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一株产凝乳酶变色栓菌鉴定及其凝乳酶的分离纯化与酶学性质研究
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作者 黄武营 李云 +1 位作者 朱慧 周飞 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期243-250,I0008,共9页
微生物凝乳酶具有生产周期短和易于发酵生产的优点,是传统小牛皱胃酶的经济高效替代选择之一。为了筛选新的凝乳酶产生菌,该研究以从传统发酵腐乳分离的霉菌为出发菌株,筛选具有高凝乳活性和低蛋白水解活性的霉菌菌株。采用内源转录区... 微生物凝乳酶具有生产周期短和易于发酵生产的优点,是传统小牛皱胃酶的经济高效替代选择之一。为了筛选新的凝乳酶产生菌,该研究以从传统发酵腐乳分离的霉菌为出发菌株,筛选具有高凝乳活性和低蛋白水解活性的霉菌菌株。采用内源转录区间隔区结合线粒体小亚基核糖体DNA扩增测序的方法对菌株进行了分子鉴定。通过硫酸铵分级盐析沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱、Sephadex G100凝胶过滤层析法对酶进行了纯化,并研究了凝乳酶酶学特性。筛选出菌株CQ3具有良好的凝乳活性和低蛋白水解活性,该菌株鉴定为变色栓菌(Trametes versicolor)。CQ3凝乳酶纯化后经SDS-PAGE分析呈现出分子质量为61 kDa的唯一条带。该酶作用的最适温度为45℃,最适pH值为6.5,Ca^(2+)对酶活力有显著的促进作用。该酶在pH值为4.5~7.0和温度低于50℃条件下有良好的稳定性。蛋白酶抑制剂试验表明,该酶为一种天冬氨酸蛋白酶。该研究结果报道了一种新的产凝乳酶菌种资源,为丰富凝乳酶产生菌株资源,进一步评价栓菌凝乳酶在干酪加工适用性的研究提供了理论基础。 展开更多
关键词 凝乳酶 变色栓菌 酶的分离纯化 内源转录间隔区 线粒体小亚核糖体dna
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瓶囊碘泡虫的重描述及其与洪湖碘泡虫分子标记的比较
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作者 张潇艺 丁鹏 +3 位作者 张城豪 孙荣华 杨承忠 柳阳 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期180-190,共11页
为了完善瓶囊碘泡虫的分类学特征及厘清其与洪湖碘泡虫的分类关系,实验采用形态学、组织学和分子生物学方法对瓶囊碘泡虫进行了重描述,并与洪湖碘泡虫的分子标记进行了系统比较。结果显示,瓶囊碘泡虫寄生于异育银鲫的鳃,形成乳白色的圆... 为了完善瓶囊碘泡虫的分类学特征及厘清其与洪湖碘泡虫的分类关系,实验采用形态学、组织学和分子生物学方法对瓶囊碘泡虫进行了重描述,并与洪湖碘泡虫的分子标记进行了系统比较。结果显示,瓶囊碘泡虫寄生于异育银鲫的鳃,形成乳白色的圆形或椭圆形孢囊,直径为1.2~1.4 mm。成熟孢子壳面观呈梨形,前端较尖,后端钝圆,孢子长17.3~19.6μm,孢子宽7.4~9.9μm。两个极囊呈瓶状,大小不等。大极囊长6.4~9.7μm,大极囊宽2.1~3.3μm;小极囊长5.3~8.9μm,小极囊宽2.0~3.3μm。极丝圈数为8~11圈。组织学分析显示,瓶囊碘泡虫寄生于鳃小片间的上皮组织。BLAST分析显示,本研究获得的瓶囊碘泡虫的小亚基核糖体DNA(SSU rDNA)序列与GenBank中瓶囊碘泡虫序列的相似性为99.5%~99.8%(KC425223~KC425225、MH329620、JQ690361、JQ690373、KJ725082、MN227351、DQ339482)。系统发育分析表明,瓶囊碘泡虫与洪湖碘泡虫形成姐妹支。瓶囊碘泡虫与洪湖碘泡虫分子标记序列的比较结果显示,这两种碘泡虫的序列相似性为98.2%~98.8%,遗传距离为0.014~0.018,存在27个碱基差异。SSU rRNA二级结构分析显示,瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫同一物种不同群体间的二级结构一致,两个物种间的二级结构存在明显差异,表明SSU rRNA二级结构可以作为鉴别瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫的分子特征。本研究完善了瓶囊碘泡虫在异育银鲫鳃部的详细寄生部位,提出SSU rRNA二级结构可以作为有效鉴别瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫的分子标记。 展开更多
关键词 粘孢子虫 小亚核糖体dna(SSU rdna) 二级结构 系统发育分析
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IMS-qPCR检测水源性微小隐孢子虫方法的建立 被引量:1
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作者 高姗姗 吴绍强 +4 位作者 罗静 王承民 张敏 赵宝华 何宏轩 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期180-184,共5页
目的将免疫磁珠分离技术(IMS)和荧光探针定量PCR(qPCR)相结合,建立水源性微小隐孢子虫卵囊的检测方法。方法以抗微小隐孢子虫卵囊表面抗原Cp23单克隆抗体包被链霉素磁珠,制备特异免疫磁珠,根据卵囊回收率优化分离和富集卵囊条件。根据... 目的将免疫磁珠分离技术(IMS)和荧光探针定量PCR(qPCR)相结合,建立水源性微小隐孢子虫卵囊的检测方法。方法以抗微小隐孢子虫卵囊表面抗原Cp23单克隆抗体包被链霉素磁珠,制备特异免疫磁珠,根据卵囊回收率优化分离和富集卵囊条件。根据微小隐孢子虫核糖体DNA小亚基(18S rDNA)基因(登录号AB513881.1)序列设计引物和荧光标记探针,以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,将扩增产物克隆至Peasy-T1载体。经筛选鉴定后,将重组质粒倍比稀释至104~108copy/μl,荧光探针定量PCR检测,并绘制标准曲线。用荧光探针定量PCR分别检测微小隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬隐孢子虫和大肠埃希菌基因组DNA,判断该方法的特异性;检测100~108copy/μl重组质粒,判断该方法的敏感性。对采自河北某奶牛养殖场的50份污水样品,分别采用免疫荧光分析法(IFA)和IMS-qPCR检测,并比较分析检测结果。结果磁珠与Cp23单克隆抗体的最佳孵育浓度为20 ng/ml,最佳孵育时间为30 min,最佳捕获时间为30 min,卵囊的回收率>95%。PCR扩增产物长度为272 bp,重组质粒经酶切和测序鉴定正确。荧光探针定量PCR结果显示,重组质粒拷贝数与Ct值之间呈现良好的线性关系,相关系数r2=0.996 1。特异性和敏感性检测结果显示,仅微小隐孢子虫有扩增条带,最低10 copy/μl微小隐孢子虫卵囊18S rDNA重组质粒可被检测到。以IFA检测结果为金标准,50份水样的检测结果显示,IMS-qPCR的特异性为100%(18/18),敏感性为93.8%(30/32)。结论 IMS-qPCR可用于检测水源性微小隐孢子虫卵囊。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 免疫磁珠 荧光探针定量PCR 核糖体dna小亚基
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赤潮研究中圆海链藻实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:11
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作者 何闪英 吴小刚 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期193-198,共6页
为建立快速、准确的鉴定和定量检测赤潮生物的方法,以圆海链藻为例,以其18S rDNA序列为寻找种特异性引物的靶区域,通过分析18S rDNA序列,设计出适合用于RFQ-PCR的引物与探针,并通过引物PCR验证确定其特异性,进而以圆海链藻荧光定量PCR... 为建立快速、准确的鉴定和定量检测赤潮生物的方法,以圆海链藻为例,以其18S rDNA序列为寻找种特异性引物的靶区域,通过分析18S rDNA序列,设计出适合用于RFQ-PCR的引物与探针,并通过引物PCR验证确定其特异性,进而以圆海链藻荧光定量PCR的引物和探针(PrimerThalassiosira rotula和Taqman Thalassiosira rotula),建立了定量检测圆海链藻的实时荧光定量PCR检测方法(RFQ-PCR)。与传统的显微镜计数方法比较,两者所获结果无显著性差异,证明了本方法的可行性,从而为我国沿海水域赤潮问题的研究提供了良好的技术检测途径。 展开更多
关键词 赤潮 圆海链藻 荧光定量PCR 核糖体小亚dna
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Difference in DNA sequences in SSU rDNA variable regions among pathogens isola ted from different epidemic foci of visceral leishmaniasis in China 被引量:1
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作者 胡孝素 卜玲毅 +3 位作者 马莹 王雅静 敬保迁 易桃林 《Chinese Medical Journal》 SCIE CAS CSCD 2002年第10期1457-1459,共3页
OBJECTIVE: To confirm the existence of point mutations in the SSU rDNA variable regions of 5 Leishmania donovani (L.d.) isolates from different epidemic foci in China. METHODS: Specific SSU rDNA fragments from nuclear... OBJECTIVE: To confirm the existence of point mutations in the SSU rDNA variable regions of 5 Leishmania donovani (L.d.) isolates from different epidemic foci in China. METHODS: Specific SSU rDNA fragments from nuclear DNA of 7 Leishmania species/isolates were amplified by PCR and then cloned into pGEM(R)-T Easy Vectors. After that, the specific fragments were sequenced by an automated DNA sequencer. RESULTS: Sequence analysis showed that the amplified DNA fragments of 7 Leishmania species/isolates were all 392 bp in length. All 5 point mutations were located in two unique sequence blocks (UQ-I and UQ-II), and no insertions or deletions were found. The identities of comparison of Leishmania in GeneBank were more than 98%. CONCLUSION: Five point mutations exist in the SSU rDNA variable region of 5 L.d. isolates from different epidemic foci of visceral leishmaniasis (VL) in China. Sequence differences of the SSU rDNA variable region exist among L.d. isolates from different foci. 展开更多
关键词 Point Mutation Animals dna Protozoan dna Ribosomal Humans Leishmania donovani Leishmaniasis Visceral Polymerase Chain Reaction Research Support Non-U.S. Gov't
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Difference in DNA sequences in SSU rDNA variable regions among pathogens isolated from different epidemic foci of visceral leishmaniasis in China
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作者 胡孝素 卜玲毅 +3 位作者 马莹 王雅静 敬保迁 易桃林 《Chinese Medical Journal》 SCIE CAS CSCD 2002年第10期17-19,143,共4页
To confirm the existence of point mutations in the SSU rDNA variable regions of 5 Leishmania donovani (L d ) isolates from different epidemic foci in China Methods Specific SSU rDNA fragments from nuclear DNA of 7... To confirm the existence of point mutations in the SSU rDNA variable regions of 5 Leishmania donovani (L d ) isolates from different epidemic foci in China Methods Specific SSU rDNA fragments from nuclear DNA of 7 Leishmania species/isolates were amplified by PCR and then cloned into pGEM R T Easy Vectors After that, the specific fragments were sequenced by an automated DNA sequencer Results Sequence analysis showed that the amplified DNA fragments of 7 Leishmania species/isolates were all 392 bp in length All 5 point mutations were located in two unique sequence blocks (UQ Ⅰ and UQ Ⅱ), and no insertions or deletions were found The identities of comparison of Leishmania in GeneBank were more than 98% Conclusion Five point mutations exist in the SSU rDNA variable region of 5 L d isolates from different epidemic foci of visceral leishmaniasis (VL) in China Sequence differences of the SSU rDNA variable region exist among L d isolates from different foci 展开更多
关键词 visceral leishmaniasis · Leishmania · point mutation · small subunit ribosomal dna · polymerase chain reaction · cloning · sequence analysis · epidemic foci
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