S6K1调控的蛋白表达图谱及其对乳腺癌细胞恶性表型的影响

目的:探究核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)所调控的蛋白表达图谱及其对乳腺癌细胞恶性表型的影响。方法:通过cBioPortal和GEPIA数据库分析S6K1基因在乳腺癌组织中的扩增及表达,并评估其表达对乳腺癌患者临床特征的影响;利用小干扰RNA在乳腺癌MCF7细胞中敲降S6K1,通过质谱技术检测S6K1所调控的蛋白表达图谱;采用细胞成球实验探究S6K1表达水平改变对乳腺癌细胞干性的影响;通过细胞迁移实验探究S6K1对乳腺癌细胞迁移能力的影响。结果:S6K1基因在乳腺癌组织中存在高频扩增现象,在浸润性乳腺癌中的扩增率高于非浸润性乳腺癌(P<0.05),且S6K1的高频扩增与患者的不良预后相关(P<0.01);S6K1在乳腺癌组织中的表达水平较癌旁组织高(P<0.01),而S6K1在乳腺癌不同临床分期中表达水平无明显差异(P>0.05)。质谱检测表明敲降S6K1后,乳腺癌MCF7细胞中有251个蛋白表达上调,224个蛋白表达下调;GO通路富集分析表明,差异表达蛋白参与了细胞质翻译、蛋白质稳定、干细胞群体维持、细胞迁移等多个生物学过程相关通路;与对照组相比,成球实验和迁移实验表明敲降S6K1可显著抑制乳腺癌细胞干性表型和迁移能力(P<0.01)。结论:S6K1在乳腺癌细胞中调控多个生物学过程相关蛋白的表达,敲降S6K1明显抑制了乳腺癌细胞的干性和迁移能力,表明S6K1可能成为乳腺癌治疗的新靶点。

蛋白激酶A抑制剂H-89通过调节核糖体蛋白S6激酶1的磷酸化阻断SP600125诱导的CMK细胞多倍体化

目的研究核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)翻译后修饰在巨核细胞倍体化调控方面的作用。方法 c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125和蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89单独或联合处理CMK原始巨核细胞白血病细胞。碘化丙啶(PI)染色,结合流式细胞术检测DNA的相对量,从而进行DNA倍体分析;Western blot法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)下游靶分子S6K1表达和磷酸化修饰(Thr389和Thr421/Ser424)的变化。使用分子对接和激酶活性检测分析H-89与S6K1结合的关系以及对激酶活性的影响。结果 SP600125以时间和剂量依赖的方式诱导CMK细胞多倍体化,同时,上调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和下调Thr389的磷酸化。H-89不但部分阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化,而且下调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和上调Thr389磷酸化。分子对接和激酶活性分析发现H-89通过占据ATP结合位点,抑制S6K1活性。值得注意的是,H-89和SP600125均抑制PKA的活性,而且两者联合进一步抑制了PKA的活性,表明H-89阻断SP600125诱导CMK多倍体化与其对PKA的作用无关,而与S6K1磷酸化修饰状态的改变有关。结论 H-89通过调节S6K1磷酸化阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化。

非瑟酮调节LKB1-AMPK-mTOR-p70S6K通路改善大鼠少弱精子症

目的研究非瑟酮对少弱精子大鼠的睾丸及精子保护作用,并探究其机制。方法构建大鼠少弱精子模型,将大鼠随机分为空白组、模型组、非瑟酮低、中、高剂量治疗组、LKB1激动剂组,每组各10只。ELISA法检测各组卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinising hormone,LH)、睾酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)、催乳素(prolactin,PRL)水平;流式细胞术检测精子细胞凋亡;HE染色检测大鼠睾丸组织损伤;透射电镜检测精子细胞超微结构;qRT-PCR和Western blot检测LKB1、AMPK、mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表达。结果与空白组相比,模型组和LKB1激动剂组FSH、LH、PRL、T等激素水平明显降低,精子细胞出现凋亡,睾丸损伤严重,LKB1、p-AMPK/AMPK表达明显上调,mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达下调(P<0.05);与模型组相比,不同剂量的非瑟酮治疗后,精子细胞凋亡数明显减少,FSH、LH、PRL、T等激素水平明显上升,LKB1、p-AMPK/AMPK明显下调,mTOR、p-p70S6K/p70S6K明显上调(P<0.05)。结论非瑟酮可有效治疗少弱精症大鼠,其作用机制可能与LKB1-AMPK-mTOR-p70S6K信号通路有关。

核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)介导SP600125诱导的巨核细胞白血病细胞系多倍体化依赖于细胞分化程度

目的探讨核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)在不同分化程度巨核细胞白血病细胞系多倍体化中的调控作用。方法采用c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125诱导Dami、Meg-01和HEL细胞多倍体化,使用蛋白激酶A抑制剂H-89阻断SP600125药物作用,流式细胞术分析表型(CD41a、CD42a和CD42b)和DNA倍性,Western blot法检测S6K1相关蛋白的表达及磷酸化修饰位点的变化。结果 SP600125诱导多倍体化和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)磷酸化。然而,SP600125诱导多倍体化的程度不同,对Dami细胞作用最强、HEL细胞次之、Meg-01细胞最弱。而且SP600125上调Dami细胞的S6K1Thr421/Ser424磷酸化并下调Thr389磷酸化,仅上调HEL细胞的Thr389磷酸化,对Meg-01细胞的S6K1无影响。虽然H-89下调SP600125诱导的3种细胞系中4E-BP1磷酸化,但只部分阻断Dami细胞多倍体化及下调S6K1 Thr421/Ser424磷酸化和上调Thr389磷酸化。尽管H-89上调Meg-01细胞和HEL细胞的S6K1 Thr389磷酸化,但其对Thr421/Ser424磷酸化无影响,而且也不能阻断两者的多倍体化。表型分析显示3种细胞系处于不同的分化水平,即Dami细胞最高、HEL细胞次之、Meg-01细胞最低。结论SP600125诱导巨核细胞白血病细胞系的多倍体化依赖于不同分化程度的细胞系内S6K1对SP600125诱导磷酸化修饰的应答。

p70/p85核糖体蛋白S6激酶1重组真核表达载体的构建及其在人乳腺癌MCF-7细胞内功能的初步鉴定

目的:构建p70核糖体蛋白S6激酶1(p70 ribosomal protein S6 kinase 1,p70 S6K1)及p85 S6K1基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,并鉴定其在人乳腺癌MCF-7细胞内的表达及功能。方法:以pRK7-HA-S6K1为模板,采用PCR扩增出目的基因片段p70 S6K1、p85 S6K1,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,采用PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将重组载体转染MCF-7细胞,24 h后采用Western blotting方法检测细胞内p70 S6K1、p85 S6K1蛋白的表达;同时向转染细胞内加入1 mmol/L H2O2处理36 h,观察p70 S6K1、p85 S6K1蛋白对H2O2诱导的细胞死亡的影响。结果:成功扩增得到p70 S6K1、p85 S6K1基因片段并构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,重组载体经PCR、双酶切鉴定均出现p70 S6K1和p85S6K1预期条带,DNA测序结果显示其全长基因阅读框完整、正确。重组载体在MCF-7细胞中高效表达flag-p70 S6K1和flag-p85S6K1,且p85 S6K1能增强H2O2诱导的细胞死亡。结论:成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,均能在MCF-7细胞中高效表达,且p85 S6K1能够增强H2O2诱导的细胞死亡。

基于mTOR/S6K1通路探究CXCR3对糖尿病肾病足细胞损伤、凋亡、自噬的影响

目的 探究趋化因子受体(CXCR)3对糖尿病肾病足细胞损伤、凋亡、自噬的影响及其作用机制。方法 将分化成熟的小鼠肾脏足细胞MPC-5分为对照组,模型组,si-NC组和si-CXCR3组,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞24 h、48 h和72 h细胞活力,流式细胞法检测各组细胞凋亡水平,Western印迹检测细胞凋亡关键蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3表达水平,ELISA法检测各组细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8,肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,qPCR及Western印迹检测各组细胞自噬相关蛋白(beclin)1、人自噬相关蛋白(ATG)5及ATG7表达水平,同时检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/蛋白核糖体S6蛋白激酶(mTOR/S6K1)信号通路关键蛋白的蛋白表达水平及其磷酸化修饰水平。结果 与对照组相比,模型组和si-NC组细胞增殖受到显著抑制,并且随着时间增加抑制能力增强,与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞增殖显著提高(P<0.05);与对照组相比,模型组和si-NC组细胞凋亡均显著增加(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞凋亡显著降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组和si-NC组细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α释放显著增加(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α显著降低,但仍高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,模型组和si-NC组细胞自噬相关蛋白Beclin1、ATG5及ATG7表达水平显著降低,而与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组显著升高(P<0.05);与对照组相比,模型组和si-NC组细胞mTOR、S6K1蛋白表达水平显著升高,其磷酸化修饰也相应增加,而与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞mTOR,S6K1蛋白表达水平显著降低,磷酸化修饰也相应降低(P<0.05)。结论 沉默CXCR3可以提高小鼠肾足组细胞活性,降低细胞凋亡,减少炎症因子释放,对肾足细胞具有保护作用,其机制可能通过增强自噬,调控mTOR/S6K1信号通路活性及磷酸化修饰相关。

翼状胬肉中核糖体S6蛋白磷酸化、细胞周期蛋白D1的表达及意义

目的研究核糖体S6蛋白磷酸化(ribosomal S6 protein phosphorylation,P-S6)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)在翼状胬肉中的表达及相关性,探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)信号通路在翼状胬肉发病机制中的作用。方法收集翼状胬肉组织31例,正常结膜组织17例,利用免疫组织化学和Western blot进行P-S6和CyclinD1的检测及比较。结果 Western blot检测6例翼状胬肉组织中P-S6蛋白/S6蛋白表达(1.196±0.101)显著高于正常结膜组织(0.295±0.056),差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示:翼状胬肉中P-S6、CyclinD1的阳性表达率均为100%(25/25),正常结膜组织中P-S6阳性表达率为18.2%(2/11)、CyclinD1阳性表达率为9.1%(1/11),正常结膜组织与翼状胬肉组织中P-S6与CyclinD1表达差异均有统计学意义(均为P<.05)。翼状胬肉组织中P-S6与CyclinD1的表达呈正相关(r=0.752,P<0.05)。结论 mTORC1信号通路在翼状胬肉发病过程中起重要作用,并可能通过调控CyclinD1的表达来实现。

核糖体蛋白激酶磷酸化程度与人乳头瘤病毒16感染情况的相关性分析

目的:检测人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染的宫颈鳞癌组织中核糖体蛋白激酶S6K和S6的磷酸化水平,探讨HPV16感染在宫颈癌发生发展中的作用。方法:利用PCR方法将收集到的135例人子宫颈鳞癌样本分为HPV16感染阳性组和阴性组,用免疫组织化学方法检测磷酸化S6K(p-S6K)和磷酸化S6(p-S6)蛋白在病例样本中的表达水平。结果:HPV16感染的宫颈癌组织内,核糖体蛋白S6K和S6的磷酸化比率分别为46.5%和68.7%,分别高于未感染的宫颈癌组织(8.33%和30.6%),差异具有统计学意义(P均<0.05)。两种蛋白相关性分析,p-S6K与p-S6蛋白在HPV16型病毒感染的宫颈癌组织中表达呈正相关性(r=0.095,P=0.019)。结论:HPV16病毒的感染与核糖体蛋白激酶S6K和S6的磷酸化(活化)具有强相关性,后两者的活化能促进细胞的生长增殖,在肿瘤的发生发展中起重要作用。

核糖体蛋白S6激酶β1的分子结构和理化性质分析

核糖体蛋白S6激酶β1(Ribosomal protein S6 kinaseβ1,RPS6KB1)是一个有价值的肝癌诊断和预后标志物,也是一个潜在的基因治疗分子靶点,但其致癌机制和预后价值仍未完全阐明。为了全面认识RPS6KB1,本文使用生物信息学手段,对RPS6KB1蛋白的序列同源性、组织表达、亚细胞定位、理化性质、空间结构及蛋白质相互作用网络进行分析。结果表明人RPS6KB1基因编码525个氨基酸组成的多肽,在进化过程中高度保守,属于PKc_like超家族,是酸性不稳定的亲水蛋白,无信号肽和跨膜区域。该蛋白定位于细胞核的可能性最大,主要二级结构为随机卷曲,存在磷酸化、乙酰化和泛素化位点。与RPS6KB1相互作用的蛋白主要是m TOR信号途径相关蛋白、PI3K信号途径相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白以及调控胰岛素水平相关蛋白。本文结果为进一步研究RPS6KB1的功能及致癌机制提供一定的参考。

胰岛素对血管平滑肌细胞4E结合蛋白1和核糖体蛋白S6激酶磷酸化的刺激作用

目的研究胰岛素对血管平滑肌细胞(VSMC)蛋白质合成翻译过程的两个调节子,4E-结合蛋白1(4E-BP1)和核糖体蛋白S6激酶,磷酸化的调节作用及其生物学意义。方法培养大鼠胸主动脉VSMC。用3H-亮氨酸和3H-TdR掺入法分别测定蛋白质合成和DNA合成;免疫印迹法检测4E-BP1和核糖体蛋白S6激酶的磷酸化。结果与对照相比,100nmol/L胰岛素显著增加了VSMC的3H-亮氨酸和3H-TdR掺入。同样浓度的胰岛素作用于VSMC,可以诱导4E-BP1和核糖体蛋白S6激酶发生磷酸化。二者的磷酸化分别于胰岛素刺激后,30min和10min达高峰。结论胰岛素可以刺激VSMC的4E-BP1和核糖体蛋白S6激酶发生磷酸化,这可能是胰岛素发挥促进VSMC生长作用的机制。

核糖体蛋白S6激酶1抑制剂对气道上皮干/祖细胞增殖及分化功能的影响

目的研究mTOR信号通路下游元件核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)抑制剂PF-4708671对气道干/祖细胞增殖与分化功能的影响。方法准备10只C57BL/6小鼠,采用流式细胞分选技术将气道干细胞(vClub)和气道祖细胞(Club)从小鼠气道分选出来;采用类器官培养技术分别把vClub细胞、Club细胞和成纤维细胞(M Lg)混合培养。细胞设0、 4、 20、 100nmol/LPF-4708671处理组,培养第8天时显微镜下观察克隆生长情况,统计克隆形成数量;第10天时荧光定量PCR检测S6K1激酶基因R ps6kb1、Club细胞标志物细胞色素氧化酶(Cyp2f)、纤2 毛细胞标志物乙酰化微管蛋白(Ac)和t 叉头框转录因子J1(Foxj),杯1 状细胞标志物氯化物通道钙活化家族成员3(Clca)叉3 头框转录因子a3(Foxa3)的mRNA表达情况。结果不同浓度的PF-4708671对vClub细胞克隆数量无明显影响(P> 0.05),而 4、 20、100nmol/LPF-4708671浓度组Club细胞克隆数量均较0nmol/L组减少(P< 0.05)。不同浓度的PF-4708671对vClub向Club细胞的分化无明显影响,其特征分子Cyp2f2在 mRNA表达水平差异方面无统计学意义。PF-4708671对Club细胞向纤毛细胞和杯状细胞的分化能力均无明显影响,4组间2种细胞的标志物A c、tFoxj1及 Clca3、Foxa3表达水平差异均无统计学意义(P> 0.05)。结论 mTOR/S6K1信号通路对小鼠气道干/祖细胞的增殖功能呈正调控作用,对其分化功能影响甚微。

补虚化瘀法对产后抑郁低雌激素大鼠海马核糖体S6激酶和丝裂原活化细胞外调节激酶1的影响

探讨补虚化瘀方药参归仁合剂对产后抑郁大鼠海马神经元内胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)通路的影响,测定P90核糖体S6激酶(RSK1)和丝裂原活化细胞外调节激酶1(MEK1)蛋白表达量。用56只雌性大鼠分为正常组、模型组、参归仁高、中、低剂量组(7、3.6、1.8 g·kg^(-1)·d^(-1))、盐酸舍曲林组(4.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))、苯甲酸雌二醇组(10μg·d^(-1))。除正常组外,其余各组均采用苯甲酸雌二醇和黄体酮造模,模拟产后抑郁状态。使用蛋白质免疫印迹法检测其海马P-RSK1和P-MEK1的蛋白表达量。结果与模型组比较,参归仁中剂量组和舍曲林组在海马组织中P-RSK1蛋白表达水平明显增加(P<0.01);与模型组比较,参归仁中剂量组、舍曲林组和苯甲酸雌二醇组在海马组织中P-MEK1蛋白表达水平明显增加(P<0.01)。证明参归仁合剂可增加海马组织中P-RSK1和P-MEK1蛋白表达量,且参归仁中剂量组效果显著,参归仁合剂可起到抗抑郁作用。

基于mTOR-p70S6K/4EBP1信号通路探讨淫羊藿苷抑制病毒性心肌炎模型小鼠心肌损伤的实验研究

目的探讨淫羊藿苷对病毒性心肌炎小鼠雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)/真核细胞起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)信号通路的影响。方法健康雄性BALB/c小鼠65只,分为对照组(n=11)和模型组(n=54)。模型组采用柯萨奇病毒B3标准株腹腔接种建立病毒性心肌炎小鼠模型,对照组给予等体积不含病毒的培养液腹腔注射。将造模成功的小鼠随机分为模型组(n=11)、淫羊藿苷低浓度组(n=12)、淫羊藿苷高浓度组(n=12)和卡托普利组(n=11)。模型组与对照组分别予以0.5%羧甲基纤维素钠;淫羊藿苷低、高浓度组分别予以8、16 mg/mL淫羊藿苷混悬液;卡托普利组予以10 mg/mL卡托普利混悬液;各组药物灌胃剂量均为10 mL/kg,每日1次,连续干预60 d。检测比较各组小鼠心脏超声指标,心肌组织病理评分,心肌胶原容积分数(CVF),血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前胶原氨基端原肽(PⅢNP)、转化生长因子β1(TGF-β1)含量,以及心肌组织磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)表达水平。结果干预后,与模型组比较,各组小鼠左室收缩末期内径(LVEDs)、左室舒张末期内径(LVEDd)较低,左室内径缩短率(FS)水平较高,心肌组织病理学评分较低,心肌CVF较低,血清PⅠCP、PⅢNP、TGF-β1含量较低,心肌组织p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1表达水平较低,差异有统计学意义(P<0.05),且淫羊藿苷干预组呈一定量效关系。结论淫羊藿苷能剂量依赖性地改善病毒性心肌炎小鼠心脏收缩舒张功能,减轻心肌组织病理损伤,延缓心肌纤维化,其作用可能与抑制mTOR-p70S6K/4EBP1信号通路活性有关。

miR-381-3p靶向特异性蛋白1抑制mTOR/p70s6k信号通路调控食管癌细胞的增殖和凋亡

目的探讨miR-381-3p靶向特异性蛋白1(SP1)抑制mTOR/p70s6k信号通路对食管癌细胞的增殖和凋亡调控作用。方法RT-qPCR检测正常食管细胞和食管癌细胞中miR-381-3p与SP1mRNA的表达;利用Lipofectamine 2000将miR-381-3p mimic、miR-control、SP1质粒分别或联合转染进入EC9706细胞,基因预测软件预测miR-381-3p的靶基因,双荧光素酶报告检测靶向关系;MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹技术检测Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、p70s6激酶(p70s6k)、p-p70s6k和SP1蛋白表达水平。结果miR-381-3p在食管癌细胞EC9706中低表达(P<0.01),而SP1高表达(P<0.01);miR-381-3p与SP13′UTR区存在结合位点,且miR-381-3p直接靶向抑制SP1表达;过表达miR-381-3p后,食管癌细胞增殖明显降低(P<0.01),Ki67和PCNA蛋白表达明显下调(P<0.01),细胞凋亡率明显降升高(P<0.01),Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达明显上调(P<0.01),mTOR和p70s6k磷酸化明显减少(P<0.01);而高表达SP1可以逆转miR-381-3p对食管癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。抑制mTOR/p70s6k信号通路后,食管癌细胞增殖明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),增殖标记蛋白Ki67表达明显下调(P<0.01),凋亡标记蛋白cleaved caspase-3表达明显上调(P<0.01),而SP1蛋白表达无明显变化。结论miR-381-3p可能通过靶向SP1抑制mTOR/p70s6k信号通路来抑制食管癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡。

结直肠癌组织中S6K1及4EBP1蛋白的表达及其与临床病理特征的关系

目的:探讨结直肠癌组织中S6蛋白激酶1(protein S6 kinase 1,S6K1)和真核翻译起始因子-4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)的表达情况及其与结直肠癌患者临床病理参数之间的关系。方法:收集济南军区总医院肿瘤科2007年1月至2009年12月收治的有完整临床病理资料、经手术切除的100例结直肠癌组织与40例正常癌旁结直肠黏膜组织、30例淋巴结转移灶组织、15例远处转移灶组织,用免疫组化方法检测上述组织中S6K1和4EBP1蛋白的表达,并分析其与患者临床病理参数之间的关系。结果:S6K1和4EBP1蛋白在正常结直肠黏膜组织中的阳性表达率分别为17.50%(7/40)和22.50%(9/40),而在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为74.00%(74/100)和79.00%(79/100),S6K1和4EBP1蛋白在癌和正常结直肠黏膜组织中的阳性表达率间差异均有统计学意义(P<0.01);在结直肠癌组织中,S6K1蛋白的阳性表达与结直肠癌患者的临床分期(r=0.31,P<0.01)及组织分化程度(r=0.25,P<0.05)显著相关。4EBP1蛋白的阳性表达与结直肠癌患者的临床分期(r=0.27,P<0.01)及组织分化程度(r=0.22,P<0.05)显著相关。S6K1和4EBP1蛋白高表达患者无疾病进展时间(progression free survival,PFS)更短(P<0.05),但S6K1和4EBP1蛋白表达水平对患者的总生存期(overall survival,OS)无影响(P>0.05)。S6K1和4EBP1蛋白两者的阳性表达呈正相关(r=0.25,P<0.05)。结论:S6K1及4EBP1蛋白在结直肠癌形成过程中有互相促进作用,与结直肠癌的发生发展及预后相关,可作为较为理想的分子靶点和预后评估指标。

S6K1和4EBP-1蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达及意义

目的探讨S6K1和4EBP-1蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达及意义。方法使用免疫印迹法(Western-blot)检测S6K1和4EBP-1蛋白在80例膀胱尿路上皮癌及20例正常膀胱黏膜中的表达。结果膀胱尿路上皮癌中S6K1蛋白表达率(64%)高于正常膀胱黏膜(10%),4EBP-1蛋白表达率(71%)高于正常膀胱黏膜(15%)。S6K1和4EBP-1蛋白在低分级膀胱癌中的表达率显著高于高分级膀胱癌中的表达率。复发肿瘤的S6K1和4EBP-1蛋白表达率高于初发肿瘤。而S6K1和4EBP-1蛋白表达率在不同性别患者、不同肿瘤分期和是否吸烟患者中差异无统计学意义。结论膀胱尿路上皮癌中S6K1和4EBP-1蛋白与膀胱癌的分级和复发相关,可能成为肿瘤诊断治疗的新靶点。

mTOR-siRNA转染人晶状体上皮细胞对PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白p70S6K及4EBP1表达的影响

目的研究m TOR-siRNA转染人晶状体上皮细胞系B3(human lens epithelial line B3,HLEB3)后,对PI3K/AKT/m TOR信号通路蛋白p70S6K及4EBP1表达的影响,并与雷帕霉素的作用作对比。方法 HLEB3分为m TOR-siRNA组(培养基加入Lipo2000和m TOR-siRNA)、control-siRNA组(培养基加入Lipo2000和control-siRNA)、Lipo2000组(培养基加入Lipo2000)、雷帕霉素组(培养基加入雷帕霉素)和空白对照组,于转染24 h、48 h、72 h后观察各组细胞的形态和密度;Western blot法检测各时间点各组细胞p70S6K及4EBP1蛋白的表达情况。结果 m TOR-siRNA组随着转染时间延长,HLEB3细胞分布稀疏、形态不规则,部分细胞贴壁不良。转染24 h、48 h、72 h时,m TOR-siRNA组细胞密度均较其他四组低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。转染24 h后,各组细胞4EBP1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),但与空白对照组相比,m TOR-siRNA组及雷帕霉素组p70S6K蛋白表达均下降(均为P<0.05);转染48 h、72 h后,与空白对照组相比,m TOR-siRNA组及雷帕霉素组4EBP1及P70S6K蛋白表达均下降(均为P<0.05),而control-siRNA组、Lipo2000组4EBP1、P70S6K蛋白表达与空白对照组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论 m TOR-siRNA及雷帕霉素均可影响HLEB3的增殖及生长活性,并抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路蛋白p70S6K和4EBP1的表达,且m TOR-siRNA的早期作用较雷帕霉素强。

人参皂苷Rb1抗小鼠脑自然衰老及其对mTOR/p70S6K通路的影响

【目的】观察人参皂苷Rb1对小鼠脑组织自然衰老的作用,并探讨mTOR/p70S6K通路在其中的作用。【方法】27只C57/B6雌性小鼠购于中山大学实验动物中心,其中7只3月龄C57/B6雌性小鼠为青年组,20只22月龄C57/B6雌性小鼠为老年组,青年组小鼠予生理盐水(PBS)腹腔注射,老年组小鼠分别予PBS(对照)、低剂量Rb1(10 mg·kg-1·d-1)、高剂量Rb1(20 mg·kg-1·d-1)腹腔注射。6周后处死小鼠,取脑组织匀浆,检测丙二醛(MDA)含量、单胺氧化酶(MAO)活性,western blot技术检测血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、p-m TOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K蛋白表达情况。【结果】与青年小鼠比较,老年对照组小鼠脑组织中的MDA含量增多,MAO活性增加,PAI-1蛋白表达增多,m TOR蛋白、p70S6K蛋白磷酸化水平增加。与老年对照组比较,注射Rb1的两组小鼠脑组织MAO活性,m TOR蛋白、p70S6K蛋白磷酸化水平均降低;此外,高剂量Rb1组MDA含量、PAI-1蛋白的表达降低。【结论】高剂量(20 mg·kg-1·d-1)人参皂苷Rb1可以减轻小鼠脑自然衰老;人参皂苷Rb1的这一抗衰老作用可能与m TOR/p70S6K通路密切相关。

mTOR/S6K1信号通路与有氧运动改善小鼠高脂饮食诱导胰岛素抵抗间的关系

目的:探讨有氧运动对胰岛素抵抗小鼠骨骼肌中mTOR/S6K1和PGC-1α的影响,分析其分子生物学机制。方法:C57BL/6小鼠高脂饮食喂养8周以建立胰岛素抵抗模型。后小鼠随机分为安静组(HC)和运动组(HE)。HE组施以6周跑台有氧训练。实验结束后采用OGTT检测葡萄糖耐量,组织学检测胰岛形态变化。ELISA法检测血清空腹胰岛素水平,Northern blot、Western blot和免疫荧光法检测骨骼肌中mTOR、S6K1及其磷酸化蛋白(pS6K1-Thr389)和PGC-1α mRNA和蛋白的表达。结果:与HC组相比,小鼠HE组6周有氧运动后体重、空腹血清胰岛素值和胰岛β细胞团面积百分比均呈显著下降;葡萄糖耐量也得到明显改善;骨骼肌中mTOR、S6K1、pS6K1-Thr389 mRNA和蛋白表达均明显降低,而PGC-1α mRNA和蛋白明显升高。结论:有氧运动明显增加了机体组织对胰岛素的敏感性,推测有氧运动可能通过抑制mTOR/S6K1信号通路,增加胰岛素抵抗小鼠骨骼肌的能量代谢从而改善胰岛素抵抗。

七氟烷通过P^(70S6K)/Nrf2信号通路诱导神经元HO-1mRNA表达

目的探讨七氟烷(Sevoflurane)诱导神经元血红素氧合酶-1(HO-1)基因表达的信号转导通路。方法将培养7d的新生大鼠海马神经元随机分为4组:正常培养组(C组)、2%七氟烷组(S1组)、4%七氟烷组(S2组)和4%七氟烷+Rapamycin组(R组)。C组神经元按正常培养方法培养。S1组和S2组神经元分别给予2%或4%七氟烷处理60min后继续培养24h。R组在神经元给予4%七氟烷处理同时在培养液中加入Rapamycin使其终浓度为10nmol.L-1后同S2组处理。收集神经元进行HO-1mRNA和P70S6K、Nrf2、AP-1和HO-1蛋白表达的检测。结果S1组P70S6K和Nrf2蛋白表达增加(vsC组,P<0.01),HO-1mRNA和HO-1蛋白表达增加(vsC组,P<0.01),AP-1蛋白表达变化不明显(vsC组,P>0.05)。S2组P70S6K和Nrf2蛋白表达增加(vsS1组,P<0.05),HO-1mRNA和HO-1蛋白表达增加(vsS1组,P<0.05),AP-1蛋白表达变化不明显(vsS1组,P>0.05)。R组P70S6K和Nrf2蛋白表达减少(vsS2组,P<0.01),HO-1mRNA和HO-1蛋白表达减少(vsS2组,P<0.01),AP-1蛋白表达变化不明显(vsS2组,P>0.05)。结论Sevoflurane通过P70S6K/Nrf2信号通路诱导神经元HO-1mRNA表达。