蛋白激酶A抑制剂H-89通过调节核糖体蛋白S6激酶1的磷酸化阻断SP600125诱导的CMK细胞多倍体化

目的研究核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)翻译后修饰在巨核细胞倍体化调控方面的作用。方法 c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125和蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89单独或联合处理CMK原始巨核细胞白血病细胞。碘化丙啶(PI)染色,结合流式细胞术检测DNA的相对量,从而进行DNA倍体分析;Western blot法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)下游靶分子S6K1表达和磷酸化修饰(Thr389和Thr421/Ser424)的变化。使用分子对接和激酶活性检测分析H-89与S6K1结合的关系以及对激酶活性的影响。结果 SP600125以时间和剂量依赖的方式诱导CMK细胞多倍体化,同时,上调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和下调Thr389的磷酸化。H-89不但部分阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化,而且下调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和上调Thr389磷酸化。分子对接和激酶活性分析发现H-89通过占据ATP结合位点,抑制S6K1活性。值得注意的是,H-89和SP600125均抑制PKA的活性,而且两者联合进一步抑制了PKA的活性,表明H-89阻断SP600125诱导CMK多倍体化与其对PKA的作用无关,而与S6K1磷酸化修饰状态的改变有关。结论 H-89通过调节S6K1磷酸化阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化。

核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)介导SP600125诱导的巨核细胞白血病细胞系多倍体化依赖于细胞分化程度

目的探讨核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)在不同分化程度巨核细胞白血病细胞系多倍体化中的调控作用。方法采用c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125诱导Dami、Meg-01和HEL细胞多倍体化,使用蛋白激酶A抑制剂H-89阻断SP600125药物作用,流式细胞术分析表型(CD41a、CD42a和CD42b)和DNA倍性,Western blot法检测S6K1相关蛋白的表达及磷酸化修饰位点的变化。结果 SP600125诱导多倍体化和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)磷酸化。然而,SP600125诱导多倍体化的程度不同,对Dami细胞作用最强、HEL细胞次之、Meg-01细胞最弱。而且SP600125上调Dami细胞的S6K1Thr421/Ser424磷酸化并下调Thr389磷酸化,仅上调HEL细胞的Thr389磷酸化,对Meg-01细胞的S6K1无影响。虽然H-89下调SP600125诱导的3种细胞系中4E-BP1磷酸化,但只部分阻断Dami细胞多倍体化及下调S6K1 Thr421/Ser424磷酸化和上调Thr389磷酸化。尽管H-89上调Meg-01细胞和HEL细胞的S6K1 Thr389磷酸化,但其对Thr421/Ser424磷酸化无影响,而且也不能阻断两者的多倍体化。表型分析显示3种细胞系处于不同的分化水平,即Dami细胞最高、HEL细胞次之、Meg-01细胞最低。结论SP600125诱导巨核细胞白血病细胞系的多倍体化依赖于不同分化程度的细胞系内S6K1对SP600125诱导磷酸化修饰的应答。

p70/p85核糖体蛋白S6激酶1重组真核表达载体的构建及其在人乳腺癌MCF-7细胞内功能的初步鉴定

目的:构建p70核糖体蛋白S6激酶1(p70 ribosomal protein S6 kinase 1,p70 S6K1)及p85 S6K1基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,并鉴定其在人乳腺癌MCF-7细胞内的表达及功能。方法:以pRK7-HA-S6K1为模板,采用PCR扩增出目的基因片段p70 S6K1、p85 S6K1,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,采用PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将重组载体转染MCF-7细胞,24 h后采用Western blotting方法检测细胞内p70 S6K1、p85 S6K1蛋白的表达;同时向转染细胞内加入1 mmol/L H2O2处理36 h,观察p70 S6K1、p85 S6K1蛋白对H2O2诱导的细胞死亡的影响。结果:成功扩增得到p70 S6K1、p85 S6K1基因片段并构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,重组载体经PCR、双酶切鉴定均出现p70 S6K1和p85S6K1预期条带,DNA测序结果显示其全长基因阅读框完整、正确。重组载体在MCF-7细胞中高效表达flag-p70 S6K1和flag-p85S6K1,且p85 S6K1能增强H2O2诱导的细胞死亡。结论:成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,均能在MCF-7细胞中高效表达,且p85 S6K1能够增强H2O2诱导的细胞死亡。

S6K1调控的蛋白表达图谱及其对乳腺癌细胞恶性表型的影响

目的:探究核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)所调控的蛋白表达图谱及其对乳腺癌细胞恶性表型的影响。方法:通过cBioPortal和GEPIA数据库分析S6K1基因在乳腺癌组织中的扩增及表达,并评估其表达对乳腺癌患者临床特征的影响;利用小干扰RNA在乳腺癌MCF7细胞中敲降S6K1,通过质谱技术检测S6K1所调控的蛋白表达图谱;采用细胞成球实验探究S6K1表达水平改变对乳腺癌细胞干性的影响;通过细胞迁移实验探究S6K1对乳腺癌细胞迁移能力的影响。结果:S6K1基因在乳腺癌组织中存在高频扩增现象,在浸润性乳腺癌中的扩增率高于非浸润性乳腺癌(P<0.05),且S6K1的高频扩增与患者的不良预后相关(P<0.01);S6K1在乳腺癌组织中的表达水平较癌旁组织高(P<0.01),而S6K1在乳腺癌不同临床分期中表达水平无明显差异(P>0.05)。质谱检测表明敲降S6K1后,乳腺癌MCF7细胞中有251个蛋白表达上调,224个蛋白表达下调;GO通路富集分析表明,差异表达蛋白参与了细胞质翻译、蛋白质稳定、干细胞群体维持、细胞迁移等多个生物学过程相关通路;与对照组相比,成球实验和迁移实验表明敲降S6K1可显著抑制乳腺癌细胞干性表型和迁移能力(P<0.01)。结论:S6K1在乳腺癌细胞中调控多个生物学过程相关蛋白的表达,敲降S6K1明显抑制了乳腺癌细胞的干性和迁移能力,表明S6K1可能成为乳腺癌治疗的新靶点。

翼状胬肉中核糖体S6蛋白磷酸化、细胞周期蛋白D1的表达及意义

目的研究核糖体S6蛋白磷酸化(ribosomal S6 protein phosphorylation,P-S6)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)在翼状胬肉中的表达及相关性,探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)信号通路在翼状胬肉发病机制中的作用。方法收集翼状胬肉组织31例,正常结膜组织17例,利用免疫组织化学和Western blot进行P-S6和CyclinD1的检测及比较。结果 Western blot检测6例翼状胬肉组织中P-S6蛋白/S6蛋白表达(1.196±0.101)显著高于正常结膜组织(0.295±0.056),差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示:翼状胬肉中P-S6、CyclinD1的阳性表达率均为100%(25/25),正常结膜组织中P-S6阳性表达率为18.2%(2/11)、CyclinD1阳性表达率为9.1%(1/11),正常结膜组织与翼状胬肉组织中P-S6与CyclinD1表达差异均有统计学意义(均为P<.05)。翼状胬肉组织中P-S6与CyclinD1的表达呈正相关(r=0.752,P<0.05)。结论 mTORC1信号通路在翼状胬肉发病过程中起重要作用,并可能通过调控CyclinD1的表达来实现。

核糖体蛋白S6激酶β1的分子结构和理化性质分析

核糖体蛋白S6激酶β1(Ribosomal protein S6 kinaseβ1,RPS6KB1)是一个有价值的肝癌诊断和预后标志物,也是一个潜在的基因治疗分子靶点,但其致癌机制和预后价值仍未完全阐明。为了全面认识RPS6KB1,本文使用生物信息学手段,对RPS6KB1蛋白的序列同源性、组织表达、亚细胞定位、理化性质、空间结构及蛋白质相互作用网络进行分析。结果表明人RPS6KB1基因编码525个氨基酸组成的多肽,在进化过程中高度保守,属于PKc_like超家族,是酸性不稳定的亲水蛋白,无信号肽和跨膜区域。该蛋白定位于细胞核的可能性最大,主要二级结构为随机卷曲,存在磷酸化、乙酰化和泛素化位点。与RPS6KB1相互作用的蛋白主要是m TOR信号途径相关蛋白、PI3K信号途径相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白以及调控胰岛素水平相关蛋白。本文结果为进一步研究RPS6KB1的功能及致癌机制提供一定的参考。

胰岛素对血管平滑肌细胞4E结合蛋白1和核糖体蛋白S6激酶磷酸化的刺激作用

目的研究胰岛素对血管平滑肌细胞(VSMC)蛋白质合成翻译过程的两个调节子,4E-结合蛋白1(4E-BP1)和核糖体蛋白S6激酶,磷酸化的调节作用及其生物学意义。方法培养大鼠胸主动脉VSMC。用3H-亮氨酸和3H-TdR掺入法分别测定蛋白质合成和DNA合成;免疫印迹法检测4E-BP1和核糖体蛋白S6激酶的磷酸化。结果与对照相比,100nmol/L胰岛素显著增加了VSMC的3H-亮氨酸和3H-TdR掺入。同样浓度的胰岛素作用于VSMC,可以诱导4E-BP1和核糖体蛋白S6激酶发生磷酸化。二者的磷酸化分别于胰岛素刺激后,30min和10min达高峰。结论胰岛素可以刺激VSMC的4E-BP1和核糖体蛋白S6激酶发生磷酸化,这可能是胰岛素发挥促进VSMC生长作用的机制。

补虚化瘀法对产后抑郁低雌激素大鼠海马核糖体S6激酶和丝裂原活化细胞外调节激酶1的影响

探讨补虚化瘀方药参归仁合剂对产后抑郁大鼠海马神经元内胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)通路的影响,测定P90核糖体S6激酶(RSK1)和丝裂原活化细胞外调节激酶1(MEK1)蛋白表达量。用56只雌性大鼠分为正常组、模型组、参归仁高、中、低剂量组(7、3.6、1.8 g·kg^(-1)·d^(-1))、盐酸舍曲林组(4.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))、苯甲酸雌二醇组(10μg·d^(-1))。除正常组外,其余各组均采用苯甲酸雌二醇和黄体酮造模,模拟产后抑郁状态。使用蛋白质免疫印迹法检测其海马P-RSK1和P-MEK1的蛋白表达量。结果与模型组比较,参归仁中剂量组和舍曲林组在海马组织中P-RSK1蛋白表达水平明显增加(P<0.01);与模型组比较,参归仁中剂量组、舍曲林组和苯甲酸雌二醇组在海马组织中P-MEK1蛋白表达水平明显增加(P<0.01)。证明参归仁合剂可增加海马组织中P-RSK1和P-MEK1蛋白表达量,且参归仁中剂量组效果显著,参归仁合剂可起到抗抑郁作用。

结直肠癌组织中S6K1及4EBP1蛋白的表达及其与临床病理特征的关系

目的:探讨结直肠癌组织中S6蛋白激酶1(protein S6 kinase 1,S6K1)和真核翻译起始因子-4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)的表达情况及其与结直肠癌患者临床病理参数之间的关系。方法:收集济南军区总医院肿瘤科2007年1月至2009年12月收治的有完整临床病理资料、经手术切除的100例结直肠癌组织与40例正常癌旁结直肠黏膜组织、30例淋巴结转移灶组织、15例远处转移灶组织,用免疫组化方法检测上述组织中S6K1和4EBP1蛋白的表达,并分析其与患者临床病理参数之间的关系。结果:S6K1和4EBP1蛋白在正常结直肠黏膜组织中的阳性表达率分别为17.50%(7/40)和22.50%(9/40),而在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为74.00%(74/100)和79.00%(79/100),S6K1和4EBP1蛋白在癌和正常结直肠黏膜组织中的阳性表达率间差异均有统计学意义(P<0.01);在结直肠癌组织中,S6K1蛋白的阳性表达与结直肠癌患者的临床分期(r=0.31,P<0.01)及组织分化程度(r=0.25,P<0.05)显著相关。4EBP1蛋白的阳性表达与结直肠癌患者的临床分期(r=0.27,P<0.01)及组织分化程度(r=0.22,P<0.05)显著相关。S6K1和4EBP1蛋白高表达患者无疾病进展时间(progression free survival,PFS)更短(P<0.05),但S6K1和4EBP1蛋白表达水平对患者的总生存期(overall survival,OS)无影响(P>0.05)。S6K1和4EBP1蛋白两者的阳性表达呈正相关(r=0.25,P<0.05)。结论:S6K1及4EBP1蛋白在结直肠癌形成过程中有互相促进作用,与结直肠癌的发生发展及预后相关,可作为较为理想的分子靶点和预后评估指标。

核糖体蛋白激酶磷酸化程度与人乳头瘤病毒16感染情况的相关性分析

目的:检测人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染的宫颈鳞癌组织中核糖体蛋白激酶S6K和S6的磷酸化水平,探讨HPV16感染在宫颈癌发生发展中的作用。方法:利用PCR方法将收集到的135例人子宫颈鳞癌样本分为HPV16感染阳性组和阴性组,用免疫组织化学方法检测磷酸化S6K(p-S6K)和磷酸化S6(p-S6)蛋白在病例样本中的表达水平。结果:HPV16感染的宫颈癌组织内,核糖体蛋白S6K和S6的磷酸化比率分别为46.5%和68.7%,分别高于未感染的宫颈癌组织(8.33%和30.6%),差异具有统计学意义(P均<0.05)。两种蛋白相关性分析,p-S6K与p-S6蛋白在HPV16型病毒感染的宫颈癌组织中表达呈正相关性(r=0.095,P=0.019)。结论:HPV16病毒的感染与核糖体蛋白激酶S6K和S6的磷酸化(活化)具有强相关性,后两者的活化能促进细胞的生长增殖,在肿瘤的发生发展中起重要作用。

mTOR-siRNA转染人晶状体上皮细胞对PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白p70S6K及4EBP1表达的影响

目的研究m TOR-siRNA转染人晶状体上皮细胞系B3(human lens epithelial line B3,HLEB3)后,对PI3K/AKT/m TOR信号通路蛋白p70S6K及4EBP1表达的影响,并与雷帕霉素的作用作对比。方法 HLEB3分为m TOR-siRNA组(培养基加入Lipo2000和m TOR-siRNA)、control-siRNA组(培养基加入Lipo2000和control-siRNA)、Lipo2000组(培养基加入Lipo2000)、雷帕霉素组(培养基加入雷帕霉素)和空白对照组,于转染24 h、48 h、72 h后观察各组细胞的形态和密度;Western blot法检测各时间点各组细胞p70S6K及4EBP1蛋白的表达情况。结果 m TOR-siRNA组随着转染时间延长,HLEB3细胞分布稀疏、形态不规则,部分细胞贴壁不良。转染24 h、48 h、72 h时,m TOR-siRNA组细胞密度均较其他四组低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。转染24 h后,各组细胞4EBP1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),但与空白对照组相比,m TOR-siRNA组及雷帕霉素组p70S6K蛋白表达均下降(均为P<0.05);转染48 h、72 h后,与空白对照组相比,m TOR-siRNA组及雷帕霉素组4EBP1及P70S6K蛋白表达均下降(均为P<0.05),而control-siRNA组、Lipo2000组4EBP1、P70S6K蛋白表达与空白对照组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论 m TOR-siRNA及雷帕霉素均可影响HLEB3的增殖及生长活性,并抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路蛋白p70S6K和4EBP1的表达,且m TOR-siRNA的早期作用较雷帕霉素强。

mTOR/S6K1信号通路与有氧运动改善小鼠高脂饮食诱导胰岛素抵抗间的关系

目的:探讨有氧运动对胰岛素抵抗小鼠骨骼肌中mTOR/S6K1和PGC-1α的影响,分析其分子生物学机制。方法:C57BL/6小鼠高脂饮食喂养8周以建立胰岛素抵抗模型。后小鼠随机分为安静组(HC)和运动组(HE)。HE组施以6周跑台有氧训练。实验结束后采用OGTT检测葡萄糖耐量,组织学检测胰岛形态变化。ELISA法检测血清空腹胰岛素水平,Northern blot、Western blot和免疫荧光法检测骨骼肌中mTOR、S6K1及其磷酸化蛋白(pS6K1-Thr389)和PGC-1α mRNA和蛋白的表达。结果:与HC组相比,小鼠HE组6周有氧运动后体重、空腹血清胰岛素值和胰岛β细胞团面积百分比均呈显著下降;葡萄糖耐量也得到明显改善;骨骼肌中mTOR、S6K1、pS6K1-Thr389 mRNA和蛋白表达均明显降低,而PGC-1α mRNA和蛋白明显升高。结论:有氧运动明显增加了机体组织对胰岛素的敏感性,推测有氧运动可能通过抑制mTOR/S6K1信号通路,增加胰岛素抵抗小鼠骨骼肌的能量代谢从而改善胰岛素抵抗。

宫颈癌组织中S6K1和S6K2的表达及其临床意义

目的探讨宫颈癌组织中核糖体蛋白S6激酶(S6K)1和S6K2的表达及其临床意义。方法经手术切除的宫颈癌组织94例、正常宫颈组织52例及宫颈上皮内瘤样病变(CIN)组织103例(CINⅠ33例、CINⅡ29例、CINⅢ41例),采用免疫组化法检测以上组织中S6K1和S6K2的表达情况,分析两者表达与宫颈癌临床病理参数的关系(年龄、淋巴结转移、分化程度、FIGO分期、脉管瘤栓、深肌层浸润及宫旁浸润),采用单因素分析和多因素分析影响宫颈癌预后的因素。结果宫颈癌组织中S6K1和S6K2阳性表达率均高于正常宫颈组织和CIN组织(P<0.05);正常宫颈组织和CIN组织中S6K1、S6K2阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。S6K1表达与分化程度和FIGO分期均有关(P<0.05),而S6K2表达与淋巴结转移、分化程度、FIGO分期和深肌层浸润均有关(P<0.05);S6K1、S6K2阳性者的5年生存率均低于阴性表达者(P<0.05)。多因素分析发现,淋巴结转移、分化程度、FIGO分期、宫旁浸润及S6K1和S6K2表达为影响宫颈癌预后的独立因素。结论宫颈癌组织中的S6K1和S6K2为高表达,均与分化程度和FIGO分期有关,且S6K1、S6K2阳性者的预后较差,可作为预测预后的影响因素。

AKt/mTOR信号通路中p70S6K1、4E-BPs在促进肿瘤发生作用中的研究进展

当受细胞外生长因子等刺激作用后,可激活PI3K/AKt/m TOR信号通路,参与控制细胞的生长、增殖、生存、凋亡。AKt/m TOR信号通路在肿瘤的发生发展过程中起着很重要的促进作用。AKt/m TOR信号通路在肿瘤细胞中能够通过p70S6K1和4E-BPs的作用抑制细胞的凋亡,促进核糖体以及蛋白质的合成、促进肿瘤细胞的侵袭和转移、促进细胞周期进展、促进肿瘤血管的生成,进而促进肿瘤的发生发展。本文就AKt/m TOR信号通路通过p70S6K1和4E-BPs促进肿瘤发生的机制进行综述。

食管癌组织中p-4EBP1、p-S6K1表达及意义

目的探讨p-4EBP1和p-S6K1在食管癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组化SP法检测45份食管癌组织及20份正常食管组织中p-4EBP1及p-S6K1表达。结果食管癌组织中p-4EBP1和p-S6K1表达阳性率分别为71.1%和66.7%,正常食管组织中阳性率分别为25.0%和35.0%,P均<0.05;二者在食管癌组织中的表达呈正相关P<0.05(r=0.381)。结论 p-4EBP1和p-S6K1在食管癌发生、发展中起促进作用;二者可作为食管癌诊断、靶向治疗及预后判断的重要生物学标记物。

基于mTOR/S6K1通路探究CXCR3对糖尿病肾病足细胞损伤、凋亡、自噬的影响

目的 探究趋化因子受体(CXCR)3对糖尿病肾病足细胞损伤、凋亡、自噬的影响及其作用机制。方法 将分化成熟的小鼠肾脏足细胞MPC-5分为对照组,模型组,si-NC组和si-CXCR3组,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞24 h、48 h和72 h细胞活力,流式细胞法检测各组细胞凋亡水平,Western印迹检测细胞凋亡关键蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3表达水平,ELISA法检测各组细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8,肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,qPCR及Western印迹检测各组细胞自噬相关蛋白(beclin)1、人自噬相关蛋白(ATG)5及ATG7表达水平,同时检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/蛋白核糖体S6蛋白激酶(mTOR/S6K1)信号通路关键蛋白的蛋白表达水平及其磷酸化修饰水平。结果 与对照组相比,模型组和si-NC组细胞增殖受到显著抑制,并且随着时间增加抑制能力增强,与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞增殖显著提高(P<0.05);与对照组相比,模型组和si-NC组细胞凋亡均显著增加(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞凋亡显著降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组和si-NC组细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α释放显著增加(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α显著降低,但仍高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,模型组和si-NC组细胞自噬相关蛋白Beclin1、ATG5及ATG7表达水平显著降低,而与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组显著升高(P<0.05);与对照组相比,模型组和si-NC组细胞mTOR、S6K1蛋白表达水平显著升高,其磷酸化修饰也相应增加,而与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞mTOR,S6K1蛋白表达水平显著降低,磷酸化修饰也相应降低(P<0.05)。结论 沉默CXCR3可以提高小鼠肾足组细胞活性,降低细胞凋亡,减少炎症因子释放,对肾足细胞具有保护作用,其机制可能通过增强自噬,调控mTOR/S6K1信号通路活性及磷酸化修饰相关。

链脲佐菌素致阿尔茨海默病模型大鼠脑内mTOR/P70S6K/IRS-1信号通路的变化

目的:观察侧脑室(intracerebroventricular,ICV)注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)对大鼠脑内m TOR/P70S6K/IRS-1信号通路的影响。方法:将30只雄性SD大鼠随机分为对照组和模型组,每组各15只,对照组于第1天和第3天ICV注射生理盐水,模型组于第1天和第3天侧脑室注射STZ(ICV-STZ,3 mg/kg)建立AD模型。第1次注射后36 d采用Morris水迷宫检测2组大鼠空间学习和记忆能力的变化;Western blot检测2组大鼠大脑皮质和海马组织哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-m TORSer2448)、核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(P70 ribosomal S6 protein kinase,P70S6K)、磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(phosphorylated P70 ribosomal S6 protein kinase,p-P70S6KThr389)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substract-1,IRS-1)和磷酸化胰岛素受体底物-1(phosphorylated insulin receptor substract-1,p-IRS-1Ser636)蛋白的表达;HE染色观察2组大鼠大脑皮质和海马组织形态学的改变;甲硫素S染色观察2组大鼠脑内Aβ的沉积。结果:Morris水迷宫结果显示ICV-STZ能明显降低大鼠目标象限停留时间[对照组:(55.945±9.447)s,模型组:(31.961±5.346)s,t=8.558,P=0.000]和穿越平台次数[对照组:(7.533±2.560)次,模型组:(2.867±1.506)次,t=6.086,P=0.000];HE染色可见:ICV-STZ大鼠大脑皮质和海马的部分细胞出现了明显的固缩和肿胀;甲硫素S染色发现:在ICV-STZ处理后,大鼠脑内出现Aβ的大量沉积。Western blot结果表明:ICV-STZ能同时增加大鼠大脑皮质p-P70S6KThr389[对照组:(0.268±0.066),模型组:(0.654±0.079),t=-8.409,P=0.000]、p-IRS-1Ser636[对照组:(0.710±0.092),模型组:(1.033±0.135),t=-4.417,P=0.002]和海马p-P70S6KThr389[对照组:(0.405±0.064),模型组:(0.732±0.077),t=-7.339,P=0.000]、p-IRS-1Ser636[对照组:(0.498±0.093),模型组:(0.836±0.102),t=-5.496,P=0.001]蛋白的表达,但不影响大鼠大脑皮质和海马P70S6K、m TOR、p-m TORSer2448、IRS-1蛋白的表达。结论:ICV-STZ能增加大鼠脑内m TOR/P70S6K/IRS-1信号通路的激活,提示异常活化的m TOR/P70S6K/IRS-1信号通路可能参与了AD的发生发展。

p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在胃癌组织中的表达及意义

目的探讨磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、p-4EBP1及p-S6K1蛋白的表达水平与胃癌常见临床病理因素的关系。方法选择2014年3月—2016年6月在包头市肿瘤医院行手术切除的60例胃癌患者为观察组,对照组为癌旁组织(肿瘤边缘5 cm处)胃组织40例。采用免疫组化的方法检测60例胃癌组织及40例癌旁胃组织中p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的表达情况。结果 p-mTOR在观察组和对照组的阳性率分别为36.7%和10.0%,p-4EBP1在观察组和对照组的阳性率分别为80.0%和60.0%,p-S6K1在观察组和对照组的阳性率分别为26.7%和10.0%。p-mTOR、p-4EBP1和pS6K1在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在胃癌组织中过度表达可能是胃癌发生的重要机制之一。

rhGLP-1(7-36)对人肝HL-7702细胞系Akt、P70S6K蛋白的影响

目的观察重组人胰高血糖素样肽-1(7-36)[recombinant human glucagon like peptide-1(7-36),rhGLP-1(7-36)]对人肝HL-7702细胞系蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,P70S6K)表达的影响,探讨其作用机制。方法选用处于对数生长期的人肝HL-7702细胞系,实验组用含100 nM浓度rhGLP-1(7-36)的培养基分别处理0 min、10 min、60 min、90 min;对照组用不含100 nM浓度rhGLP-1(7-36)的培养基分别处理相同的时间。用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)分别检测各组Akt蛋白、P70S6K蛋白的表达水平。结果与对照组相比,实验组10 min、60 min、90 min时Akt蛋白、P70S6K蛋白的表达水平无明显变化;10 min、60 min、90 min时p-AktThr308蛋白、p-AktSer473蛋白及磷酸化P70S6K蛋白表达水平均升高,其中,10 min、60 min时差异无统计学意义(P>0.05),90 min时差异有统计学意义(t=-5.596,P=0.011;t=-5.405,P=0.012;t=-5.597,P=0.011)。结论 rhGLP-1(7-36)促进肝脏细胞中Akt蛋白和P70S6K蛋白的磷酸化与时间有关,该结果为研究GLP-1对肝细胞的直接作用提供依据。

S6K1沉默对宫颈癌细胞侵袭迁移及相关基因表达的影响

目的探讨RNA干扰核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)对人宫颈癌细胞Hela侵袭迁移及相关基因表达的影响。方法根据文献报道及siRNA设计原则合成靶向S6K1基因的siRNA,以阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体转染对数生长期Hela细胞(沉默组),同时设转染不针对任何基因随机序列的阴性对照组和转染试剂的空白对照组。转染48 h后采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测干扰效率,分别于转染24、48、72 h后采用WST法评价靶向沉默S6K1对Hela细胞增殖的影响,采用Transwell小室法检测经S6K1沉默后对Hela细胞侵袭迁移的影响,采用Western印迹法检测S6K1沉默后Hela细胞中人基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1、TIMP-2的蛋白水平。结果以空白对照组为参照(其S6K1 mRNA水平为1.000),阴性对照组的S6K1 mRNA水平为(1.027±0.034),差异无统计学意义(P>0.05),而沉默组的S6K1 mRNA水平(0.158±0.012)低于其余两组(P<0.05),相对于空白对照组的沉默率为(92.4±3.7)%。与空白对照组和阴性对照组比较,沉默组转染后的增殖率降低,迁移实验和侵袭实验中的穿膜细胞数均降低,MMP-2、MMP-9蛋白水平均降低,而TIMP-1、TIMP-2蛋白水平均升高(P<0.05)。结论 RNA靶向沉默S6K1表达可抑制人宫颈癌Hela细胞侵袭迁移,可能与其抑制MMP-2/9表达及促进TIMP-1/2表达有关。