25℃室温、50%湿度的环境中,于死后不同时间提取心肌组织中总RNA。利用实时荧光定量PCR检测大鼠心肌组织中miR-1-2和18S rRNA的含量变化,结果用循环阈值(Ct值)表示,分析死亡时间与Ct值的关系,最终建立死亡时间推断的回归分析方程。结果大鼠死后120h内心肌组织中miR-1-2含量无明显变化,此后开始下降;而18S rRNA含量在96 h内逐渐增多,随后开始缓慢下降。大鼠死后不同时间18S rRNA的Ct值以及18S rRNA和miR-1-2的ΔCt值与PMI呈非线性相关,二次曲线拟合的R2值分别为0.9487、0.8072。结论 18S rRNA的Ct值和18S rRNA与miR-1-2的ΔCt值与PMI之间存在明显非线性关系,可以作为早期死亡时间推断的指标。

米氏凯伦藻18SrDNA和转录间隔区序列分析

对赤潮多发藻米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）核糖体18SrDNA及其转录间隔（ITS）区序列PCR扩增并测序，获得18SrDNA和ITS基因序列长度分别为1690bp和654bp。结合12种甲藻和1种硅藻作序列比较分析，分别在ITS1、ITS2序列寻找到适宜设计特异性引物探针区域，并用邻接法构建系统进化树，研究各藻种间亲缘关系。遗传距离分析结果显示米氏凯伦藻与短凯伦藻（Karena brevis）、微小卡罗藻（Karlodinium micrum）等分类学上较近的藻种18SrDNA序列相似度为97％～99％，远大于微小原甲藻（Prorocentrum minimum）、海洋原甲藻（P．micans）、塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）等在分类学上相距较远的藻种，各藻种间的ITS序列平均相似度明显低于18SrDNA序列。以18SrDNA与ITS序列构建的进化树拓扑结构相一致，18SrDNA序列相对保守，适合进行属以上关系的系统进化分析，而ITS序列变异较大，适合种属间鉴别分析，且ITS1和ITS2是变异很大的区域，适合种间的分子特异性鉴定，这为快速鉴别赤潮多发藻米氏凯伦藻提供了依据，进而为治理赤潮提供帮助。

10株火鸡组织滴虫18S rRNA基因的克隆及进化分析

应用聚合酶链反应(PCR)鉴定湖南娄底(简称HMLD1-3)、湘潭(HMXT1-2)、永州(HMYZ1-3)和宁乡(HMNX1-2)共10株火鸡组织滴虫,并用18SrRNA部分序列重构火鸡组织滴虫与其它相近原虫的种群遗传关系。作者通过PCR扩增火鸡组织滴虫虫株的18S rRNA部分序列,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果表明,来自湖南省的10株火鸡组织滴虫18SrRNA序列长度一致,均为532bp,与GenBankTM公布的火鸡组织滴虫序列相似性在97.5%以上,与其它原虫差异均大于20%。种系发育树分析表明,10个分离株与已知火鸡组织滴虫位于同一分枝。本研究证实该病原为火鸡组织滴虫,从分子生物学水平证明了湖南省存在火鸡组织滴虫。本研究为火鸡组织滴虫病诊断及火鸡组织滴虫种群体遗传学研究奠定了良好基础。

蕨类植物叶绿体rps4基因的适应性进化分析

在原核生物和植物叶绿体中,RPS4(ribosomal protein small subunit4)在核糖体30S小亚基形成起始过程中发挥重要作用;该蛋白在植物中由叶绿体rps4基因编码。为验证蕨类植物在白垩纪适应被子植物兴起而发生分化的观点,本文以23种蕨类植物为研究对象,利用分支模型、位点模型和分支位点模型对其叶绿体rps4基因进化适应性进行分析。分支模型检测到4个可能存在正选择的分支;位点模型和分支位点模型虽然没有检测出正选择位点,但是位点模型检测出了85个负选择位点。通过研究我们仅仅得出a、b两个代表水龙骨类的分支处于正选择压力下,这与水龙骨类在白垩纪发生辐射式演化的理论相一致。同时rps4基因处于强烈的负选择压力这一事实表明该基因的功能与结构已经趋于稳定。

基于NRPS基因筛选与鉴定葡萄附生真菌

以非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)基因为筛选靶点,从葡萄中筛选出含有NRPS基因的附生真菌,以期发现具有抗菌作用的环肽类化合物。采用平板划线技术、斜面分离纯化技术分离葡萄附生真菌,从中筛选出一株含有NRPS基因的附生真菌(编号PTLM-1)。在此基础上,构建系统发育进化树,结合形态学方法,将该菌株鉴定为腐皮镰刀菌Fusarium solani。经过NRPS系统发育进化树分析,发现该菌株有产生抗菌环肽类化合物——环孢菌素的潜力。通过对该菌的发酵产物进行电喷雾质谱分析,进一步证实了该预测结果。该研究为定向筛选产生环肽类化合物的菌株提供了新的研究方法与理论依据。

拟南芥18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径的研究

通过筛选以拟南芥蓝光受体隐花色素双突变体cry1cry2为遗传背景的激活标签突变体库,得到一株SCC98-D株系,该突变体具有早开花,下胚轴变短,并具有花瓣数目增加等表型,彻底恢复了cry1cry2的晚开花和长下胚轴表型.通过Tail-PCR的方法克隆得到SCC98-D突变体中激活标签插入位点的侧翼序列,通过对该侧翼序列测序发现插入位点在18srRNA的1751bp处,运用RT-PCR方法分析插入位点周围基因的表达,发现只有18srRNA的表达被激活,由此证实了18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径.

吸血和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中rpS7转录的影响

目的 观察血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中核糖体蛋白S7(Ribosomalprotein ,rpS7)转录的影响。方法 同批 3～ 5d龄大劣按蚊分为正常组 (N)、吸正常血组 (B)和感染约氏疟原虫组 (I) ,分别在血餐后 1、2、3、7d ,离心法同时收集 3组各 5 0只雌大劣按蚊血细胞总RNA ,所有样品进行RT PCR后 ,各吸取 10ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶图像分析系统扫描并读取数据 ,并对所得数据进行统计学分析。结果 3组大劣按蚊血细胞rpS7mRNA的RT PCR扩增产物量无显著差异 (P >0 0 5 )。结论 类似于人类和小鼠 β actin ,以及冈比亚按蚊rpS7。