肥皂草素类核糖核蛋白体失活蛋白的纯化及其性质研究

利用强阳离子交换柱从Saponaria officinalis L种子中分离出一种肥皂草素(Saporin)成分。它在无细胞体系中显示了较强的抑制蛋白合成的活性,与抗体连接后能特异性杀伤靶细胞。

文昌鱼核糖核蛋白体结构与功能的研究——Ⅰ. 文昌鱼tRNA和5SRNA的制备

本文报导了从厦门白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri Gray)中制备tRNA和5S RNA的方法。将文昌鱼洗净,用搅碎机破碎,然后用苯酚法提取小分子RNA。RNA粗制品经DEAE—纤维素DE22、DEAE—Sephadcx A—50和Sephadex G—100柱层析分离纯化,分别得到tRNA和5S RMA。再用12%聚丙烯酰胺疑胶电泳进一步纯化。测定了tRNA接受甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸的活力分别为6.3%、5.2%和21%—25%。 tRNA的主要生物功能是携带与转移氨基酸参与蛋白质生物合成,并对基因表达进行调节控制。5S RNA是核糖核蛋白体的一个组分,在蛋白质生物合成中具有重要的功能,也是研究生物进化比较理想的一种生物大分子。自Hoagland等(1957)发现tRNA及Tissieres等(1959)发现核糖核蛋白体RNA后,科学工作者便广泛地开展了对tRNA和5SRNA结构与功能的研究。 文昌鱼是一种处于脊椎动物与无脊椎动物之间过渡类型的脊索动物,属脊索动物门的头索亚门,最接近脊椎动物亚门。因此对它进行深入的生化研究,在探索生物进化方面有较大的学术意义。本文报告从文昌鱼中制备tRNA和5SRNA以及tRNA接受氨基酸活力的初步结果。

基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白体DNA定点内切酶体外活性建立高效基因型分析技术

建立快速、准确、高通量与简便易行的基因型分析技术对基因功能解析、分子育种与突变体鉴定研究具有重要价值。本研究的目标是利用Cas9或Cas9NG变体与单分子指导RNA(single guide RNA,sgRNA)核糖核蛋白复合体(sgRNA/Cas9-RNP或sgRNA/Cas9NG-RNP)体外DNA定点内切酶活性,建立与优化简便高效与低成本的基因型分析技术。以我们前期创制的CRISPR/Cas9定点编辑玉米ZmWx基因第7外显子区域定点突变基因编辑后代分离群体为材料,以ZmWx靶位点两侧特异引物扩增的PCR产物为底物,利用原核表达并纯化的Cas9或Cas9-NG蛋白为DNA内切酶,以体外转录的靶向ZmWx基因靶点的sgRNA或骨架序列优化的sgRNA(enhancedsgRNA,esgRNA)为Cas9或Cas9-NG酶定点活性指导元件,通过体外组装为sgRNA/Cas9-RNP复合体,对目标样本迚行酶切,以区分目标位点野生型、纯合突变体、杂合突变体基因型,并对反应体系迚行了优化。研究表明,基于esgRNA/Cas9的PCR/RNP检测技术可对ZmWx基因编辑目标突变体后代迚行快速有效的基因型鉴定;实验体系优化结果表明,esgRNA/Cas9蛋白质量比为1∶1,各为1?g,20?L反应体系,37℃酶切0.5h,可对500ng待测DNA底物充分酶切并确定基因型;esgRNA/Cas9NG反应体系优化结果表明,当esgRNA与Cas9-NG蛋白均为2μg时,37℃酶切4 h,可对500 ng DNA底物迚行酶切并实现基因型分析。利用Cas9NG拓宽靶位点检测范围的研究结果,暗示Cas9NG是以牺牲核酸酶酶切活性为代价降低了Cas9蛋白对PAM(protospacer adjacent motif,PAM)基序NGG序列的依赖性,实现PAM-NG基序识别能力,sgRNA/Cas9NG检测效率等仍有待提升与优化。本研究为基因功能解析、分子育种与突变体鉴定等研究提供了一套简便、成本低廉的技术方法,Cas9NG体外内切酶活性及其效率也为该Cas9突变体活体基因编辑技术研収提供了参考数据。

肿瘤患者淋巴细胞脱氧核糖核酸核蛋白体转录活性分析

目的探讨肿瘤患者外周血淋巴细胞脱氧核糖核酸核蛋白体（rDNA）转录活性的变化对肿瘤治疗结果判定和监测的临床意义。方法利用CIAS－1000型细胞图像分析系统及相关的细胞培养、银染等技术，分析了20例健康人、291例肿瘤患者的外周血淋巴细胞rDNA转录活性，结果以细胞核核仁积分面积／细胞核积分面积（1．5％）；细胞核核仁积分光密度／细胞核积分光密度（I．O．D％）来表达。结果恶性肿瘤患者的rDNA转录活性明显降低，与健康人比较，差异有显著意义（P＜0.01），除食道癌和消化系统癌外，其他各系统肿瘤术后I．S％和1．O．D％比值明显回升（P＜0．05），虽然食道癌和消化系统肿瘤术后I．S％和I．O．D比值回升不明显，但是也显示了上升的趋势。结论恶性肿瘤患者外周血rDNA转录活性分析可以做为肿瘤治疗疗效结果的判定和肿瘤预后的监测指标。

恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞脱氧核糖核酸核蛋白体转录活性的分析

目的探讨肿瘤患者外周血淋巴细胞脱氧核糖核酸核蛋白体 (rDNA)转录活性的变化对肿瘤诊断及监测的临床意义。方法利用CLAS 10 0 0型细胞图像分析系统及相关的细胞培养、银染等技术 ,分析了 2 0例健康人和 177例恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞rDNA转录活性 ,结果以细胞核仁积分面积 /细胞核积分面积 (I S % )、细胞核仁积分光密度 /细胞核积分光密度 (L O D % )来表示。结果恶性肿瘤患者的rDNA转录活性明显降低 ,与健康人比较 ,差异有显著意义 (P <0 0 1)。结论外周血rDNA转录活性分析对恶性肿瘤的诊断及鉴别诊断有一定的参考价值 。

两种核糖体失活蛋白的活性中心几何构型和反应机理的结晶学研究

在自然界有一大类蛋白质,它们可以催化性地破坏真核细胞的核糖体,从而阻止细胞的蛋白质合成,这些蛋白质叫做核糖体失活蛋白(简称RIPs)。大多数核糖体失活蛋白是由单一肽链所组成的蛋白质,它们的分子量一般在30000D左右,等电点强烈偏碱(等电点值一般在9—10之间)。按Stirpe和Barbieri综述中的定义,它们属于类型Ⅰ的核糖体失活蛋白。这一类核糖体失活蛋白一般很稳定,抗变性和抗降解的能力强。

核糖体RNA拓扑学与RNAN－糖苷酶研究进展（上）

核糖体ＲＮＡ拓扑学的研究对阐明核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）在蛋白质生物合成中的作用具有重要的意义。ＲＮＡＮ－糖苷０酶是一类核糖体失活蛋白．它只水解ｒＲＮＡ特定位置上一个腺苷酸的糖苷键，释放一个腺嘌呤碱基，使核糖体失活。ＲｉｃｉｎＡ链是研究得最早和最详细的ＲＮＡＮ－糖苷酶，迄今已发现有二十五种核糖体失活蛋白具有ＲＮＡＮ－糖苷酶活性。ＲＮＡＮ－糖苷酶作用于２８ＳｒＲＮＡ的α－ｓａｒｃｉｎ结构域，改变核糖体的构象而使其失活。

核糖体的结构与功能研究进展

核糖体的结构与功能研究进展吴晓华，刘望夷（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）关键词核糖体蛋白质生物合成是有两百多种大分子参与的、把遗传信息“翻译”成有各种生物功能蛋白质的复杂过程。因为所有生物体的蛋白质合成都是在核糖体上完成的，所以了解...

家蚕微粒子5S核糖体RNA的一级二级结构

真核生物的核糖体沉降系数为80S,每个核糖体由60S 和40S 两个亚基组成。而原核生物的核糖体沉降系数为70S,它由50S和30S 两个亚基组成。除微孢子虫目外,所有生物都如此。微孢子虫目是带有原核生物70S 核糖体的真核生物。这在家蚕的寄生性原生动物家蚕微粒子虫中,首先得到证实(lshihara 和 Hayashi,1988)。Curgy

SpCas9蛋白的高效可溶表达及应用

规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)主要元件Cas9蛋白一般采用大肠杆菌表达,但在表达纯化过程中易出现形成包涵体形式的不溶解性蛋白,内毒素含量高、蛋白过大导致蛋白折叠不正确、产量低等问题。为实现化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白(SpCas9)在大肠杆菌中的高效可溶表达,进一步促进其应用及编辑技术的推广,本研究应用GB1促溶标签提高Cas9蛋白表达量及溶解度,同时通过使用多重启动子策略进一步提高了Cas9蛋白表达量。两种策略的组合使Cas9蛋白表达量提升了2.52倍。体外酶切分析显示融合GB1标签的Cas9蛋白功能活性不受影响。进一步组装RNP复合物转化黑曲霉宿主成功破坏了pyrG基因。

核仁蛋白B23的研究进展

B23蛋白是真核细胞核仁的主要蛋白组份之一,对于维持核仁的结构和功能都起着重要作用。B23蛋白在真核生物中广泛存在,其一级结构在人、大鼠、小鸡、非洲爪蟾等真核生物中高度保守。B23蛋白不仅存在于体细胞,也存在于生殖细胞。B23蛋白在核糖体前体的加工、装配和运输过程中起着重要作用。另外许多证据也表明,B23蛋白与细胞生长的调节有关。

不同CRISPR-Cas12f系统的编辑效率比较

来自Type V-F家族的CRISPR/Cas12f蛋白报道仅为Cas9蛋白分子的1/4到1/3大小,在病毒载体的递送上具有重要优势。然而,CRISPR/Cas12f系统介导植物基因编辑的报道较少,编辑活性相对较低,限制了该系统在植物上的进一步应用。本研究分别在体外酶切、酵母以及玉米原生质体瞬时表达3个体系中比较了OsCas12f、SpCas12f及UnCas12f的编辑活性。结果表明,基于Cas12f/sgRNA的体外酶切,OsCas12f与SpCas12f蛋白的编辑活性相当,未检测到UnCas12f对底物酶切活性;在酵母突变eGFP的恢复表达试验中,OsCas12f在2个测试位点对eGFP蛋白的表达恢复效率达到95%以上,效率与Cas12i.3相当;SpCas12f介导的2个位点eGFP蛋白表达恢复效率分别是1.63%与3.20%,效果次之;UnCas12f蛋白几乎无编辑活性;玉米原生质体瞬时表达比较OsCas12f和SpCas12f介导的玉米内源位点的编辑效率,发现OsCas12f对2个位点的编辑效率分别为2.72%和1.97%,而SpCas12f仅能介导其中1个位点的定点编辑,编辑效率为1.09%。Cas12f蛋白在靶位点处引入的突变类型以碱基的缺失为主,缺失碱基长度在-9~-17 bp之间。综上,OsCas12f可以作为植物微型基因编辑器及衍生技术开发的底盘工具酶。

甲型流感病毒vRNP及PB1、PB2、PA和NP蛋白的核内转运机制研究进展

与许多在细胞浆内复制的RNA病毒不同,流感病毒的复制及转录都在细胞核内进行。流感病毒感染细胞进入细胞浆后,经病毒脱壳将病毒核糖核蛋白体复合物(v RNP)释放到细胞浆。v RNP含有病毒的RNA基因和碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)及核蛋白(NP)。v RNP被主动运送到细胞核内,开始病毒基因组的复制和转录。流感病毒感染细胞的晚期,在细胞浆中新合成的PB1、PB2、PA及NP蛋白也需要进入细胞核,参与新的v RNP的装配。我们简要介绍有关流感病毒v RNP和新合成的PB1、PB2、PA及NP蛋白进入细胞核的机制。

肾移植受者外周血T淋巴细胞核蛋白体脱氧核糖核酸转录活性的研究

目的 动态监测T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白表达活性 (Ag NORs)对肾移植受者术前及术后用药的应用价值。方法 应用T淋巴细胞银染技术对 32例肾移植受者术前及术后使用免疫抑制剂 1、2、3周后外周血T淋巴细胞进行染色 ,通过计算机显微图像分析技术 ,计算硝酸银染色酸性非组蛋白表达活性 (Ag NORs)、核仁银染面积与核面积的比值 (I .S% )。结果 肾移植患者术前Ag NORs的I.S %为 (6 .31± 0 .86) % ;术后使用免疫抑制剂 1、2、3周Ag NORs的I.S%分别为 (4.72± 0 .93) %、(4.2 8± 1 .0 5) %、(4.66± 1 .2 1 ) %。肾移植术后各期与术前Ag NORs的I.S %比较 ,差异有非常显著性 (P <0 .0 1 ) ;术后各期之间Ag NORs的I.S%比较 ,差异无显著性(P >0 .0 5)。

线粒体和叶绿体是共生起源的吗?

进化论告诉我们:生物世界虽然纷繁庞杂、种类繁多,可是追根究蒂,它们都源出于共同祖先,有着内在的同一性。按照不同物种血缘关系排列的进化树表明,生物之间既是连续的,又是间断的。这种连续和间断,大致上反映了生物演化的历程。其实千百万个不同的物种,正代表了历史长河中千百万个不同的间断。但是学者们一致认为:其中尤以原核细胞和真核细胞间的间断才是最大的间断。

应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统核糖核蛋白复合物技术基因修正威尔森氏症的体外研究

目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA(crRNA)-crRNA001/002/003,应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞,48 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出效率最高者crRNA001,并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板;用crRNA001和ssODN共转染肝细胞,模板特异性引物行PCR,验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。结果Sanger测序结果显示,crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后,模板特异性引物行PCR,能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带;二代测序结果显示,ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率,相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因,为进一步的体内实验提供理论和实验基础。

RNA具有合成蛋白质的功能——生命起源说获得新证据

自发现RNA具有酶的作用以来,学术界就把它看作维系生命现象的初始物质。美国加利福尼亚大学圣克鲁斯学院的哈里·纳拉教授主持的一个科研组又发现了RNA具有合成蛋白质的功能,从而进一步有力证实了RNA为生命起源的论点。

核糖体RNA具有蛋白质合成的酶活性

核糖体是合成蛋白质的机器,它由大小两个亚基组成,其主要成份是 RNA(即 rRNA)和蛋白质。在过去的30多年里,对于核糖体结构、成份及其在蛋白质合成中可能起到的作用已做了相当深入的研究,然而对于蛋白质合成中的最关键的一步--即肽键形成的机制却一直不清楚。传统的观念认为酶的本质是蛋白质,即只有蛋白质才有催化功能,所以长期以来人们也自然地认定核糖体中具有催化作用的是某一种或几种蛋白质组分,而 rRNA 主要起一种支架作用。

核糖体失活蛋白对核糖体拓扑结构的影响

辛纳毒蛋白和克木毒蛋白是本实验室纯化的2种新RIP,它们的作用位点是大鼠肝核糖体285rRNA的A4324.足迹分析表明除 A4324位外,其上、下文的鸟苷酸、腺苷酸也是辛纳毒蛋白和克木毒蛋白的识别位点.辛纳毒蛋白或克木毒蛋白修饰大鼠肝核糖体后,其rRNA的拓扑结构发生了变化,rRNA茎环结构中的双链区相对增多,核糖体的整体拓扑结构也随之变化,80 S核糖体减少,60 S和 40 S亚基增多.以上结果表明“S/R结构域”修饰后所引发的rRNA及核糖体拓扑结构的变化是RIP抑制蛋白质合成的重要机理之一.

核糖体被RNA N-糖苷酶失活以后的活力恢复

核糖体失活蛋白(RIP)是一类专一作用于核糖体RNA(rRNA)而抑制蛋白质生物合成的核毒素(Ribotoxin),其作用机理可分为核酸水解酶(如α-sarcin)及RNA N-糖苷酶两种类型(如Ricin A-链)。在大鼠肝核糖体28S RNA的4786个核苷酸中,RNA